Generation av ESC-derived mus epitelceller i luftvägarna med hjälp decellulariserade Lung Ställningar
Summary
Detta protokoll styr effektivt mus embryonala stamceller härrörande slutgiltig endoderm till mogna luftvägsepitelceller. Denna differentiering teknik använder tre-dimensionell decellulariserade lung ställningar för att styra lung härstamning specifikation, i ett definierat, serumfritt odlings inställning.
Abstract
Lung härstamning differentiering kräver integration av komplexa miljö signaler som innehåller tillväxtfaktorsignalering, cell-cell interaktioner och cell-matrix-interaktioner. På grund av denna komplexitet, till rekapitulation av lungutveckling in vitro befrämja differentiering av stamceller till lungepitelceller har varit en utmaning. I detta protokoll är decellulariserade lung byggnadsställningar som används för att efterlikna den 3-dimensionella miljön i lungan och generera stamcellshärledda luftvägsepitelceller. Mus embryonala stamceller först differentieras till endoderm härstamning med hjälp av en embryoid kropp (EB) odlingsmetod med aktivin A. endoderm celler därefter ympas på decellulariserade byggnadsställningar och odlades vid luft-vätske-gränssnitt för upp till 21 dagar. Denna teknik främjar differentiering av ympade celler till funktionell epitelceller i luftvägarna (cilie celler, klubb celler och basalceller) utan ytterligare tillväxtfaktor tillskott. Denna kultur inställning definieras, Serum-fri, billig och reproducerbar. Även om det finns begränsad förorening från icke-lung endoderm linjer i kultur, detta protokoll genererar endast epitelceller i luftvägarna populationer och inte ger upphov till alveolära epitelceller. Luftvägsepitel som genereras med detta protokoll kan användas för att studera cell-matrix interaktioner vid lung organogenesen och sjukdom modellering eller läkemedelsupptäckts plattformar luftvägsrelaterade sjukdomar såsom cystisk fibros.
Introduction
Riktad differentiering av pluripotenta celler till lung härstamning är beroende av exakta signaleringshändelser i mikro 1,2. På grund av den dynamiska karaktären av denna process har det varit en utmaning att efterlikna de exakta händelserna lung organogenes in vitro. Nya rapporter har använt stegvis härstamning begränsande strategi med löslig tillväxtfaktor tillskott av tvådimensionella kulturer för att uppnå lungdifferentiering 3-8. I stegvisa differentieringsprotokoll, pluripotenta celler, om embryonala stamceller (ESC) eller inducerade pluripotenta stamceller, först differentieras till den slutgiltiga endoderm GRODDBLAD. Endodermala celler därefter skjuts till en främre endoderm öde och därefter till lung progenitorceller, som identifierats av uttrycket av homeodomänen innehållande transkriptionsfaktor NKX2-1. Dessa lung progenitorceller var ytterligare differentieras till proximal (luftvägarna) eller distala (alveolära) lungepitelceller with fortsatt tillväxtfaktor tillskott. Sådana två-dimensionella strategier har haft viss framgång i att skapa lung epitelceller, men det finns flera begränsningar, inklusive oklara effektivitet, eventuella föroreningar från andra endodermala linjer, avsaknaden av en 3-dimensionell (3D) struktur, och i vissa fall användning av odefinierade kulturer med serum supplementation. Kultur av pluripotenta eller differentierade celler på decellulariserade lung byggnadsställningar används alltmer som en analys för att bedöma regenerativ potentialen hos sådda celler i forma lung epiteliala strukturer 3,5,6,8,9. Sådana rapporter kultur seedade celler på ställningar med fortsatt tillväxtfaktor eller serum tillskott.
Lungutveckling involverar division, migration, genuttryck och differentiering av enskilda celler som svar på miljömässiga signaler. Den extracellulär matrix (ECM) är en gallerverk av glykoproteiner som förutom att ge strukturellt stöd, riktar tissue morfogenes genom att integrera och reglera dessa processer 10,11. Med hjälp av lung ECM ställningen som en naturlig plattform för endoderm kultur för att bättre efterlikna lungan utvecklings milieu in vivo, har vi genererat-stamcellshärledda epitelceller i luftvägarna i en definierad 3D-kultur inställning med hög effektivitet och reproducerbarhet.
Råttlunga ECM ställningar genererades av decellularisering samt mus ESC-härledda endodermala celler genererades och därefter ympas på dessa ställningar. Dubbel expression av CXCR4 och c-kit-proteiner indikerar en slutgiltig endoderm cellidentiteten och celler positivt för både Sox2 & NKX2-1 uttryck identifieras som luftvägarna (proximal lung) progenitorceller. Slutgiltiga endoderm celler odlades vid luftvätskegränssnittet (ALI) för upp till tre veckor för att generera funktionella luftvägsepitelceller in vitro.
Detta protokoll gynnar lung härstamning differentiering av definitiva endoderm så tidigt som 7 dagar, observerades med uppkomsten av NKX2-1 + / Sox2 + tidiga proximala lung stamceller. Vid dag 14 och 21 av kultur mogna luftvägarna epitelceller cellpopulationer framträder inklusive cilie (TUBB4A +), klubb (SCGB1A1 +), och basala (TRP63 +, KRT5 +) celler med morfologiska och funktionella likheter med infödda mus luftvägar. Detta protokoll visar betydelsen av 3D-matrismikro för att uppnå robust differentiering till epitelceller i luftvägarna.
Protocol
Representative Results
Discussion
Protokollet som beskrivs här genererar mogna ESC-derived luftvägsepitel med enbart naturliga lung ställningar för att styra differentiering med någon annan tillskott. Denna kultur installationen är definierad, serumfri, billig och reproducerbar. Ingen tillväxtfaktor tillskott av bas differentiering media krävs. Tidigare publicerade metoder för att generera stamcellshärledda lungepitelceller har använt två-dimensionella strategier med tillväxtfaktor tillskott för att främja härstamning begränsning 3…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi vill tacka Dr Rossant och Dr Bilodeau för Nkx2-1 mCherry ESC används i experiment som avbildas i figurerna 1-3. FACS utfördes i Sickkids-UHN flödescytometri Facility. Detta arbete stöddes av verksamhetsbidrag från den kanadensiska Institutes for Health Research och en bidrags infrastruktur (CSCCD) från den kanadensiska Stiftelsen för innovation.
Materials
| Reagents | |||
| Perfusion solution | Sigma | H0777 | 10U/mL heparin |
| Perfusion solution | Gibco | 14170112 | dissolved in Hank's balanced salt solution (HBSS-) |
| Decellularization solution | BioShop | CHA003 | 8mM CHAPS |
| Decellularization solution | Sigma | E9884 | 25mM EDTA |
| Decellularization solution | BioShop | SOD002 | 1M NaCl |
| Decellularization solution | Gibco | 14190-144 | dissolved in PBS |
| Benzonase nuclease | Novagen | 70664-3 | 90U/mL Benzonase nuclease |
| Benzonase nuclease | Gibco | 14190-144 | diluted in PBS |
| Antimicrobial solution | Gibco | 15140 | 200U/mL penicillin streptomycin |
| Antimicrobial solution | Gibco | 15290 | 25μg/mL amphotericin B |
| Antimicrobial solution | Gibco | 14190-144 | diluted in PBS |
| Trypsinization | Gibco | 12605-028 | TrypLE |
| Serum free differentiation media (SFDM) | Gibco | IMDM 2440-053, F12 11765-054 | 3:1 ratio of IMDM and Ham’s modified F12 medium |
| Serum free differentiation media (SFDM) | Gibco | 12587-010 | B27 supplement (50x dilution) |
| Serum free differentiation media (SFDM) | Gibco | 17502-048 | N2 supplement (100x dilution) |
| Serum free differentiation media (SFDM) | Gibco | 15260-037 | 0.05% (Fraction V) bovine serum albumin |
| Serum free differentiation media (SFDM) | Gibco | 35050-061 | 200mM Glutamax |
| Serum free differentiation media (SFDM) | Sigma | M6145 | 4μM monothioglycerol |
| Serum free differentiation media (SFDM) | Sigma | A4403 | 0.05mg/mL ascobic acid |
| Endoderm induction | R&D | 338-AC/CF | Activin A |
| Antibodies | |||
| CDH1 | BD Biosciences | 610181 | Mouse, non-conjugated, 1:100 |
| C-KIT | BD Biosciences | 558163 | Rat, PE-Cy7, 1:100 |
| CXCR4 | BD Biosciences | 558644 | Rat, APC, 1:100 |
| KRT5 | Abcam | ab24647 | Rabbit, non-conjugated, 1:1000 |
| NKX2-1 | Abcam | ab76013 | Rabbit, non-conjugated, 1:200 |
| Laminin | Novus Biologicals | NB300-144 | Rabbit, non-conjugated, 1:200 |
| SCGB1A1 | Santa Cruz | sc-9772 | Goat, non-conjugated, 1:1000 |
| SOX2 | R&D Systems | AF2018 | Goat, non-conjugated, 1:400 |
| TRP63 | Santa Cruz | sc-8431 | Mouse, non-conjugated, 1:200 |
| TUBB4A | BioGenex | MU178-UC | Mouse, non-conjugated, 1:500 |
| Goat IgG | Invitrogen | A-11055 | Donkey, Alexa Fluor 488, 1:200 |
| Mouse IgG | Invitrogen | A-21202 | Donkey, Alexa Fluor 488, 1:200 |
| Mouse IgG | Invitrogen | A-31571 | Donkey, Alexa Fluor 647, 1:200 |
| Rabbit IgG | Invitrogen | A-21206 | Donkey, Alexa Fluor 488, 1:200 |
| Rabbit IgG | Invitrogen | A-31573 | Donkey, Alexa Fluor 647, 1:200 |
| Other Materials | |||
| Low adherent plates | Nunc | Z721050 | Low cell binding plates, 6 wells |
| Air-liquid interface membranes | Whatman | 110614 | Hydrophobic Nucleopore membrane, 8μm pore size |
| Vibratome | Leica | VT1200S | Leica Vibratome |
| Tissue Adhesive | Ted Pella | 10033 | Pelco tissue adhesive |
References
- Discher, D. E., Mooney, D. J., Zandstra, P. W. Growth Factors, Matrices, and Forces Combine and Control Stem Cells. Science. 324 (5935), 1673-1677 (2009).
- Daley, W. P., Peters, S. B., Larsen, M. Extracellular matrix dynamics in development and regenerative medicine. J. Cell Sci. 121 (3), 255-264 (2008).
- Ghaedi, M., et al. Human iPS cell-derived alveolar epithelium repopulates lung extracellular matrix. J. Clin. Invest. 123 (11), 4950-4962 (2013).
- Huang, S. X. L., et al. Efficient generation of lung and airway epithelial cells from human pluripotent stem cells. Nat. Biotechnol. 32 (1), 84-91 (2014).
- Jensen, T., et al. A rapid lung de-cellularization protocol supports embryonic stem cell differentiation in vitro and following implantation. Tissue Eng. Part C: Methods. 18 (8), 632-646 (2012).
- Longmire, T. A., et al. Efficient derivation of purified lung and thyroid progenitors from embryonic stem cells. Cell stem cell. 10 (4), 398-411 (2012).
- Wong, A. P., et al. Directed differentiation of human pluripotent stem cells into mature airway epithelia expressing functional CFTR protein. Nat. Biotechnol. 30 (9), 876-882 (2012).
- Gilpin, S. E., et al. Enhanced Lung Epithelial Specification of Human Induced Pluripotent Stem Cells on Decellularized Lung Matrix. Annal. Thorac. Surg. 98, 1721-1729 (2014).
- Cortiella, J., et al. Influence of Acellular Natural Lung Matrix on Murine Embryonic Stem Cell Differentiation and Tissue Formation. Tissue Eng. Part A. 16 (8), 2565-2580 (2010).
- Princivalle, M., De Agostini, A. Developmental roles of heparan sulfate proteoglycans: a comparative review in Drosophila, mouse and human. Int. J. Dev. Biol. 46, 267-278 (2002).
- Thompson, S. M., Jesudason, E. C., Turnbull, J. E., Fernig, D. G. Heparan sulfate in lung morphogenesis: The elephant in the room. Birth Defects Res. Part C, Embryo Today. 90 (1), 32-44 (2010).
- Zimmermann, M., et al. Improved reproducibility in preparing precision-cut liver tissue slices. Cytotechnology. 61 (3), 145-152 (2009).
- Ying, Q. -. L., et al. The ground state of embryonic stem cell self-renewal. Nature. 453 (7194), 519-523 (2008).
- Fox, E., et al. Three-Dimensional Culture and FGF Signaling Drive Differentiation of Murine Pluripotent Cells to Distal Lung Epithelial Cells. Stem Cells Dev. 24 (1), 21-35 (2014).
- Basu, S., Campbell, H. M., Dittel, B. N., Ray, A. Purification of Specific Cell Population by Fluorescence Activated Cell Sorting (FACS). J. Vis. Exp. (41), e1546 (2010).
- Shojaie, S., et al. Acellular lung scaffolds direct differentiation of endoderm to functional airway epithelial cells: requirement of matrix-bound HS proteoglycans. Stem Cell Reports. 4, 1-12 (2015).
- Kubo, A., et al. Development of definitive endoderm from embryonic stem cells in culture. Development. 131 (7), 1651-1662 (2004).
- Longmire, T. A., et al. Efficient Derivation of Purified Lung and Thyroid Progenitors from Embryonic Stem Cells. Cell stem cell. 10 (4), 398-411 (2012).
- Wong, M. D., Dorr, A. E., Walls, J. R., Lerch, J. P., Henkelman, R. M. A novel 3D mouse embryo atlas based on micro-CT. Development. 139 (17), 3248-3256 (2012).
