Introduction
最近開発されたハイスループット単一細胞アッセイ技術は、新規酵素がそれらの機能的活動1に基づいて大規模な遺伝的ライブラリーからスクリーニングすることができます。単一細胞レベルで、転写を調節するタンパク質は、標的酵素活性の結果として産生される小分子を検出することによりレポーター遺伝子の発現を誘発するために使用されます。 1つの初期のアプローチは、基板がレポータータンパク質2の発現を誘導する（SIGEX）メソッドを、スクリーニング基板に誘導される遺伝子発現を使用して、 ラルストニアユートロファ E2からフェノール分解オペロンの単離を含んでいました。 シュードモナス・プチダのNhaRはベンズアルデヒドデヒドロゲナーゼ3を選択するために使用し、 コリネバクテリウム・グルタミカムからLysGは、多様な変異体のライブラリー4から新たなL-リジン生産株のハイスループットスクリーニングに使用しました。
以前は、遺伝的酵素screeningのシステム（GESS）は、一般的に適用可能なスクリーニングプラットフォーム5として提案されました。このシステムはP.の、フェノール認識ジメチルレギュレータ、DMPRを使用していますプチダ 。 DMPR（E135K）、及びDMPRの変異体は、また、p個のニトロフェノール（PNP）を検出するためのGESS（PNP-GESS）で使用することができます。フェノール化合物を製造する標的酵素の存在下で、 大腸菌においてGESS 大腸菌細胞は、蛍光活性化セルソーター（FACS）を使用して、単一の細胞の迅速な単離を可能にする、蛍光シグナルを発します。しかし、メタゲノム酵素の発現は、従来の組換え酵素のそれよりも弱いように見えます。従って、GESS最適な運転条件5と一緒にリボソーム結合部位（RBS）とターミネーター配列との組み合わせを調査することによって最大感度を有するフェノール化合物を検出するように設計しました。
GESSの基本的な利点の一つは、この単一のメソッドは、理論的にはOVのスクリーニングを可能にすることですBRENDAデータベース内の酵素のERより200異なる種類（ 表1は、http：// www.brenda-enzymes.info、2013.7）単に異なる基板を採用することにより。これは、セルラーゼ、リパーゼ、及びメチルパラチオンヒドロラーゼ（MPH）は、それぞれのp -nitrophenyl酪酸、p個の -nitrophenyl-cellotrioside、およびメチルパラチオン、5の適切な基質でPNP-GESSを用いて検出することができることが示されました。最近では、PNP-GESSを使用して同定された新規酵素の一つであるアルカリホスファターゼ（AP）は、低温適応海洋metagenomes 6で最初に検出された熱不安定性のAPであることが判明しました。
ここでは、スクリーニングプロセスの詳細は、PNP-GESSはメタゲノムライブラリ5,6から新規候補酵素を同定する迅速enzymes-リパーゼ、セルラーゼ、およびアルカリホスファターゼの3種類の活動を検出-andが提示されます。プロセスは、PNP-GESSとオペレーティングFLとメタゲノムの前処理を含みますOWサイトメトリー選別機。得られたヒットはさらに識別のために配列決定する必要がありますが、このプロトコルは、フローサイトメトリーを用いて酵素活性確認の手順までの手順をカバーしています。
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Protocol
1. PNP-GESSとメタゲノムライブラリの準備
- 大腸菌におけるメタゲノムライブラリーを構築大腸菌は、フォスミドベクターを製造者のプロトコール5に従ってフォスミドライブラリー産生キットを使用します。
- アリコートメタゲノムライブラリー細胞の供給源である-70℃、での保存のためのライブラリ100μlの。
注：このライブラリーストックの600ナノメートルの波長で測定した試料の光学密度（OD 600）は約100です。 - 氷の上で株式メタゲノムライブラリーの100μLを解凍し、50ミリリットルルリア - ベルターニ（LB）と2時間37℃でインキュベートした12.5 / mlのクロラムフェニコールを含む500mlフラスコに接種します。
- 4℃で20分間、1000×gでの遠心分離によって50mlコニカルチューブ中の細胞を採取。
- 再び4℃で20分間、1000×gで50ミリリットルの氷冷蒸留水（DW）と遠心機で迅速にペレットを再懸濁。
- RES10％（v / v）のグリセロールを50μlの氷冷DWでペレットuspend。エレクトロポレーションのためにこの細胞アリコート50μlのを使用してください。
- エレクトロコンピテント細胞を50μl、氷冷エレクトロポレーションキュベットおよびエレクトロポレーションでpGESS（E135K）5 DNA（100ngの）（1.8キロボルト/ cmで、25μF）の混合物の混合物を置きます。
- 迅速に異化代謝産物抑制（SOC）媒体とスーパー最適な培養液1ミリリットルを追加し、穏やかに細胞を再懸濁。
- ピペットを用いて14 mLの丸底チューブに細胞を移し、37℃で1時間インキュベートします。
- 12.5 / mlのクロラムフェニコールおよび50μg/ mlのアンピシリンを含むLB 20×20平方cmプレートに回収した細胞を500μlを広げます。 12時間、30℃でプレートをインキュベートします。
- 細胞スクレーパーを用いてコロニーを掻き取り、氷冷細胞記憶媒体を用いて50mlコニカルチューブに細胞を回収。
- 4°Cで20分間1,000×gで遠心分離します。 10 mlの氷冷細胞記憶媒体にペレットを再懸濁OD 100の600に到達します。
- 小分けし、-70℃での保存のための細胞の20μlの。
2.メタゲノムライブラリから偽陽性を削除します
- 氷上でメタゲノムDNAのフォスミドとpGESS（E135K）を含有する（ステップ1.13から）株式メタゲノムライブラリ細胞を解凍します。
- 14-mlの丸底チューブに50μg/ mlのアンピシリンおよび12.5 / mlのクロラムフェニコールを含む2ミリリットルのLB中の細胞を10μlを接種します。 4時間、200rpmで振盪しながら37℃でインキュベートします。
- 一方、FACSのマシンをオンにし、デフォルトFACSソフトウェアを開きます。次の設定を使用：ノズル先端径、70ミクロン;前方散乱面積（FSC-A）感度、300 V-対数増幅;側方散乱エリア（SSC-A）感度、350 V-対数増幅;フルオレセインイソチオシアネートエリア（FITC-A）感度、450 V-対数増幅;閾値パラメータ、FSC-値5。
注意：一般的な設定が与えられています材料の表に記載されたFACSデバイス用。他のFACSデバイスの設定を調整します。 - 1mlのPBSを含む5 mlの丸底チューブに5μlのサンプルを追加することにより、ステップ2.2からメタゲノムライブラリー細胞を希釈します。
- FACS装置のロードポートに希釈したライブラリのサンプルを配置し、FACSソフトウェアの取得、ダッシュボード上のLoadボタンをクリックしてください。
- ダッシュボード上のフローレートボタンをクリックして制御することにより、1500イベント/秒 - 1,000事象率を調整します。
- ログを作成FSC-A 対ツールバーのドットプロット]ボタンをクリックすることで、グローバルワークシート上のスケールSSC-散布図をログスケール。ツールバーのポリゴンゲートボタンを使用して、一重のイベント（細菌集団）を包含するように散布ゲートR1を調整します。
- ログは、ヒストグラムボタンをクリックすることで、ワークシート上のFITC-Aをスケールされた対細胞数とのヒストグラムをプロットします。そして、CytomeからFITC電圧を調整釣鐘型の分布のピークは、FITC-Aの10未満2であるように、インスペクタのコントロールウィンドウのターの設定]タブ。
- 対対数スケールFSC-Aを作成します。ログFITC-グローバルワークシート上のドットプロット]ボタンをクリックしてプロット。ゲートがbell-のピーク付近分布の中心（合計10％の細胞から+ 5％-5％の細胞との間に位置するように、ツールバー上のポリゴンゲートボタンを使用して、プロットに振り分けゲートR2を設定字曲線）。
- 1.2ミリリットルLBはFACS装置の出口で50μg/ mlのアンピシリンおよび12.5 / mlのクロラムフェニコールを含有し、R1とR2ゲートの両方を満たすソートアウト10 6個の細胞を含むコレクションチューブを置きます。
- コレクションチューブを外し、キャップ、そして穏やかにボルテックス。
3.メタゲノム酵素スクリーニング
- OD 600が 0.5に達するまで、200 rpmで振盪しながら37℃で（ステップ2.11）から選別された細胞をインキュベートします。
- 1μlを添加し、細胞内フォスミドコピー数を増幅するために誘導ソリューションをコピーします。 250 rpmで振盪しながら37℃でさらに3時間、細胞をインキュベートします。
- 最終濃度で14-mlの丸底チューブに0.5培養細胞mlの適切な基質（Pの -nitrophenylアセテート、p個の -nitrophenyl-β-D-セロビオシド、またはフェニルホスフェート）を追加し、選別するための細胞を調製します100μMの。
- 対照サンプルについては、14-mlの丸底チューブにステップ3.2からの培養細胞の0.5ミリリットルを追加します。ステップ3.3の基板ボリュームと同じ容量のPBSを追加します。
- 37℃での2つのサンプルが3時間200rpmで振盪しながらインキュベートします。
- 一方、ステップ2.3と同様の構成でFACSマシンを準備。
- それぞれ、1mlのPBSを含む2 5ミリリットル丸底チューブに（ソート用）細胞および対照細胞の5μlを添加します。
- トンにコントロール細胞を含むチューブを置きます彼は、FACSのポートをロードし、FACSソフトウェアの取得、ダッシュボード上のLoadボタンをクリックしてください。ダッシュボード上のフローレートボタンを制御することにより、3000イベント/秒 - 千にイベントレートを調整します。
- ログを作成FSC-A 対ソフトウェアの世界的なワークシート上のドットプロット]ボタンをクリックして拡大縮小SSC-散布図を記録し、上ポリゴンゲートボタンを使用して、一重のイベント（細菌集団）を包含するように散布ゲートR1を調整スケーリングツール・バー。
- ログを作成FSC-A 対ワークシート上のドットプロット]ボタンをクリックして拡大縮小FITC-散布図を記録し、0.1％未満のように、ツール・バー上のポリゴンゲートボタンを使用して、プロットに振り分けゲートR2を設定するスケーリング陰性細胞は、R2のゲート内で検出されています。
- ソート試料管と対照サンプルチューブを交換し、1000にイベントレートを調整 - ダッシュボード上のフローレートボタンを制御することにより、3000イベント/秒。
- 0.5を含むコレクションチューブを置きますmlのFACS装置の出口でのLBと整理10 4細胞を、R1とR2のゲートの両方を満たします。
注：ソート基準トップ0.1％R2ゲートにおけるFITC-Aの5％の範囲とすることができます。このプロトコルでは、トップ1％の細胞が陽性として回収しました。 - コレクションチューブを外し、キャップ、そして穏やかにボルテックス。
- LB、50μg/ mlのアンピシリン、12.5 / mlのクロラムフェニコールを含む2寒天プレート（90ミリメートルペトリ皿）上のサンプルを収集した0.5ミリリットルを広げ、37℃で一晩静置します。
- 必要に応じて、手順3.1から3.14を繰り返すことにより、FITC-濃縮のためにソートの追加のラウンドを行います。
4.ヒット選択と酵素活性の確認
- フローサイトメトリー分析
- ステップ3.14でインキュベートプレートから、LED照明の波長488nmの観察下コロニーピッカーを使用しては蛍光を示さないコロニーを選択します。
- 14-mlのROで選択されたコロニーを接種します50μg/ mlのアンピシリンおよびそのOD 600が 0.5に達するまで、200 rpmで振盪しながら37℃で12.5 / mlのクロラムフェニコールを含む2ミリリットルのLBを含むウント底チューブ。
- 2μlを添加し、細胞内フォスミドコピー数を増幅するために誘導ソリューションをコピーします。 250 rpmで振盪しながら37℃でさらに3時間、細胞をインキュベートします。
- 14ミリリットル丸底チューブを準備し、培養細胞（ステップ4.1.3）の1ミリリットルを追加します。 100μMの最終濃度で適切な基質（p個の -nitrophenylアセテート、P -nitrophenyl-β-D-セロビオシド、またはフェニルホスフェート）を追加します。
- 制御のために、14ミリリットル丸底チューブにステップ4.1.3から1ミリリットルを培養した細胞を追加し、ステップ4.1.4の基板ボリュームと同じ容量のPBSを追加します。
- 37℃での2つのサンプルが3時間200rpmで振盪しながらインキュベートします。
- 一方、ステップ2.3と同様の構成でFACSマシンを準備。
- それぞれ、1mlのPBSを含む5ミリリットル丸底チューブに制御し、基板処理した細胞の5μlを添加します。
- FACS装置のロードポート上のコントロール細胞を含むチューブを置き、FACSソフトウェアの取得、ダッシュボード上のLoadボタンをクリックしてください。ダッシュボード上のフローレートボタンを使用して3000イベント/秒 - 1,000事象率を調整します。
- FITC-Aを測定するために取得]ボタンをクリックします。
- 基板処理された試料管を対照サンプルチューブを交換してください。ダッシュボード上のフローレートボタンを使用して3000イベント/秒 - 1,000事象率を調整します。
- FITC-Aを測定するために取得]ボタンをクリックします。
- FITC-Aをスケーリングログ対細胞数のヒストグラムをプロットすることによって、細胞の二つのグループの蛍光を比較します。
- 他のアッセイは、酵素活性を確認するため
- 選択された酵素候補のさらなる同定のために、標準的な抽出のプロを使用してフォスミドDNAを抽出市販の抽出キットからcedures塩基配列を分析し、またはin vitroでの酵素活性6,7をテストします。
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Representative Results
3フェノール基板が提案されたプロトコルに従うことにより、泰安、韓国の海洋干潟堆積物のメタゲノムライブラリーからの新規メタゲノム酵素を同定するために検討しました。ライブラリーの構築のために、平均30〜40キロバイトのメタゲノム配列は、Eに基づいているフォスミド、中に挿入しました大腸菌 F因子レプリコンおよびセル内の単一のコピーとして提示しました。フォスミドが広く、その安定した伝播8に起因する複雑なゲノムライブラリーを構築するために使用されていることに注意してください。
図1は、R1とR2ソートゲート（ 図1 B）と正のヒットの選択が続く負のソートと偽陽性の除去（ 図1 A）を含むスクリーニングプロトコルの簡単なフローチャートを示しています。ヒットとし、基板なしのサンプルの蛍光を比較することにより評価しました。（ 図1C）。基板処理細胞の蛍光は、対照細胞（ 図2 A）よりも高かった場合のp -nitrophenyl酢酸媒介スクリーニングの場合には、リパーゼの5候補が確認されました。 図2のBにおけるセルラーゼの3候補の広範な分布にもかかわらず、彼らはまた、集団の平均FITC強度の明確な違いを示しました。四ホスファターゼ候補はまた、対照細胞（ 図2のC）と比較して高い蛍光レベルを示しました。 PNP-GESSの蛍光レポーターは、フェノール濃度5に定量的な応答を示すことから、負の候補セル強い酵素活性との間のより多くの蛍光差を推定することができます。
このプロトコルでは、蛍光のみの違いは、フローサイトメトリーを用いて確認したが、様々な識別アッセイを適用することができますステップ4.2で説明した。 図3は、AP識別6の例を示しています。スクリーニング四〇から七高蛍光コロニーのうち、選択されたクローンを配列決定し、候補APのORFを同定しました。 ORFは、フローサイトメトリーでAP活性を有することが確認されたプラスミドベクターに挿入しました。 図3においては、ヒットは、空のプラスミド（負）を有する細胞よりも強い蛍光シグナルを示しています。シーケンスのインビトロ酵素活性のさらなる分析は、このAPが15分6以内、より低い温度（35℃）で高い触媒活性及び著しい熱的不安定性（65°C）を除いて、その酵素特性の他の既知のAPに非常に類似していたことを発見しました。また、スクリーニングAPは、線状化プラスミドDNA 6の凝集および平滑末端から末端リン酸を除去するのに商業的に利用可能なAPに匹敵しました。
図1：基板ずに蛍光を示す偽陽性細胞の多酵素スクリーニングプロセス （A）の除去。ゲートは、全細胞の10％を含むように選別ゲートは、細胞集団の密度の中間に位置しています。 （B）は、適切な基質の存在下で、R1及びR2ゲートを満たす（FITC-A）細胞（正の）高い蛍光をソート。 （C）選択し、単一細胞単離の後、候補酵素の活性は、（それぞれ、Wおよび/ W / O基板として示される）基材とし、なしで調べました。二つのサンプルの間に明確な信号差は、細胞のフォスミドベクターは、目的の標的遺伝子情報が含まれている意味している。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図2： フローサイトメトリーを用いた酵素活性評価 （A） のp -nitrophenylアセテート（PNPA）三つの異なる基質でPNP-GESSによりスクリーニングメタゲノム酵素候補、（B） のp -nitrophenyl-β-D-セロビオシド（pNPG2）、および。 （C）フェニルホスフェート。すべての候補者は、基板とない細胞の間に明確な信号差を示しています。コントロールは、それらに対応する基板処理なしの細胞である。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図3： アルカリホスファターゼI生歯。左パネルには、ヒット酵素と空のプラスミドベクター（マイナス）を含む細胞の間に明確な蛍光差を示しています。右側に、比色基質として5-ブロモ-4-クロロ-3-インドリルホスフェートを含有するLB寒天上にプラスミドベクター中にホスファターゼ候補遺伝子を保有する細胞のホスファターゼアッセイが示されています。青色のコロニーは、選択された細胞がホスファターゼをコードするメタゲノム遺伝子を含むことを示しています。詳細は6を参照してください。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
| EC番号 | 説明 | p-ニトロフェノール生成酵素の号 | フェノール生成酵素の号 | |
| EC 1 </ TD> | 1.3 | ドナーのCH-CH基に作用します | - | 1 |
| 酸化還元酵素 | 1.11 | Peroxygenase | 2 | - |
| 1.14 | 取り込みと、対になったドナーに作用しますか | - | 2 | |
| 酸素分子の還元 | ||||
| EC 2 | 2.3 | アシルトランスフェラーゼ | 1 | - |
| トランスフェラーゼ | 2.4 | グリコシルトランスフェラーゼ | 8 | - |
| 2.5 | メチル基以外の転送アルキル又はアリール基、 | 1 | 1 | |
| 2.7 | リン含有基を転移 | 1 | 1 | |
| 2.8 | 硫黄含有基を転移 | 3 | 1 | |
| EC 3 | 3.1 | エステル結合に関する法律 | 67 | 16 |
| 加水分解酵素 | 3.2 | グリコシラーゼ | 75 | 21 |
| 3.4 | ペプチド結合に関する法律 - ペプチダーゼ | 26 | 4 | |
| 3.5 | ペプチド結合以外の炭素 - 窒素結合に関する法律 | 5 | 3 | |
| 3.6 | 酸無水物に関する法律 | 4 | - | |
| 3.7 | 炭素 - 炭素結合に関する法律 | 2 | - | |
| EC 4 | 4.1 | 炭素 - 炭素リアーゼ | - | 3 |
| リアーゼ | 4.2 | 炭素 - 酸素リアーゼ | 1 | - |
| 4.3 | 炭素 - 窒素リアーゼ | 1 | - | |
| 酵素の小計数 | 197 | 53 | ||
| 酵素の合計数（重複した酵素を除きます） | 211 | |||
表1：BRENDAデータベースからのpニトロフェノールまたはフェノールを生成する酵素の数。
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Discussion
生体触媒の生産効率を大きくすると、最高の自然な酵素源の一つと考えられている業界9とメタゲノムベースのバイオ化学の成功の鍵です。この意味で、それは、遺伝資源の大部分が10を検討されていないメタゲノムから新規酵素をスクリーニングするために不可欠です。いくつかのスクリーニング方法は、直接転写活性化因子11,12を用いた酵素生成物を検出する開発されてきたが、これらの技術は、特定の代謝産物応答性転写システムを必要とします。一方、GESSは、フェノールまたはPNPは、基板をタグ付けの用途に応じて広く適用可能です。 BRENDAデータベースに（この作品で3例を含む）（ 表1）、フェノールまたはPNP化合物を製造する報告する酵素のほとんどが加水分解酵素に属するが（EC番号3）クラスの酵素は、より多様なフェノール基板を模索し、さらには人工的に設計します基板に施します酵素活性を標的とする、天然基質の代替として、大幅なスクリーニングシステムの適用可能性を拡張することができます。膜透過性および基板の細胞効果はかなりスクリーニングプロトコルに影響を与えるため、適切なフェノールを選択またはPNPは、基板をタグ付けすると、PNP-GESSアプリケーションの重要なステップの一つであることに注意してください。ここでは、酵素の工業的に重要な3つの異なるタイプは、単一のスクリーニング系を用いた高スループットの方法で同定することができることを示しています。
FACSを使用するアプローチは、メタゲノム酵素のハイスループットスクリーニングに加えて、変更されたTRの特異性転写調節因子（TRS）のエンジニアリングに適用することができます。一例では、代わりにアラビノースのメバロン 酸を検出のAraC変異体はFACSを用いて単離し、その後メバロン 酸13を産生する細胞をスクリーニングするために使用した研究です。また、のTRの特異性の改変は、フュルトを可能にしました酵素活性のER技術。自動調節TR、PcaUは、3,4-ジヒドロキシ安息香酸（34DHB）を検出するように設計した後、34DHB 14に内因性dehydroshikimateを変換する彼らの最大活性でdehydroshikimateデヒドラターゼ酵素（AsbF）をスクリーニングするために適用しました。 PNP-GESSはpNPを検出するDMPR変異体を使用して大規模な遺伝子ライブラリーからスクリーニングハイスループット性能を示すので、これらの研究の基本的な概念は、PNP-GESSと同様です。広く特異性の結果として、他の誘導因子によるレポーター発現を誘発することができるしかし、特異性のエンジニアリングは、ヒットのうちの意図しない誤検出を引き起こす可能性があります。したがって、TRが適用される前に、TR応答の直交性を調査することが望ましいであろう。一方、TRの感度とダイナミックレンジを増加させることは、偽陽性の発生を補償することができました。例えば、GESSの感度が最適化されたRBS及びターミネーターsequを挿入することによって改善されましたシステムにences。スクリーニングシステムの偽陽性はおそらく遺伝回路の誤動作から来て、TR、異種の細胞の成長、およびフェノールまたはPNPの自由拡散を活性化し、意図しないフェノール化学物質。ステップ2.1の負の選択プロセス - 2.9は、基板処理せずに蛍光を放出する偽陽性細胞を除去することが期待されました。これらの偽陽性の細胞は、遺伝的回路の信号対雑音比を最大化することによって低減することができます。 RBS及びターミネーターエンジニアリングとともに、M9グルコース培地の使用が大幅に信号を改善した（LB培地よりも7倍高い）PNP-GESS性能の5。しかし、このプロトコルでは、LBは、未知のメタゲノム遺伝子発現とGESS信号強度との間の妥協として使用しました。 M9グルコースでPNP-GESS細胞の増殖および基板効果のより繊細な条件を調査すると、信号強度を向上させることができます。ステップ3.5での基質の反応時間の厳密な調節は、ありますまた、重要なフェノールまたはPNP拡散によってトリガ誤検出を防止します。
GESSは、単一細胞レベルでの転写媒介レポータータンパク質の発現に酵素機能の変換を可能にするが、レポータータンパク質を介した間接的な同定は、先天性の限界の一つである可能性があります。そのように、 インビトロ酵素アッセイおよび生成物のLC / GC-MS分析は、推定上の酵素候補6,7の明確な同定追跡する必要があります。また、このような抗生物質耐性遺伝子または蛍光レポーターで発色酵素として代替レポーターを取り付けることにより、高価なFACS分析を必要とすることなくGESSを使用することが可能です。 GESSアプリケーションの更なる向上のために、酵素活性を特徴付けし、ハイスループット様式で酵素を同定するための方法を確立する必要があります。このような次世代シーケンシングなどの他のハイスループット技術とともに、GESSは、タンパク質とenzyための広く使用されている戦略になります生物学ベースの業界で私触媒工学。
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| CopyControl | Epicentre | CCFOS110 | Fosmid library production kit |
| CopyControl Induction Solution | Epicentre | CCIS125 | Fosmid copy induction solution |
| EPI300 | Epicentre | EC300110 | Electrocompetent cell |
| pCC1FOS | Epicentre | CCFOS110 | Fosmid vector |
| Gene Pulser Mxcell | Bio-Rad | Electroporation cuvette and electroporate system | |
| FACSAria III | Becton Dickinson | Flow Cytometry (FACS machine) | |
| AZ100M | Nikon | Microscope | |
| UltraSlim | Maestrogen | LED illuminator | |
| 50-ml conical tube | BD Falcon | ||
| 14-ml round-bottom tube | BD Falcon | ||
| 5-ml round-bottom tube | BD Falcon | ||
| p-nitrophenyl phosphate | Sigma-Aldrich | N7653 | Substrate |
| p-nitrophenyl β-D-cellobioside | Sigma-Aldrich | N5759 | Substrate |
| p-nitrophenyl butylate | Sigma-Aldrich | N9876 | Substrate |
| Luria-Bertani (LB) | BD Difco | 244620 | Tryptone 10 g/L, Yeast extract 5 g/L, Sodium Chloride 10 g/L |
| Super Optimal broth (SOB) | BD Difco | 244310 | Tryptone 20 g/L, Yeast extract 5 g/L, Sodium Chloride 0.5 g/L, Magnesium Sulfate 2.4 g/L, Potassium Chloride 186 mg/L |
| Super Optimal broth with Catabolite repression (SOC) | SOB, 0.4 % glucose | ||
| 2x Yeast Extract Tryptone (2xYT) | BD Difco | 244020 | Pancreatic digest of Casein 16 g/L, Yeast extract 10 g/L, Yeast extract 5 g/L |
| Cell storage media | 2x YT broth, 15% Glycerol, 2% Glucose | ||
| pGESS(E135K) | A DNA vector containing dmpR, egfp genes with their appropriate promoters, RBS, and terminator. See the reference 5 in the manuscript for more details. |
||
| Chloramphenicol | Sigma | C0378 | |
| Ampicillin | Sigma | A9518 | |
| BD FACSDiva | Becton Dickinson | Flow Cytometry Software Version 7.0 | |
| PBS | Gibco | 70011-044 | 0.8% NaCl, 0.02% KCl, 0.0144% Na2HPO4, 0.024% KH2OP4, pH 7.4 |
References
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