Introduction
最近开发的高通量的单细胞分析技术允许新的酶从基于其功能活动1大规模的基因库进行筛选。在单细胞水平,调节转录的蛋白质采用通过检测所生产作为目标酶活性的结果,小分子引发报告基因的表达。一种早期方法涉及从富养产碱 E2使用底物诱导的基因表达筛选(SIGEX)方法,其中基材诱导报告蛋白2的表达的酚降解操纵子的分离。 恶臭假单胞菌 NhaR用于选择苯甲醛脱氢酶3,并从谷氨酸棒杆菌 LysG被用于从不同的突变体文库4新的L-赖氨酸生产菌株的高通量筛选。
先前,遗传酶screeniNG系统(GESS)提出了一个普遍适用的筛选平台5。该系统采用酚系识别二甲调节器,DMPR,P的恶臭 。 DMPR(E135K),和DMPR的突变体,也可以在GESS(PNP-GESS)检测p硝基苯酚(PNP)的使用。在生产酚醛化合物靶酶的存在下,GESS在大肠杆菌大肠杆菌细胞发出的荧光信号,能够使用荧光激活细胞分选仪(FACS)单细胞的快速分离。但宏基因组酶的表达似乎是比传统的重组酶的弱;因此,GESS旨在通过与最佳操作条件5沿调查核糖体结合位点(RBS)和终止子序列的组合以检测与最大灵敏度酚类化合物。
之一的GESS的基本优点是,这种单一的方法理论上允许OV的筛选器超过200种不同类型的BRENDA数据库酶( 表1对于http:// www.brenda-enzymes.info,2013.7)通过简单地采用不同的基板。它表明,纤维素酶,脂肪酶,和甲基对硫磷水解酶(MPH)可使用的pNP-GESS与对硝基苯基丁酸酯,对硝基苯基- cellotrioside和甲基对硫磷,分别为5的适当底物进行检测。最近,证明了碱性磷酸酶(AP),其是使用的pNP-GESS确定的新酶之一,是在冷适应的海洋宏基因组6找到的第一个不耐热的AP。
这里,筛选过程的细节呈现的pNP-GESS检测三种不同类型的enzymes-脂肪酶,纤维素酶,和碱性磷酸酶的活动-and迅速从宏基因组文库5,6-识别新的候选酶。这些过程包括:宏基因组为PNP-GESS预处理和经营FL流式细胞仪分拣机。而获得的匹配将需要测序进一步鉴定,该协议覆盖的步骤执行到使用流式细胞仪的酶活性的确认的步骤。
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Protocol
1.准备使用的PNP-GESS的宏基因组文库
- 在构造一个E.宏基因组文库大肠杆菌用F粘粒载体使用根据制造商的方案5的fosmid文库生产套件。
- 等分试样在-70℃,这是宏基因组文库细胞源100微升用于存储的库。
注意:在这个库的库存为600nm(OD 600)的波长的测定的样品的光密度为约100。 - 在冰上解冻100微升股票宏基因组文库,并在含有50毫升的Luria-BERTANI(LB)和12.5微克/毫升氯霉素接着37℃温育2小时的500毫升烧瓶中接种。
- 收获在通过离心50ml锥形管中的细胞以1000 xg离心在4℃下20分钟。
- 再次快速重悬沉淀在50ml冰冷却的蒸馏水(DW)和离心机在1000×g离心20分钟,在4℃下。
- RESuspend在50μl冰冷DW沉淀,用10%(V / V)甘油。使用50微升这种细胞等分的电。
- 放置电感受态细胞50微升和pGESS(E135K)5的DNA(为100ng)的混合物在冰冷电穿孔管和电穿孔(1.8千伏/厘米,25μF)的混合物。
- 迅速加入1毫升代谢产物抑制(SOC)中的超级最佳肉汤,轻轻悬浮细胞。
- 转移细胞成14毫升的圆底管中,使用移液管,在37℃下孵育1小时。
- 涂布在含有12.5微克/毫升氯霉素和50μg/ ml氨苄青霉素的LB一个20×20厘米的正方形板500微升回收的细胞。在30℃下孵育板12小时。
- 刮使用细胞刮菌落并收集细胞进入用冰冷元存储介质的50ml锥形管中。
- 离心机在1000×g离心在4℃下20分钟。重悬在10毫升冰冷的细胞存储介质颗粒达成OD 100 600。
- 等分试样20微升细胞贮存在-70℃。
2.从宏基因组文库删除误报
- 解冻含冰宏基因组DNA和粘粒pGESS(E135K)股票宏基因组文库细胞(从步骤1.13)。
- 接种于2ml的LB 10微升细胞含有50μg/ ml氨苄青霉素和12.5微克/毫升氯霉素的14毫升圆底管中。在37℃下孵育以200rpm摇动4小时。
- 同时,打开FACS机器上打开默认FACS软件。使用以下设置:喷嘴尖端直径,70微米;前向散射面积(FSC-A)的灵敏度,300 V-数放大;侧散射面积(SSC-A)的灵敏度,350 V-数放大;异硫氰酸荧光区(FITC-A)的灵敏度,450 V-数放大;阈值参数,FSC-A值5。
注:给出的典型设置在材料的表中提到FACS设备。调整为其他的FACS设备的设置。 - 通过加入5微升样品加入到含有1ml的PBS 5毫升圆底管稀释来自步骤2.2的宏基因组文库的细胞。
- 稀释样品库放置到FACS仪器的装货港和点击的FACS软件的收购仪表盘Load按钮。
- 通过点击和控制仪表盘上的流量按钮1500次/秒 - 调整事件的发生率到1000。
- 创建日志缩放FSC-A 与对数比例SSC-A散点图在全球工作表通过单击工具栏上的点图按钮。调整散射门R1到包括使用工具栏上的多边形门按钮单事件(细菌种群)。
- 绘制与细胞计数直方图与对数比例FITC-A在工作表上通过点击直方图按钮。然后,调整从细胞组的电压FITC检查员控制窗口之三设置标签,使得钟形分布的峰值小于10 2 FITC-A的。
- 创建日志缩放FSC-A 对 。日志FITC-A通过点击全球工作表上点图按钮的情节。有关使用该工具栏上的多边形门按钮的情节设置分配门R2使得栅极距离发行总量的10%细胞中心(周围的钟峰+ 5%和-5%之间的细胞形曲线)。
- 放置装有含1.2毫升的LB 50微克/毫升氨苄青霉素和12.5微克/毫升氯霉素的FACS仪器的出口与梳理10 6个细胞同时满足R1和R2栅极的收集管。
- 取下收集管中,帽,并轻轻涡旋。
3.宏基因组酶的筛选
- 孵育在37℃的分选的细胞(来自步骤2.11)以200rpm振荡培养直至OD 600达到0.5。
- 加入1μl复制感应解决方案,以扩增细胞内的fosmid套数。孵育所述细胞在37℃下另外的3小时,以250rpm摇动。
- 为了制备细胞分选,加入0.5毫升的培养细胞和合适的底物( 对硝基苯酯,对硝基苯基- β-D-纤维二糖苷,或苯基磷酸酯)成一个14毫升的圆底管中,在终浓度为100μM。
- 对于对照样品,加入0.5毫升来自步骤3.2的培养细胞的成一个14毫升的圆底管中。添加的PBS的体积相同步骤3.3衬底卷。
- 孵育在37℃的两个样品以200rpm摇动3小时。
- 同时,用相同的配置,步骤2.3制备FACS机器。
- 添加5微升细胞(分选)和对照细胞的含有1ml的PBS,分别两个5毫升的圆底管中。
- 将含有控制细胞到T中的管他装载FACS的端口,然后点击Load按钮在FACS软件采集仪表盘。通过仪表盘上的控制流量按钮3000次/秒 - 调整事件的发生率到1000。
- 创建日志缩放FSC-A 与对数比例SSC-A散点图使用的多边形门按钮,点击点图按钮,软件的全球工作表上,并调整散射门R1以包含单事件(细菌种群)工具栏。
- 创建日志缩放FSC-A 与对数比例FITC-A散点图通过单击点图按钮在工作表上并设置分配门R2使用工具栏上的多边形门按钮的情节,这样的不到0.1% R2的栅极内检测到阴性细胞。
- 与分选样品管更换控制样品管,并调整事件发生率1000 - 通过控制仪表盘上的流量按钮3000次/秒。
- 放置装有0.5的收集管LB毫升的FACS仪器的出口,并整理出10 4个细胞满足R1和R2门两者。
注意:分类标准可以在R2的栅极范围的FITC-A的从顶部0.1%至5%。在这个协议中,顶部1%的细胞被收集为阳性。 - 取下收集管中,帽,并轻轻涡旋。
- 散布0.5毫升收集的样品在含有LB,50微克/毫升氨苄青霉素,12.5微克/毫升氯霉素的2琼脂板(90 25mm培养皿),在37℃下孵育该板过夜。
- 如果有必要,重复步骤3.1-3.14进行了FITC-A富集排序额外回合。
4.命中选型和酶活性的确认
- 流式细胞分析
- 从步骤3.14培养板中,选择出了使用LED照明灯的488纳米波长下观察的殖民地选择器无荧光的殖民地。
- 接种所选择的菌落在14毫升ROUND底含有含2ml LB 50微克/毫升氨苄青霉素和12.5微克/ ml氯霉素,在37℃以200rpm摇动,直到它的外径600达到0.5管。
- 加入2微升复制感应解决方案,以扩增细胞内的fosmid套数。孵育所述细胞在37℃下另外的3小时,以250rpm摇动。
- 准备了14毫升的圆底管中,加入1毫升培养的细胞(步骤4.1.3)的。在100μM的终浓度添加适当的底物( 对硝基苯基乙酸, 对 -nitrophenyl-β-D-纤维二糖苷,或苯基磷酸酯)。
- 为对照,将来自步骤4.1.3添加1ml的培养细胞成一个14毫升的圆底管中,加的PBS的体积相同步骤4.1.4基板体积。
- 孵育在37℃的两个样品以200rpm摇动3小时。
- 同时,用相同的配置,步骤2.3制备FACS机器。
- 加入5微升控制和基板处理的细胞,以含1毫升的PBS,分别为5毫升的圆底管中。
- 放置FACS装置的装载端口上的含管对照细胞,然后点击Load按钮在FACS软件采集仪表盘。调整事件发生率1000 - 使用仪表盘上的流量按钮3000次/秒。
- 点击获取按钮来衡量FITC-A。
- 替换与基板处理的样品管中的对照样品管。调整事件发生率1000 - 使用仪表盘上的流量按钮3000次/秒。
- 点击获取按钮来衡量FITC-A。
- 通过对日志缩放的FITC-A绘制细胞计数的直方图比较两组细胞的荧光。
- 其他试验证实酶的活性
- 对于选定的酶考生进一步鉴定,采用标准提取亲提取DNA粘粒从商用提取试剂盒cedures和分析的核苷酸序列,或测试体外酶活6,7。
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Representative Results
检查三酚基板按照该协议,以确定在泰安,韩国海洋滩涂沉积物的宏基因组文库的小说宏基因组酶。用于文库构建,平均30 - 40 kb的宏基因组序列插入到F黏粒,这是基于对大肠杆菌大肠杆菌 F因子的复制子和呈现为在细胞中的单一拷贝。注意,F黏粒已被广泛用于构造复杂的基因组文库,由于其稳定传播8。
图1显示了筛选方案包括除去具有负分拣误报( 图1的 ),随后加入正命中选择与R1和R2分配门( 图1B)的简要流程图。命中被样品的荧光带和不带衬底进行比较评价( 图1C)。在对硝基苯乙介导的筛查情况下,脂肪酶的五名候选人被确认,其中基材处理过的细胞的荧光均较对照细胞( 图2 A)高。尽管纤维素酶在图2 B三名候选人的广泛分布,他们也表现出群体的平均FITC强度的明显差异。相比对照细胞( 图2 C)的四磷酸候选人也表现出高的荧光水平。负和候选小区更强的酶的活性可自的pNP-GESS的荧光报告推导出的多个荧光差异显示了对苯酚浓度5定量响应。
在这个协议中,只有荧光差异用流式细胞仪确认,但各种识别测定可施加■在步骤提到4.2。 图3显示的AP识别6的例子。从其中筛选47强荧光克隆选定的克隆测序和候选AP的ORF被确定。插入质粒载体的ORF被证实具有与流动AP活性术。在图3中,命中显示比携带空质粒(负)的细胞更强的荧光信号。 在体外酶活性序列的进一步分析发现,此接入是高度类似,除了在较低温度(35℃)高的催化活性和15分钟6内一个显着的热稳定性(65℃)在其酶学特性其他已知的AP 。此外,筛选的AP是可比的市售的AP中除去线性化的质粒DNA的6的凝聚力和钝末端终端磷酸盐。
图1:假阳性细胞显示没有底荧光酶多筛选过程 (A)去除。分配门位于细胞群体密度的中间,使得所述栅极包括细胞总数的10%。 (B)的分选高的荧光素(FITC-A)的细胞(阳性)满足在适当的底物的存在,R1和R2栅极。 (C)的选择和单细胞分离后,候选酶的活性,有和没有基板检查(分别表示为W /和W / O基板,)。两个样本之间的明确信号差意味着细胞的F粘粒载体包含感兴趣目标的遗传信息。 请点击此处查看该图的放大版本。
图2: 酶活性的评价使用流式细胞术通过的pNP-GESS有三个不同的基板(A)的对硝基苯酯(PNPA),(B)的 对硝基苯-β-D-纤维二糖苷(pNPG2),并筛选宏基因组酶的候选者。 (C)的苯基磷酸盐。所有候选人展示与无底细胞之间的明确信号差。控件是没有其相应的基板处理的单元格。 请点击此处查看该图的放大版本。
图3: 碱性磷酸酶我dentification,左面板显示包含打酶和空质粒载体(阴性)细胞之间有明显荧光差异。在右侧,将细胞窝藏磷酸酶的候选基因在质粒载体上含有5-溴-4-氯-3-吲哚磷酸作为比色底物LB琼脂的磷酸酶测定法被示出。蓝色菌落表明所选单元格包含编码磷酸酶的基因宏基因组。有关详细信息,请参见6。 请点击此处查看该图的放大版本。
EC号 | 描述 | 对硝基苯酚产生的酶的编号 | 苯酚产酶的号 | |
EC 1 </ TD> | 1.3 | 作用于CH-CH一批捐助者 | - | 1 |
氧化还原酶 | 1.11 | Peroxygenase | 2 | - |
1.14 | 作用于配对的供体,以成立或 | - | 2 | |
还原分子氧的 | ||||
EC 2 | 2.3 | 酰基转移酶 | 1 | - |
转移 | 2.4 | 糖基转移酶 | 8 | - |
2.5 | 转印烷基或芳基,除甲基组其他 | 1 | 1 | |
2.7 | 转移含磷基团 | 1 | 1 | |
2.8 | 转印含硫基团 | 3 | 1 | |
EC 3 | 3.1 | 于酯键的行为 | 67 | 16 |
水解酶 | 3.2 | 糖基化酶 | 75 | 21 |
3.4 | 法案肽键 - 肽酶 | 26 | 4 | |
3.5 | 关于碳 - 氮键,除肽键之外的行为 | 五 | 3 | |
3.6 | 在酸酐法 | 4 | - | |
3.7 | 关于碳 - 碳键的行为 | 2 | - | |
EC 4 | 4.1 | 碳 - 碳裂解酶 | - | 3 |
裂解酶 | 4.2 | 碳 - 氧裂解酶 | 1 | - |
4.3 | 碳 - 氮裂解酶 | 1 | - | |
酶的数量小计 | 197 | 53 | ||
酶的总数目(不包括重叠酶) | 211 |
表1:制备对硝基苯酚或酚从布伦达数据库酶的数量。
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Discussion
提高生物催化剂的生产效率是生物化工为主业9和宏基因组成功的关键被认为是最好的天然酶源之一。在这个意义上说,它是从那里大多数遗传资源还没有被开发10的宏基因组筛选新酶是必不可少的。几种筛选方法已经开发了使用转录激活11,12直接检测酶的产品,但这些技术需要特定代谢物应答转录系统。另一方面,GESS根据使用的苯酚或PNP标记底物是广泛适用的。虽然大多数报道酶生产苯酚或PNP化合物BRENDA数据库( 表1),(包括在这项工作中的三个例子)的属于水解酶(EC号3)类的酶,探索更多样化的酚类底物,甚至在设计的人工基板进行目标酶的活性,作为天然底物的替代品,可以显著延长筛选系统的适用性。需要注意的是选择合适的酚或PNP标签的基材是由于基板很大影响筛查方案的膜通透性和细胞作用的PNP-GESS应用的关键步骤之一。这里,我们表明,在工业上重要的三种不同类型的酶可以以高通量的方式使用单筛选系统来识别。
使用FACS的方法中,除了宏基因组酶的高通量筛选,也可以应用到改变的TR特异性工程转录调节(TRS)。一个例子是其中所检测到甲羟戊酸代替阿拉伯糖的阿糖胞苷变体使用FACS分离,然后用来制备甲羟戊酸13屏幕的细胞的研究。此外,红素的特异性的改变已经允许菲尔特酶的活性呃工程。自动调节的TR,PcaU,被改造以检测3,4-二羟基苯(34DHB),然后应用于筛选在源性dehydroshikimate转换为34DHB 14的其最大活性dehydroshikimate脱水酶(AsbF)。这些研究的基本概念是类似的pNP-GESS的,因为的pNP-GESS使用DMPR变体以检测PNP和示出了在从一个大型基因库筛选的高通量性能。然而,特异性工程可能会导致意想不到的误报命中当中,因为它有可能以触发其他诱导报告基因的表达作为拓宽特异性的结果。因此,人们希望在施加TR之前调查TR响应的正交性。另一方面,增加的敏感性和对TR的动态范围可以补偿假阳性的产生。例如,GESS的灵敏度是通过将优化RBS和终止子色曲改善分配办法到系统中。安检系统的误报可能来自遗传电路发生故障,无意酚类化学物质激活TR,异质细胞生长,酚或PNP的自由扩散。步骤2.1的阴性选择过程 - 2.9预计将去除假阳性细胞释放荧光,而不基板处理。可以通过信号的遗传电路的信噪比最大化来也降低这些假阳性细胞。随着RBS和终止工程,使用M9葡萄糖媒体显著改善信号(7倍LB培养基更高)的的PNP-GESS 5的性能。但是,在这个协议中,LB用作未知宏基因组的基因表达和GESS信号强度之间的折衷。调查的M9葡萄糖的pNP-GESS细胞生长和衬底效应的更微妙的条件,可以提高信号的强度。的基板的反应时间紧调节,在步骤3.5,是也很重要,以防止由苯酚或PNP扩散触发误报。
GESS使酶功能转换成转录介导报告蛋白表达在单细胞水平,但通过报告蛋白的间接鉴定可能是先天限制之一。因此,体外酶测定法和产物的LC / GC-MS分析需要遵循为推定的酶的候选6,7的明确鉴定。也有可能通过附加的替代记者使用GESS而不需要昂贵的FACS分析,如抗生素抗性基因或具有荧光报告生色酶。用于GESS应用进一步的改进,有必要建立表征酶活性,并确定在高通量方式酶的方法。连同其他高通量技术,如新一代测序,GESS将是蛋白质和enzy一种广泛使用的战略在基于生物产业我催化剂工程。
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Materials
Name | Company | Catalog Number | Comments |
CopyControl | Epicentre | CCFOS110 | Fosmid library production kit |
CopyControl Induction Solution | Epicentre | CCIS125 | Fosmid copy induction solution |
EPI300 | Epicentre | EC300110 | Electrocompetent cell |
pCC1FOS | Epicentre | CCFOS110 | Fosmid vector |
Gene Pulser Mxcell | Bio-Rad | Electroporation cuvette and electroporate system | |
FACSAria III | Becton Dickinson | Flow Cytometry (FACS machine) | |
AZ100M | Nikon | Microscope | |
UltraSlim | Maestrogen | LED illuminator | |
50-ml conical tube | BD Falcon | ||
14-ml round-bottom tube | BD Falcon | ||
5-ml round-bottom tube | BD Falcon | ||
p-nitrophenyl phosphate | Sigma-Aldrich | N7653 | Substrate |
p-nitrophenyl β-D-cellobioside | Sigma-Aldrich | N5759 | Substrate |
p-nitrophenyl butylate | Sigma-Aldrich | N9876 | Substrate |
Luria-Bertani (LB) | BD Difco | 244620 | Tryptone 10 g/L, Yeast extract 5 g/L, Sodium Chloride 10 g/L |
Super Optimal broth (SOB) | BD Difco | 244310 | Tryptone 20 g/L, Yeast extract 5 g/L, Sodium Chloride 0.5 g/L, Magnesium Sulfate 2.4 g/L, Potassium Chloride 186 mg/L |
Super Optimal broth with Catabolite repression (SOC) | SOB, 0.4 % glucose | ||
2x Yeast Extract Tryptone (2xYT) | BD Difco | 244020 | Pancreatic digest of Casein 16 g/L, Yeast extract 10 g/L, Yeast extract 5 g/L |
Cell storage media | 2x YT broth, 15% Glycerol, 2% Glucose | ||
pGESS(E135K) | A DNA vector containing dmpR, egfp genes with their appropriate promoters, RBS, and terminator. See the reference 5 in the manuscript for more details. |
||
Chloramphenicol | Sigma | C0378 | |
Ampicillin | Sigma | A9518 | |
BD FACSDiva | Becton Dickinson | Flow Cytometry Software Version 7.0 | |
PBS | Gibco | 70011-044 | 0.8% NaCl, 0.02% KCl, 0.0144% Na2HPO4, 0.024% KH2OP4, pH 7.4 |
References
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