Multi-enzym screening met een hoge verwerkingscapaciteit Genetische screening Enzyme System
Summary
This work presents a method of high-throughput screening using a universal genetic enzyme screening system that can be theoretically applied to over 200 enzymes. Here, the single screening system identifies three different enzymes (lipase, cellulase, and alkaline phosphatase) by simply changing the substrate used (p-nitrophenyl acetate, p-nitrophenyl-β-D-cellobioside, and phenyl phosphate).
Abstract
The recent development of a high-throughput single-cell assay technique enables the screening of novel enzymes based on functional activities from a large-scale metagenomic library1. We previously proposed a genetic enzyme screening system (GESS) that uses dimethylphenol regulator activated by phenol or p-nitrophenol. Since a vast amount of natural enzymatic reactions produce these phenolic compounds from phenol deriving substrates, this single genetic screening system can be theoretically applied to screen over 200 different enzymes in the BRENDA database. Despite the general applicability of GESS, applying the screening process requires a specific procedure to reach the maximum flow cytometry signals. Here, we detail the developed screening process, which includes metagenome preprocessing with GESS and the operation of a flow cytometry sorter. Three different phenolic substrates (p-nitrophenyl acetate, p-nitrophenyl-β-D-cellobioside, and phenyl phosphate) with GESS were used to screen and to identify three different enzymes (lipase, cellulase, and alkaline phosphatase), respectively. The selected metagenomic enzyme activities were confirmed only with the flow cytometry but DNA sequencing and diverse in vitro analysis can be used for further gene identification.
Introduction
Een recent ontwikkelde high-throughput assay eencellige techniek maakt nieuwe enzymen te screenen van een grote bibliotheek genetische basis van hun functionele activiteiten 1. Bij de enkele cel niveau worden eiwitten die transcriptie gebruikt voor reportergenexpressie te activeren door het aftasten van kleine moleculen die worden geproduceerd als gevolg van een doel enzymactiviteit. Een eerste benadering betrof de isolatie van een fenol-afbrekende operon van Ralstonia eutropha E2 met de substraat-geïnduceerde genetische expressiescreenen (SIGEX) methode, waarbij het substraat induceert de expressie van een reporter proteïne 2. Nhar van Pseudomonas putida werd gebruikt om benzaldehyde dehydrogenase 3 selecteren en LysG van Corynebacterium glutamicum werd gebruikt voor high-throughput screening van een nieuwe-L-lysine producerende stam van diverse mutante bibliotheken 4.
Voorheen, een genetische enzym screening systeem (GESS) werd voorgesteld als een algemeen geldend screening platform 5. Dit systeem maakt gebruik van de met fenol herkennen dimethylfenol regulator DMPr, P. putida. DMPr (E135K) en een mutant van DMPr, kan ook worden toegepast in GESS (pNP-GESS) voor de detectie van p-nitrofenol (pNP). In aanwezigheid van het doel enzymen produceren fenolverbindingen, GESS in E. coli-cellen geeft een fluorescentiesignaal, zodat de snelle isolatie van afzonderlijke cellen met behulp van een fluorescentie-geactiveerde celsortering (FACS). Maar de expressie van metagenomic enzym lijkt zwakker dan die van conventionele recombinant-enzymen; Daarom GESS ontworpen om fenolverbindingen met maximale gevoeligheid gedetecteerd door het onderzoeken van de combinatie van ribosomale bindingsplaats (RBS) en terminatorsequenties met optimale bedrijfstoestand 5.
Een van de fundamentele voordelen van GESS is dat deze enkele methode theorie maakt de screening van over dan 200 verschillende typen enzymen in de BRENDA gegevensbank (Tabel 1, http: // www.brenda-enzymes.info, 2013,7) door eenvoudigweg gebruik verschillende substraten. Er werd aangetoond dat cellulase, lipase en methyl parathion hydrolase (MPH) kunnen worden gedetecteerd onder toepassing pNP-GESS met geschikt substraat p-nitrofenyl butyraat, p-nitrofenyl cellotrioside en methyl parathion respectievelijk 5. Recent werd aangetoond dat een alkalische fosfatase (AP), die één van de nieuwe enzymen geïdentificeerd middels pNP-GESS, is de eerste thermolabiele AP in koude aangepast marine metagenomes 6.
Hier, details van de screening wordt gepresenteerd pNP-GESS detecteren van de activiteiten van drie verschillende soorten enzymes- lipase, cellulase, en alkalische fosfatase; en snel vast kandidaatcomponenten enzymen uit een bibliotheek metagenomic 5,6. De werkwijzen omvatten metagenoom voorbewerking met PNP GESS en de exploitatie van een flow cytometrie sorter. Terwijl het verkregen treffers moeten worden gesequenced voor verdere identificatie Dit protocol omvat de procedure bij het trapje enzym bevestiging activiteit met flowcytometrie.
Protocol
Representative Results
Discussion
Het verhogen van de productie-efficiëntie van biokatalysatoren is een sleutel voor het succes van de bio-chemische gebaseerde industrie 9 en metagenoom wordt beschouwd als een van de beste natuurlijke enzym bron. In dit opzicht is het essentieel om screening nieuwe enzymen van de metagenoom waarbij meeste genetische middelen niet onderzocht 10. Verschillende screeningswerkwijzen ontwikkeld die direct detecteren enzymproducten via transcriptionele activators 11, 12 maar deze technieken v…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This research was supported by grants from the Intelligent Synthetic Biology Center of Global Frontier Project (2011-0031944), the Next-Generation Biogreen 21 Program (PJ009524), NRF-2015M3D3A1A01064875 and the KRIBB Research Initiative Program.
Materials
| CopyControl | Epicentre | CCFOS110 | Fosmid library production kit |
| CopyControl Induction Solution | Epicentre | CCIS125 | Fosmid copy induction solution |
| EPI300 | Epicentre | EC300110 | Electrocompetent cell |
| pCC1FOS | Epicentre | CCFOS110 | Fosmid vector |
| Gene Pulser Mxcell | Bio-Rad | Electroporation cuvette and electroporate system | |
| FACSAria III | Becton Dickinson | Flow Cytometry (FACS machine) | |
| AZ100M | Nikon | Microscope | |
| UltraSlim | Maestrogen | LED illuminator | |
| 50-mL conical tube | BD Falcon | ||
| 14-mL round-bottom tube | BD Falcon | ||
| 5-mL round-bottom tube | BD Falcon | ||
| p-nitrophenyl phosphate | Sigma-Aldrich | N7653 | Substrate |
| p-nitrophenyl β-D-cellobioside | Sigma-Aldrich | N5759 | Substrate |
| p-nitrophenyl butylate | Sigma-Aldrich | N9876 | Substrate |
| Luria- Bertani (LB) | BD Difco | 244620 | Tryptone 10g/L, Yeast extract 5g/L, Sodium Chloride 10g/L |
| Super Optimal broth (SOB) | BD Difco | 244310 | Tryptone 20g/L, Yeast extract 5g/L, Sodium Chloride 0.5g/L, Magnesium Sulfate 2.4g/L, Potassium Chloride 186mg/L |
| Super Optimal broth with Catabolite repression (SOC) | SOB, 0.4 % glucose | ||
| 2x Yeast Extract Tryptone (2xYT) | BD Difco | 244020 | Pancreatic digest of Casein 16g/L, Yeast extract 10g/L, Yeast extract 5g/L |
| Cell storage media | 2xYT broth, 15 % Glycerol, 2 % Glucose | ||
| pGESS(E135K) | A DNA vector containing dmpR, egfp genes with their appropriate promoters, RBS, and terminator. See the reference 5 in the manuscript for more details. |
||
| Chloramphenicol | Sigma | C0378 | |
| Ampicillin | Sigma | A9518 | |
| BD FACSDiva | Becton Dickinson | Flow Cytometry Software Version 7.0 | |
| PBS | Gibco | 70011-044 | 0.8% NaCl, 0.02% KCl, 0.0144% Na2HPO4, 0.024% KH2OP4, pH 7.4 |
References
- Eggeling, L., Bott, M., Marienhagen, J. Novel screening methods-biosensors. Curr. Opin. Biotech. 35, 30-36 (2015).
- Uchiyama, T., Abe, T., Ikemura, T., Watanabe, K. Substrate-induced gene-expression screening of environmental metagenome libraries for isolation of catabolic genes. Nat. Biotechnol. 23 (1), 88-93 (2005).
- Van Sint Fiet, S., van Beilen, J. B., Witholt, B. Selection of biocatalysts for chemical synthesis. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 103 (6), 1693-1698 (2006).
- Binder, S., et al. A high-throughput approach to identify genomic variants of bacterial metabolite producers at the single-cell level. Genome Biol. 13 (5), R40 (2012).
- Choi, S., et al. Toward a generalized and High-throughput Enzyme Screening System Based on Artificial Genetic Circuits. ACS Synthetic Biology. 3 (3), 163-171 (2014).
- Lee, D. H., et al. A novel psychrophilic alkaline phosphatase from the metagenome of tidal flat sediments. BMC Biotechnology. 15 (1), (2015).
- Warnecke, F., et al. Metagenomic and functional analysis of hindgut microbiota of a wood-feeding higher termite. Nature. 450 (7169), 560-565 (2007).
- Kim, U. J., Shizuya, H., de Jong, P. J., Birren, B., Simon, M. I. Stable propagation of cosmid sized human DNA inserts in an F factor based vector. Nucleic Acids Research. 20 (5), 1083-1085 (1992).
- Jemli, S., Ayadi-Zouari, D., Hlima, H. B., Bejar, S. Biocatalysts: application and engineering for industrial purposes. Crc. Cr. Rev. Biotechn. 36 (2), 246-258 (2014).
- Lorenz, P., Eck, J. Metagenomics and industrial applications. Nat. Rev. Microbiol. 3 (6), 510-516 (2005).
- Uchiyama, T., Miyazaki, K. Product-induced gene expression, a product responsive reporter assay used to screen metagenomic libraries for enzyme encoding genes. Applied and environmental microbiology. 76 (21), 7029-7035 (2010).
- Mohn, W. W., Garmendia, J., Galvao, T. C., De Lorenzo, V. Surveying bio-transformations with à la carte genetic traps: translating dehydrochlorination of lindane (gamma-hexachlorocyclohexane) into lacZ-based phenotypes. Environmental microbiology. 8 (3), 546-555 (2006).
- Tang, S. Y., Cirino, P. C. Design and application of a mevalonate-responsive regulatory protein. Angew Chem. Int. Ed. 50 (5), 1084-1086 (2011).
- Jha, R. K., Kern, T. L., Fox, D. T., Strauss, C. E. M. Engineering an Acinetobacter regulon for biosensing and high-throughput enzyme screening in E. coli via flow cytometry. Nucleic Acids Res. 42 (12), 8150-8160 (2014).
