Çok enzim Yüksek verim Genetik Enzim Eleme Sisteminin Kullanılması Eleme
Summary
This work presents a method of high-throughput screening using a universal genetic enzyme screening system that can be theoretically applied to over 200 enzymes. Here, the single screening system identifies three different enzymes (lipase, cellulase, and alkaline phosphatase) by simply changing the substrate used (p-nitrophenyl acetate, p-nitrophenyl-β-D-cellobioside, and phenyl phosphate).
Abstract
The recent development of a high-throughput single-cell assay technique enables the screening of novel enzymes based on functional activities from a large-scale metagenomic library1. We previously proposed a genetic enzyme screening system (GESS) that uses dimethylphenol regulator activated by phenol or p-nitrophenol. Since a vast amount of natural enzymatic reactions produce these phenolic compounds from phenol deriving substrates, this single genetic screening system can be theoretically applied to screen over 200 different enzymes in the BRENDA database. Despite the general applicability of GESS, applying the screening process requires a specific procedure to reach the maximum flow cytometry signals. Here, we detail the developed screening process, which includes metagenome preprocessing with GESS and the operation of a flow cytometry sorter. Three different phenolic substrates (p-nitrophenyl acetate, p-nitrophenyl-β-D-cellobioside, and phenyl phosphate) with GESS were used to screen and to identify three different enzymes (lipase, cellulase, and alkaline phosphatase), respectively. The selected metagenomic enzyme activities were confirmed only with the flow cytometry but DNA sequencing and diverse in vitro analysis can be used for further gene identification.
Introduction
Son yıllarda geliştirilmiş olan, yüksek verimli tek hücreli deney tekniği yeni bir enzim işlevsel etkinlikler 1'e göre büyük ölçekli genetik kütüphaneden taranabilir sağlar. tek hücre düzeyinde, transkripsiyon düzenleyici proteinler, bir hedef enzim etkinliğinin bir sonucu olarak üretilen küçük molekülleri algılayarak raportör gen ekspresyonunu başlatmak için kullanılır. Buna bir yaklaşım, alt-tabaka bir raportör protein 2 ekspresyonunu indükler formül (SIGEX) yöntemini tarama alt-tabaka ile indüklenen gen ekspresyonunu kullanarak, Ralstonia eutropha E2 bir fenol-bozucu operonun izole çıkıyor. Pseudomonas putida NhaR benzaldehid dehidrojenazı 3 seçmek için kullanılır, ve Corynebacterium glutamicum LysG çeşitli mutant kütüphaneler 4 yeni bir L-Lizin üreten soyun yüksek verimli tarama kullanılmıştır.
Daha önce, bir genetik enzim screening sistemi (GESS) bir genel uygulanabilir bir tarama platformu 5 olarak önerilmiştir. Bu sistem P., DmpR fenol-tanıma dimetilfenol regülatör kullanır putida. DmpR (E135K) ve DmpR bir mutant, S. nitrofenolu (PNP) saptanması için gess (PNP-GESS) 'de kullanılabilmektedir. Fenolik bileşikleri üreten hedef enzimlerin varlığında, GESS E. coli hücreleri bir floresan-aktive edilmiş hücre ayırıcı (FACS) kullanılarak, tek hücrelerin hızlı izole edebilecek, bir floresan sinyali verir. Ancak metagenomic enzimin ekspresyonu geleneksel rekombinant enzimlerin daha zayıf görünmektedir; Bu nedenle, GESS uygun çalışma durumunda 5 ile birlikte ribozomal bağlanma yeri (RBS) ve terminatör dizileri ve kombinasyonunu araştırırken en fazla hassasiyet fenolik bileşikleri tespit etmek için tasarlanmıştır.
Gess temel avantajlarından biri bu tek yöntem teorik olarak ov taranmasını izin vermesidirBRENDA veritabanında enzimlerin er 200'den fazla farklı türleri (Tablo 1, http: // www.brenda-enzymes.info, 2013,7) sadece farklı substratlar kullanılarak. O selülaz lipaz gördü ve metil paration hidrolaz (MPH) p-nitrofenil butirat, p-nitrofenil-cellotrioside ve metil paration, sırasıyla, 5, uygun substratlann PNP-gess kullanılarak tespit edilebilir. Son zamanlarda, bu PnP-gess kullanılarak tanımlanan yeni enzim biri bir alkalin fosfataz (AP), soğuğa uyarlanmış deniz metagenomes 6'da bulunan ilk termal olarak AP olduğu kanıtlanmıştır.
Burada tarama işleminin detayları PnP-GESS bir metagenomic kütüphane 5,6 arasında yeni aday enzimleri belirlenmesi hızlı enzimleri, lipaz, selülaz ve alkalin fosfataz, üç farklı türde aktivitelerini tespit -ve sunulmuştur. süreçler metagenome PnP-gess ile önişleme ve bir fl işletim dahilsitometri sıralayıcı ow. Elde edilen isabetleri fazla tanımlama için dizilenmiştir gerekir ise, bu protokol akış sitometrisi kullanılarak enzim aktivitesi onay işlemine prosedürünü kapsamaktadır.
Protocol
Representative Results
Discussion
Biyokatalizörler üretim verimliliğinin arttırılması en doğal enzim kaynaklarından biri olarak kabul edilir sanayi 9 ve metagenome bazlı biyo-kimyasal başarısı için bir anahtardır. Bu anlamda, bu genetik kaynakları çoğunluğu 10 keşfedilmemiş olan metagenome elde edilen yeni enzimler tarama için gereklidir. Çeşitli tarama yöntemleri doğrudan kopyalama etkinleştiricileri 11, 12 kullanılarak enzim ürünlerinin tespit geliştirilmiştir, fakat bu teknikler, belirli…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This research was supported by grants from the Intelligent Synthetic Biology Center of Global Frontier Project (2011-0031944), the Next-Generation Biogreen 21 Program (PJ009524), NRF-2015M3D3A1A01064875 and the KRIBB Research Initiative Program.
Materials
| CopyControl | Epicentre | CCFOS110 | Fosmid library production kit |
| CopyControl Induction Solution | Epicentre | CCIS125 | Fosmid copy induction solution |
| EPI300 | Epicentre | EC300110 | Electrocompetent cell |
| pCC1FOS | Epicentre | CCFOS110 | Fosmid vector |
| Gene Pulser Mxcell | Bio-Rad | Electroporation cuvette and electroporate system | |
| FACSAria III | Becton Dickinson | Flow Cytometry (FACS machine) | |
| AZ100M | Nikon | Microscope | |
| UltraSlim | Maestrogen | LED illuminator | |
| 50-mL conical tube | BD Falcon | ||
| 14-mL round-bottom tube | BD Falcon | ||
| 5-mL round-bottom tube | BD Falcon | ||
| p-nitrophenyl phosphate | Sigma-Aldrich | N7653 | Substrate |
| p-nitrophenyl β-D-cellobioside | Sigma-Aldrich | N5759 | Substrate |
| p-nitrophenyl butylate | Sigma-Aldrich | N9876 | Substrate |
| Luria- Bertani (LB) | BD Difco | 244620 | Tryptone 10g/L, Yeast extract 5g/L, Sodium Chloride 10g/L |
| Super Optimal broth (SOB) | BD Difco | 244310 | Tryptone 20g/L, Yeast extract 5g/L, Sodium Chloride 0.5g/L, Magnesium Sulfate 2.4g/L, Potassium Chloride 186mg/L |
| Super Optimal broth with Catabolite repression (SOC) | SOB, 0.4 % glucose | ||
| 2x Yeast Extract Tryptone (2xYT) | BD Difco | 244020 | Pancreatic digest of Casein 16g/L, Yeast extract 10g/L, Yeast extract 5g/L |
| Cell storage media | 2xYT broth, 15 % Glycerol, 2 % Glucose | ||
| pGESS(E135K) | A DNA vector containing dmpR, egfp genes with their appropriate promoters, RBS, and terminator. See the reference 5 in the manuscript for more details. |
||
| Chloramphenicol | Sigma | C0378 | |
| Ampicillin | Sigma | A9518 | |
| BD FACSDiva | Becton Dickinson | Flow Cytometry Software Version 7.0 | |
| PBS | Gibco | 70011-044 | 0.8% NaCl, 0.02% KCl, 0.0144% Na2HPO4, 0.024% KH2OP4, pH 7.4 |
References
- Eggeling, L., Bott, M., Marienhagen, J. Novel screening methods-biosensors. Curr. Opin. Biotech. 35, 30-36 (2015).
- Uchiyama, T., Abe, T., Ikemura, T., Watanabe, K. Substrate-induced gene-expression screening of environmental metagenome libraries for isolation of catabolic genes. Nat. Biotechnol. 23 (1), 88-93 (2005).
- Van Sint Fiet, S., van Beilen, J. B., Witholt, B. Selection of biocatalysts for chemical synthesis. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 103 (6), 1693-1698 (2006).
- Binder, S., et al. A high-throughput approach to identify genomic variants of bacterial metabolite producers at the single-cell level. Genome Biol. 13 (5), R40 (2012).
- Choi, S., et al. Toward a generalized and High-throughput Enzyme Screening System Based on Artificial Genetic Circuits. ACS Synthetic Biology. 3 (3), 163-171 (2014).
- Lee, D. H., et al. A novel psychrophilic alkaline phosphatase from the metagenome of tidal flat sediments. BMC Biotechnology. 15 (1), (2015).
- Warnecke, F., et al. Metagenomic and functional analysis of hindgut microbiota of a wood-feeding higher termite. Nature. 450 (7169), 560-565 (2007).
- Kim, U. J., Shizuya, H., de Jong, P. J., Birren, B., Simon, M. I. Stable propagation of cosmid sized human DNA inserts in an F factor based vector. Nucleic Acids Research. 20 (5), 1083-1085 (1992).
- Jemli, S., Ayadi-Zouari, D., Hlima, H. B., Bejar, S. Biocatalysts: application and engineering for industrial purposes. Crc. Cr. Rev. Biotechn. 36 (2), 246-258 (2014).
- Lorenz, P., Eck, J. Metagenomics and industrial applications. Nat. Rev. Microbiol. 3 (6), 510-516 (2005).
- Uchiyama, T., Miyazaki, K. Product-induced gene expression, a product responsive reporter assay used to screen metagenomic libraries for enzyme encoding genes. Applied and environmental microbiology. 76 (21), 7029-7035 (2010).
- Mohn, W. W., Garmendia, J., Galvao, T. C., De Lorenzo, V. Surveying bio-transformations with à la carte genetic traps: translating dehydrochlorination of lindane (gamma-hexachlorocyclohexane) into lacZ-based phenotypes. Environmental microbiology. 8 (3), 546-555 (2006).
- Tang, S. Y., Cirino, P. C. Design and application of a mevalonate-responsive regulatory protein. Angew Chem. Int. Ed. 50 (5), 1084-1086 (2011).
- Jha, R. K., Kern, T. L., Fox, D. T., Strauss, C. E. M. Engineering an Acinetobacter regulon for biosensing and high-throughput enzyme screening in E. coli via flow cytometry. Nucleic Acids Res. 42 (12), 8150-8160 (2014).
