Introduction
Uma técnica de ensaio de uma única célula de alto rendimento recentemente desenvolvido permite novas enzimas a ser rastreada a partir de uma biblioteca genética em larga escala com base nas suas actividades funcionais 1. No nível de célula única, as proteínas que regulam a transcrição são empregues para provocar a expressão do gene repórter por detecção pequenas moléculas que são produzidos como um resultado de uma actividade da enzima alvo. Uma abordagem precoce envolvido o isolamento de um operão de fenol-degradantes de Ralstonia eutropha E2 utilizando a expressão genética induzida por substrato rastreio método (SIGEX), em que o substrato induz a expressão de uma proteína repórter 2. NHAr de Pseudomonas putida foi usado para seleccionar benzaldeído desidrogenase 3, e de Corynebacterium glutamicum LysG foi utilizado para o rastreio de alto rendimento de uma nova estirpe de L-lisina-produzir diversas bibliotecas de mutantes 4.
Anteriormente, uma enzima screeni genéticasistema ng (GESS) foi proposta como uma plataforma de triagem geralmente aplicável 5. Este sistema utiliza o regulador dimetilfenol-reconhecendo fenol, DMPR, de P. putida. DMPR (E135K), e um mutante de DMPR, também pode ser empregue em GESS (PNP-GESS) para a detecção de p-nitrofenol (PNP). Na presença de enzimas alvo a produção de compostos fenólicos, GESS em E. células de E. coli emite um sinal de fluorescência, permitindo o isolamento rápido de células isoladas usando um classificador de células activadas por fluorescência (FACS). Mas a expressão da enzima metagenômico parece ser mais fraca do que a de enzimas recombinantes convencionais; portanto, GESS foi desenhado para detectar compostos fenólicos com o máximo de sensibilidade ao investigar a combinação de local de ligação ribossómica (RBS) e sequências de terminação junto com ótima condição operacional 5.
Uma das vantagens fundamentais do GESS é que este método único permite teoricamente o rastreio de OVer de 200 tipos diferentes de enzimas na base de dados BRENDA (Tabela 1, http: // www.brenda-enzymes.info, 2013.7) simplesmente empregar substratos diferentes. Foi mostrado que a celulase, lipase e hidrolase metil paration (MPH) pode ser detectada utilizando PNP-GESS com substratos apropriados de p-nitrofenilo butirato, p-nitrofenil-cellotrioside, e metil paration, respectivamente 5. Recentemente, provou-se que uma fosfatase alcalina (AP), que é uma das novas enzimas identificadas utilizando PNP-GESS, é o primeiro AP termolábil encontrados em metagenomes marinhos adaptados ao frio 6.
Aqui, os detalhes do processo de triagem é apresentado com PNP-GESS detectar as actividades de três tipos diferentes de lipase enzymes-, celulase, e fosfatase alcalina -e rapidamente identificar novas enzimas candidatas a partir de uma biblioteca metagenômico 5,6. Os processos incluem metagenome pré-processamento com PNP-GESS e operação de uma flow citometria classificador. Enquanto os acertos obtidos terão de ser sequenciado para posterior identificação, este protocolo abrange o procedimento acima para os passos de confirmação de actividade enzimática utilizando citometria de fluxo.
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Protocol
1. Preparação da biblioteca metagenômica com PNP-GESS
- Construir uma biblioteca metagenômica em E. coli com um vector fosmid usando um kit de produção fosmid biblioteca de acordo com o protocolo do fabricante 5.
- Alíquota de 100 ul da biblioteca, para armazenamento a -70 ° C, que é uma fonte de células de biblioteca metagenomic.
Nota: A densidade óptica de uma amostra medida a um comprimento de onda de 600 nm (OD 600) deste estoque biblioteca é de aproximadamente 100. - Descongelar 100 ul da biblioteca metagenômico estoque em gelo e em inocular um balão de 500 ml contendo 50 ml de meio Luria-Bertani (LB) e 12,5 ug / ml de cloranfenicol seguido de 37 ° C de incubação, durante 2 h.
- Colher as células num tubo de 50 ml por centrifugação a 1000 xg durante 20 min a 4 ° C.
- Ressuspender o sedimento rapidamente em 50 ml de água destilada gelada (DW) e centrifugar a 1000 xg durante 20 min a 4 ° C novamente.
- Resuspend o sedimento em 50 ul DW gelada com 10% (v / v) de glicerol. Utilizar 50 ul desta alíquota de células para electroporação.
- Coloque a mistura de células electrocompetentes de 50 ul e pGESS (E135K) 5 de DNA (100 ng) numa cuvete de electroporação arrefecido em gelo e electroporar (1,8 kV / cm, 25 mF) a mistura.
- adicionar rapidamente 1 ml de super caldo ideal com catabólica repressão médio (SOC) e voltar a suspender as células suavemente.
- Transferir as células para um tubo de 14 ml de fundo redondo, usando uma pipeta e incubar a 37 ° C durante 1 h.
- Espalhe 500 ul das células recuperadas numa LB 20 x 20 cm placa quadrada contendo 12,5 ug / ml de cloranfenicol e 50 jig / ml de ampicilina. Incubar a placa a 30 ° C durante 12 h.
- Raspe as colónias usando um raspador de células e recolher células em um tubo cônico de 50 ml utilizando meios de armazenamento de células gelada.
- Centrifugar a 1.000 xg durante 20 min a 4 ° C. Ressuspender o sedimento em 10 ml de mídia de armazenamento de células geladaspara chegar a um OD 600 de 100.
- Aliquota de 20 uL de células para armazenamento a -70 ° C.
2. Remoção falsos positivos a partir da biblioteca metagenômica
- Descongelar as células ações metagenomic biblioteca (do passo 1.13) contendo fosmid DNA metagenômica e pGESS (E135K) em gelo.
- Inocular 10 ml de células em 2 ml de LB contendo 50 ug / ml de ampicilina e 12,5 jig / ml de cloranfenicol em um tubo de fundo redondo de 14 ml. Incubar a 37 ° C com agitação a 200 rpm durante 4 h.
- Enquanto isso, ligue a máquina de FACS e abra o software FACS padrão. Utilize as seguintes definições: diâmetro da ponta do bico, 70 mm; Adiante Área de Dispersão (-A FSC) sensibilidade, 300 amplificação V-logarítmica; Side Area Scatter (-A SSC) Sensibilidade, 350 amplificação V-logarítmica; Área fluoresceína isotiocianato (FITC-A) sensibilidade, a amplificação de 450 V-logarítmica; parâmetro de patamar, FSC-Um valor 5.
Nota: As configurações mais comuns são fornecidaspara o dispositivo de FACS mencionado na tabela de materiais. Ajustar as configurações para outros dispositivos de FACS. - Dilui-se as células a partir de bibliotecas metagenomic Passo 2.2 pela adição de 5 ul da amostra para um tubo de fundo redondo de 5 ml contendo 1 ml de PBS.
- Colocar a amostra biblioteca diluída para o porto de carga do instrumento FACS e clique no botão de carga no Aquisição Painel do software FACS.
- Ajustar a taxa de evento para 1.000 - 1.500 eventos / seg clicando e controlar os botões Taxa de fluxo no painel.
- Criar log escalado FSC-A vs. log escalado SSC-Um gráfico de dispersão em uma planilha global, clicando no botão gráfico de pontos na barra de ferramentas. Ajuste o portão de dispersão R1 para abranger os eventos singlet (população bacteriana) usando o botão Polígono Gate na barra de ferramentas.
- Traçar um histograma com a contagem de células vs. log escalado FITC-A na planilha clicando no botão histograma. Em seguida, ajuste a tensão FITC do CytomeTer separador Definições na janela de Controlo Inspector de tal modo que o pico da distribuição em forma de sino é inferior a 10 2 de FITC-A.
- Criar um log escalado FSC-A vs. o log FITC-A trama clicando no botão gráfico de pontos na planilha global. Definir um portão triagem R2 no terreno utilizando o botão de porta polígono na barra de ferramenta, de modo que a porta está localizada entre as células + 5% e -5% do centro da distribuição (10% total de células em torno do pico de a de sino curva em forma).
- Colocar num tubo de recolha contendo 1,2 ml de LB contendo 50 ug / ml de ampicilina e 12,5 jig / ml de cloranfenicol na saída do instrumento FACS e classificar 10 6 células que satisfaçam ambos os R1 e R2 portas.
- Retire o tubo de coleta, boné, e gentilmente vortex.
3. metagenômico Enzyme Screening
- Incubar as células escolhidas (do passo 2.11) a 37 ° C com agitação a 200 rpm até a DO600 atinge 0,5.
- Adicionar 1 ml copiar solução de indução para amplificar o número de cópias fosmid intracelular. Incubam-se as células durante mais 3 horas adicionais a 37 ° C com agitação a 250 rpm.
- Para preparar as células para seleccionar, adicionar 0,5 ml de células em cultura e de um substrato adequado (p-nitrofenil de etilo, p-nitrofenil-β-D-celobiósido, fosfato ou fenilo) para um tubo de 14 ml de fundo redondo numa concentração final de 100 uM.
- Para uma amostra de controlo, adicionar 0,5 ml de células cultivadas a partir do Passo 3.2 para um tubo de fundo redondo de 14 ml. Adicionar o mesmo volume de PBS como o volume do substrato no passo 3.3.
- Incubam-se as duas amostras, a 37 ° C com agitação a 200 rpm durante 3 h.
- Ao mesmo tempo, preparar a máquina de FACS com as mesmas configurações que o passo 2.3.
- Adicionar 5 uL de células (para selecção), e células de controlo para dois tubos de 5 ml de fundo redondo contendo 1 ml de PBS, respectivamente.
- Colocar o tubo contendo células de controle para tele porto de carregamento dos FACS e clique no botão Carregar na Aquisição Painel do software FACS. Ajustar a taxa de eventos para 1.000 - 3.000 eventos / seg, controlando Taxa de Fluxo botões no painel.
- Log criar escalado FSC-A vs. log escalado SSC-Um gráfico de dispersão, clicando no botão gráfico de pontos na planilha global do software e ajustar o portão de dispersão R1 para abranger os eventos singlet (população bacteriana) utilizando o botão Polígono Portão sobre o barra de ferramentas.
- Log criar escalado FSC-A vs. log escalado FITC-Um gráfico de dispersão, clicando no botão gráfico de pontos na planilha e definir uma classificação portão R2 no terreno utilizando o botão Polígono Portão na barra de ferramentas para que menos de 0,1% de células negativas são detectados dentro do portão R2.
- Substitua o tubo de amostra de controlo com o tubo de amostra de triagem, e ajustar a taxa de evento para 1.000 - 3.000 eventos / seg, controlando os botões Taxa de fluxo no painel.
- Coloque um tubo de coleta contendo 0,5ml LB na saída do instrumento FACS e resolver 10 4 células que satisfaçam ambas as portas R1 e R2.
Nota: O critério de ordenação pode variar de topo de 0,1% a 5% de FITC-A na porta R2. Neste protocolo, as células top 1% foram recolhidos como positivos. - Retire o tubo de coleta, boné, e gentilmente vortex.
- Espalhe as amostras de 0,5 ml recolhidos em duas placas de ágar (90 mm de placas de Petri) contendo LB, 50 ug / ml de ampicilina, 12,5 ug / ml de cloranfenicol e Incubar a placa a 37 ° C durante a noite.
- Se necessário, execute rodadas adicionais de triagem para FITC-A enriquecimento, repetindo as etapas 3.1-3.14.
4. Hit Confirmação Seleção e atividade enzimática
- Citometria de fluxo Análise
- A partir da placa incubada na Etapa 3.14, selecione uma colônia mostrando ausência de fluorescência usando um seletor de colônia sob a observação de 488 nm de comprimento de onda de um iluminador LED.
- Inocular a colônia selecionado em um 14 ml ro-und fundo do tubo contendo 2 ml de LB contendo 50 ug / ml de ampicilina e 12,5 jig / ml de cloranfenicol a 37 ° C com agitação a 200 rpm até a DO600 atinge 0,5.
- Adicione 2 mL copiar solução de indução para amplificar o número de cópias fosmid intracelular. Incubam-se as células durante mais 3 horas adicionais a 37 ° C com agitação a 250 rpm.
- Preparar um tubo de 14 ml de fundo redondo e adicionar 1 ml de células em cultura (passo 4.1.3). Adicionar um substrato adequado (acetato de p-nitrofenilo, p -nitrophenyl- β -D-celobiósido, ou fosfato de fenilo) a uma concentração final de 100 uM.
- Para um controlo, adicionar 1 ml das células de cultura do passo 4.1.3 em um tubo de 14 ml de fundo redondo e adicionar o mesmo volume de PBS como o volume do substrato no passo 4.1.4.
- Incubam-se as duas amostras, a 37 ° C com agitação a 200 rpm durante 3 h.
- Enquanto isso, prepare a máquina FACS com as mesmas configurações como Passo 2.3.
- Adicionar 5 uL das células de controlo e substrato tratado para tubos de 5 ml de fundo redondo contendo 1 ml de PBS, respectivamente.
- Coloque as células controle tubo contendo no porto de carregamento do dispositivo FACS e clique no botão Carregar na Aquisição Painel do software FACS. Ajustar a taxa de evento para 1.000 - 3.000 eventos / seg usando Vazão botões no painel.
- Clique no botão Aquisição para medir FITC-A.
- Substituir o tubo de amostra de controlo com o tubo de amostra substrato tratado. Ajustar a taxa de evento para 1.000 - 3.000 eventos / seg usando Vazão botões no painel.
- Clique no botão Aquisição para medir FITC-A.
- Comparar a fluorescência dos dois grupos de células através da representação gráfica de um histograma de contagem de células vs o log dimensionado FITC-A.
- Outros ensaios para confirmar a actividade da enzima
- Para posterior identificação dos candidatos de enzimas selecionadas, extrair DNA fosmid usando pro extração padrãoprocedimentos dos kits de extração comerciais e analisar a sequência de nucleotídeos, ou testar a atividade enzimática in vitro 6,7.
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Representative Results
Os três substratos fenólicos foram examinados para identificar novas enzimas metagenomic de uma biblioteca metagenome de sedimentos planas oceano-corrente em Taean, Coreia do Sul, seguindo o protocolo proposto. Para a construção da biblioteca, média 30 - sequências metagenome 40 kb foram inseridos no fosmids, que são baseados na E. coli F fator de replicão e apresentados como uma única cópia de uma célula. Note-se que fosmids têm sido amplamente utilizados para a construção de bibliotecas genómicas complexos, devido à sua propagação estável 8.
A Figura 1 mostra um fluxograma de breve o protocolo de rastreio incluindo a remoção de falsos positivos com a classificação negativa (Figura 1 A), seguida por selecção positiva com sucesso R1 e R2 triagem portões (Figura 1 B). Os acertos foram avaliados por comparação da fluorescência das amostras com e sem substratos(Figura 1 C). No caso de acetato de p-nitrofenilo rastreio mediada, cinco candidatos de lipase foram confirmadas em que a fluorescência de células substrato tratado foram superiores aos das células de controlo (Figura 2 A). Apesar das amplas distribuições dos três candidatos de celulase na Figura 2 B, que também mostraram diferenças claras de intensidade média com FITC das populações. Quatro candidatos fosfatase também mostraram elevado nível de fluorescência em comparação com as células de controle (Figura 2 C). Quanto mais diferença de fluorescência entre as células negativas eo candidato a atividade da enzima mais forte podem ser deduzidas desde o repórter fluorescência do PNP-GESS mostra as respostas quantitativas para as concentrações de fenol 5.
Neste protocolo, apenas as diferenças de fluorescência foram confirmados utilizando uma citometria de fluxo, mas vários ensaios de identificação pode ser aplicado um4.2. s mencionados no Passo A Figura 3 demonstra o exemplo de identificação PA 6. Um clone seleccionado entre quarenta e sete colónias altamente fluorescente do rastreio foi sequenciado e uma ORF do candidato AP foi identificado. A ORF inserida num vector plasmídeo foi confirmada ter actividade de AP com citometria de fluxo. Na Figura 3, mostra o hit sinal de fluorescência mais forte do que as células portadoras do plasmídeo vazio (negativo). Outras análises de sequência e de actividade enzimática in vitro descobriu que este AP era altamente semelhante aos outros PAs conhecidos nas suas características enzimáticas, excepto elevada actividade catalítica a temperaturas mais baixas (35 ° C) e uma instabilidade térmica notável (65 ° C) dentro de 15 min 6 . Além disso, o AP protegida foi comparável ao disponível comercialmente APs na remoção de fosfatos terminais de extremidades coesivas e sem corte de ADN de plasmídeo linearizado 6.
Figura 1:. Multi Enzyme processo de seleção (A) Remoção de células falso-positivos que mostram fluorescência sem substrato. O portão de apartação estar localizado no meio da densidade de população de células de forma que a porta inclui 10% das células totais. (B) Triagem alta fluorescente (FITC-A), células positivas () satisfazendo portões R1 e R2, na presença de um substrato apropriado. (C) após a selecção e o isolamento de célula única, a actividade das enzimas candidatas foi analisada com e sem o substrato (denotado como W / W e substratos de E / S, respectivamente). A diferença sinal claro entre as duas amostras implica o vetor fosmid das células contém informação genética alvo de interesse. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Actividade Enzima Avaliação utilizando citometria de fluxo de enzimas candidatos metagenômico rastreados por pNP-GESS com três substratos diferentes (A) acetato de p-nitrofenilo (PNPA), (B) p-nitrofenil-β-D-celobiósido (pNPG2), e. (C) fosfato de fenilo. Todos os candidatos apresentaram diferença sinal claro entre as células com e sem substrato. Os controles são as células sem o seu tratamento substrato correspondente. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: Fosfatase Alcalina IDENTIFICAÇÃO. painel da esquerda mostra a fluorescência diferença clara entre as células que contêm o enzima e atingiu um vector de plasmídeo vazio (negativo). À direita, o ensaio de fosfatase de células contendo o gene da fosfatase candidato num vector plasmídeo em LB agar contendo fosfato de 5-bromo-4-cloro-3-indolilo como substracto colorimétrico é mostrado. colónias azuis indicam que as células seleccionadas contêm o gene que codifica uma fosfatase metagenômico. Veja 6 para mais detalhes. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
| Número da CE | Descrição | Número de enzimas produzindo p-nitrofenol | Número de enzimas do fenol produzindo | |
| CE 1 </ Td> | 1.3 | Agindo sobre o grupo CH-CH de doadores | - | 1 |
| Oxirredutases | 1.11 | Peroxygenase | 2 | - |
| 1.14 | Agindo sobre os doadores emparelhados, com a incorporação ou | - | 2 | |
| redução do oxigênio molecular | ||||
| CE 2 | 2.3 | aciltransferases | 1 | - |
| transferases | 2.4 | glicosiltransferases | 8 | - |
| 2.5 | grupos alquilo ou arilo de transferência, do que outros grupos metílicos | 1 | 1 | |
| 2.7 | A transferência de grupos contendo fósforo | 1 | 1 | |
| 2.8 | A transferência de grupos contendo enxofre | 3 | 1 | |
| CE 3 | 3.1 | Lei sobre ligações éster | 67 | 16 |
| hidrolases | 3.2 | glicosilase | 75 | 21 |
| 3.4 | Lei sobre ligações peptídicas - peptidase | 26 | 4 | |
| 3,5 | Lei sobre ligações carbono-azoto, excepto ligações peptídicas | 5 | 3 | |
| 3.6 | Lei sobre anidridos de ácidos | 4 | - | |
| 3.7 | Lei sobre ligações carbono-carbono | 2 | - | |
| CE 4 | 4.1 | liases carbono-carbono | - | 3 |
| liases | 4.2 | liases carbono-oxigênio | 1 | - |
| 4.3 | liases carbono-azoto | 1 | - | |
| número subtotal de enzimas | 197 | 53 | ||
| Número total de enzimas (excluindo enzimas sobrepostas) | 211 | |||
Tabela 1: O número de enzimas que produzem p-nitrofenol ou fenol a partir da base de dados BRENDA.
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Discussion
Aumentar a eficiência da produção de biocatalisadores é uma chave para o sucesso de bio-química indústria baseada 9 e metagenome é considerado um dos melhores fonte de enzima natural. Neste sentido, é essencial para o rastreio de novas enzimas a partir da metagenome onde a maioria dos recursos genéticos não têm sido explorados 10. Vários métodos de rastreio foram desenvolvidos que detectam directamente produtos enzimáticos utilizando activadores de transcrição 11, 12, mas estas técnicas exigem sistema específico de transcrição metabólito-responsivo. Por outro lado, GESS é amplamente aplicável dependendo do uso de fenol ou com etiquetas pNP substratos. Embora a maioria das enzimas relatados produzindo compostos fenólicos ou PNP na base de dados BRENDA (Tabela 1), (incluindo os três exemplos deste trabalho) pertencem à hidrolase (número 3 CE) enzimas de classe, explorando mais diversos substratos fenólicos e até mesmo a concepção de um artificial substrato submetendo aactividade da enzima alvo, como alternativas de substratos naturais, poderia estender significativamente a aplicabilidade do sistema de rastreio. Note-se que a escolha de um fenol apropriado ou com etiquetas pNP substrato é um dos passos importantes de aplicação PNP-GESS desde a permeabilidade da membrana celular e o efeito do substrato de influenciar consideravelmente o protocolo de rastreio. Aqui, mostramos que industrialmente importantes três tipos diferentes de enzimas pode ser identificada de um modo de elevado rendimento utilizando o sistema de triagem único.
A abordagem de utilizar FACS, para além da pesquisa de alto rendimento de enzimas metagenomic, pode ser também aplicado a engenharia reguladores transcricionais (TRs) para TR especificidade alterada. Um exemplo é um estudo em que uma variante de AraC que detectado mevalonato em vez de arabinose foi isolado usando FACS, e, em seguida, empregado para as células produtoras de tela 13 mevalonato. Além disso, a alteração da especificidade de ATR permitiu Further engenharia da actividade da enzima. TR auto-regulado, PCAU, foi concebida para detectar 3,4-di-hidroxibenzoato (34DHB) e, em seguida aplicado para o rastreio de enzimas desidratase desidroshikimato (AsbF) a sua actividade máxima de conversão desidroshikimato endógena para 34DHB 14. O conceito básico destes estudos é semelhante ao de PNP-GESS, desde PNP-GESS utiliza uma variante DMPR para detectar pNP e mostra o desempenho de alto rendimento no rastreio de uma biblioteca genética em larga escala. No entanto, a especificidade de engenharia pode provocar não intencionais falsos positivos entre as visitas, uma vez que é possível desencadear a expressão repórter por outros indutores, como resultado da especificidade alargada. Por conseguinte, seria desejável investigar a ortogonalidade de resposta TR antes de o TR é aplicado. Por outro lado, aumentando a sensibilidade e a gama dinâmica da TR poderia compensar geração falso positivo. Por exemplo, a sensibilidade de GESS foi melhorada através da inserção de RBS e optimizadas sequ terminadorcias no sistema. Os falsos positivos do sistema de triagem, possivelmente vêm de mau funcionamento do circuito genético, produtos químicos fenólicos não intencionais ativando o TR, o crescimento celular heterogênea, e difusão livre de fenol ou pNP. eram esperados 2,9 para remover as células falsos positivos liberação de fluorescência sem tratamento substrato - Os processos de seleção negativos de Passos 2.1. Estas células positivas falsas pode também ser reduzida através da maximização da relação sinal-ruído do circuito genético. Juntamente com o RBS e o terminador de engenharia, o uso de meios de M9-glicose melhorou significativamente o sinal (7 vezes mais elevada do que o meio LB) no desempenho PNP-GESS 5. Mas, neste protocolo, LB foi usado como um compromisso entre a expressão do gene metagenomic desconhecido e intensidade do sinal GESS. Investigar condições mais delicadas do crescimento celular e PNP-GESS efeito substrato em M9-glicose permite melhorar a intensidade do sinal. regulação apertada do tempo de reacção dos substratos, na Etapa 3.5, étambém importante para evitar falsos positivos desencadeadas por fenol ou difusão pNP.
GESS permite a conversão da função da enzima para a expressão da proteína repórter mediada por transcrição a um nível de uma única célula, mas a identificação indirecta através das proteínas repórter pode ser uma das limitações inatas. Então, ensaio in vitro enzima e LC / análise de GC-MS de um produto devem ser seguidos para a identificação definitiva de um candidato enzima putativa 6,7. Também é possível utilizar GESS sem a necessidade de uma análise FACS caros, anexando repórteres alternativos, tais como genes de resistência a antibióticos ou enzimas cromogénicos com repórteres fluorescentes. Para melhorar ainda mais as aplicações gess, é necessário estabelecer um método para caracterizar a actividade da enzima e identificar as enzimas de um modo de alto rendimento. Junto com outras tecnologias de alta capacidade, tais como sequenciamento de última geração, GESS será uma estratégia amplamente utilizada para a proteína e Enzyme engenharia catalisador na indústria baseada na biologia.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| CopyControl | Epicentre | CCFOS110 | Fosmid library production kit |
| CopyControl Induction Solution | Epicentre | CCIS125 | Fosmid copy induction solution |
| EPI300 | Epicentre | EC300110 | Electrocompetent cell |
| pCC1FOS | Epicentre | CCFOS110 | Fosmid vector |
| Gene Pulser Mxcell | Bio-Rad | Electroporation cuvette and electroporate system | |
| FACSAria III | Becton Dickinson | Flow Cytometry (FACS machine) | |
| AZ100M | Nikon | Microscope | |
| UltraSlim | Maestrogen | LED illuminator | |
| 50-ml conical tube | BD Falcon | ||
| 14-ml round-bottom tube | BD Falcon | ||
| 5-ml round-bottom tube | BD Falcon | ||
| p-nitrophenyl phosphate | Sigma-Aldrich | N7653 | Substrate |
| p-nitrophenyl β-D-cellobioside | Sigma-Aldrich | N5759 | Substrate |
| p-nitrophenyl butylate | Sigma-Aldrich | N9876 | Substrate |
| Luria-Bertani (LB) | BD Difco | 244620 | Tryptone 10 g/L, Yeast extract 5 g/L, Sodium Chloride 10 g/L |
| Super Optimal broth (SOB) | BD Difco | 244310 | Tryptone 20 g/L, Yeast extract 5 g/L, Sodium Chloride 0.5 g/L, Magnesium Sulfate 2.4 g/L, Potassium Chloride 186 mg/L |
| Super Optimal broth with Catabolite repression (SOC) | SOB, 0.4 % glucose | ||
| 2x Yeast Extract Tryptone (2xYT) | BD Difco | 244020 | Pancreatic digest of Casein 16 g/L, Yeast extract 10 g/L, Yeast extract 5 g/L |
| Cell storage media | 2x YT broth, 15% Glycerol, 2% Glucose | ||
| pGESS(E135K) | A DNA vector containing dmpR, egfp genes with their appropriate promoters, RBS, and terminator. See the reference 5 in the manuscript for more details. |
||
| Chloramphenicol | Sigma | C0378 | |
| Ampicillin | Sigma | A9518 | |
| BD FACSDiva | Becton Dickinson | Flow Cytometry Software Version 7.0 | |
| PBS | Gibco | 70011-044 | 0.8% NaCl, 0.02% KCl, 0.0144% Na2HPO4, 0.024% KH2OP4, pH 7.4 |
References
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