차별화 운명의 공간 조직을 프로빙에 대한 인간 다 능성 줄기 세포의 스텐실 미세화
Summary
인간 만능 줄기 세포 (hPSCs)는 차별화 별개의 조직 패턴으로 자기 조직하는 고유 능력을 가지고; 이 공간 환경 그라데이션의 표현을 필요로하지만. 우리 hPSC 분화 패턴을 제어하기위한 생화학 적 및 기계적 그라디언트를 생성하는 간단하고 강력한 방법으로서 공판 미세 패턴을 제시한다.
Abstract
Human pluripotent stem cells (hPSCs), including embryonic stem cells and induced pluripotent stem cells, have the intrinsic ability to differentiate into all three germ layers. This makes them an attractive cell source for regenerative medicine and experimental modeling of normal and diseased organogenesis. However, the differentiation of hPSCs in vitro is heterogeneous and spatially disordered. Cell micropatterning technologies potentially offer the means to spatially control stem cell microenvironments and organize the resultant differentiation fates. Micropatterning hPSCs needs to take into account the stringent requirements for hPSC survival and maintenance. Here, we describe stencil micropatterning as a method that is highly compatible with hPSCs. hPSC micropatterns are specified by the geometries of the cell stencil through-holes, which physically confine the locations where hPSCs can access and attach to the underlying extracellular matrix-coated substrate. Due to this mode of operation, there is greater flexibility to use substrates that can adequately support hPSCs as compared to other cell micropatterning methods. We also highlight critical steps for the successful generation of hPSC micropatterns. As an example, we demonstrate that stencil micropatterning of hPSCs can be used to modulate spatial polarization of cell-cell and cell-matrix adhesions, which in turn determines mesoendoderm differentiation patterns. This simple and robust method to micropattern hPSCs widens the prospects of establishing experimental models to investigate tissue organization and patterning during early embryonic development.
Introduction
배아 줄기 세포 (hESCs는)와 유도 만능 줄기 세포 (hiPSCs)를 포함하여 인간 만능 줄기 세포 (hPSCs)는, 널리 모든 세포 계통으로 인해 분화 가능성의 정상 및 병에 걸린 기관 형성의 실험 모델링뿐만 아니라 재생 의학에 이용된다 삼 배엽 1, 2. hPSCs의 분화 운명은 물리적 단서 3-5에 의해 매개 분비 또는 1 신호 분비뿐만 아니라 mechanotransduction 과정을 조절할 수 지역의 환경 요인에 매우 민감하다. 셀 미세화 공간적 예컨대 세포 – 세포 상호 작용 (6) 및 세포 – 매트릭스 상호 작용 (3)로서, 로컬 셀룰러 미세 환경을 제어하는 수단으로 세포 집단의 형상과 위치를 조직하기 위해 개발 된 기술의 집합을 포함한다. hPSCs의 맥락에서, 셀의 미세화가 틈새 – 의존 방식으로 유의 한 통찰력을 얻기 위해 사용되어왔다엔트 분비 신호는 초기 배아 분화 패턴 (6)에 hESC의 다 능성 분화 결정 (7)과 조직을 변조한다. 2D 및 3D 미세 패턴 hPSCs 차례로 세 개의 배엽으로 분화 8,9 결정 영향 다세포 패턴의 콜로니의 크기를 제어하기 위해 사용되어왔다. 우리는 인테그린-E-cadherin의 누화 세포 운명 얼룩이 열을 일으킬 수 있는지 조사하는 hPSC 콜로니에서 세포 – 세포 및 세포 – 기질 상호 작용의 정도를 조절하는 다세포 hPSC의 미세 패턴을 채용 하였다. 조직 또는 장기 개발 과정에서 성장 인자와 호르몬의 효과를 연구하기 위해 개발 질병 (11)에 대한 약물 독성 검사를위한 실험 모델로 hPSCs의 다세포 미세 패턴의 적용으로 위의 보고서 열려있는 새로운 길에서 데모, 그리고의 형성을 해명하기 조직 패턴.
세포 micropatter의 수많은Falconnet 등의 검토로 닝 기술이 개발되어왔다. 등. (12) 그러나 마이크로 접촉이 7,8,13 인쇄 등 소수에 불과는 마이크로 웰 문화 14, 15, 포토 패터닝은 6 microstencils (16)이 성공적으로 hPSCs로 구현되었다. 미세화의 hPSCs와 도전은 자신의 취약점과 세포 부착과 생존을위한 특정 세포 외 기질 (ECM) 및 성장 조건의 엄격한 요구 사항에 자리 잡고 있습니다. 2D hPSC 패턴의 경우, 마이크로 컨택트 프린팅 조직 배양 및 유리 기판 (13)에 hPSC에 미세 패턴을 생성하기위한 가장 일반적인 방법 중의 하나이다. 상기 방법은 마트 리겔 라미닌 및 기저막 매트릭스를 포함 hPSC 배양에서 사용 패턴 ECM 공통으로 사용될 수있다. 그러나, 일반적으로 폴리 D 라이신의 도움 두 단계의 코팅 공정이 필요하며,이 hPSCs 6,13-에 부착 안정 ECM의 미세 패턴을 특정 불활성 대기 습도 조건을 필요. 각각의 미세 가공 방법의 가장 중요한 고려 사항은 주변에 비특이적 세포 부착을 최소화하면서 표면 개질 체제 원하는 기하학적 해상도 hPSC 접착 ECM 패턴을 생성 할 수 있는지 여부이다.
여기서는 hPSCs가 부착하기위한 종래 접착제 ECM 패턴의 발생을 추가로 표면 개질 단계없이 hPSC에 미세 패턴을 생성하기위한 간단한 방법으로서 공판 미세화의 사용을보고한다. 셀 스텐실 관통 구멍 물리적 ECM 코팅이어서 hPSCs 시드를 포함하는 세포 배양 용 기재 상에 밀봉 크기 밀리미터 미크론으로, 얇은 막, 예를 들면, 폴리 디메틸 실록산 (PDMS) 시트를 포함한다. 스텐실 패턴은 물리적으로 hPSC가 기본 ECM 코팅 된 기판에 직접 액세스하여 첨부 할 수 있습니다 위치를 억제하여 작동,이 방법은 hPSC 문화를 지원할 수있는 다양한 기판과 호환됩니다. 유일한 requirement는 스텐실 재료의 선택은 기판과 가역적 시일을 형성 할 수 있다는 것이다. 이 기판은 기존의 조직 문화 폴리스티렌 (FPC 기판) (17), 리간드 결합 된 기판 (18)뿐만 아니라 가변 강성과 탄성 기판을 포함한다 (예., PDMS) 19. 이 방법은 또한, 적절한 부착 및 hPSCs 분화를 허용하는 그러한 비트로 넥틴 (VTN 또는 단백질), 라미닌 및 기저막 매트릭스 (예, 마트 리겔과 Geltrax)로 상이한 ECM의 코팅을 허용한다. 특정 hPSC 라인 그러므로 우리는 최적화 전송할 수 있습니다 ECM-기판 구성은 최적의 세포 – 매트릭스 접착, 생존 및 분화에 대한 미세 가공 스텐실합니다. 최근, 유사한 방법이 또한 폴리 (메틸 메타 크릴 레이트)를 사용하여 미세화 hESCs는 (PMMA) 공판 마이크로 어레이 간 (16)에 의해 분화를 유도하는 것으로보고되고있다.
셀 스텐실은 다른 재료로 제조 될 수 충족 포함루게릭 병 (20, 21), 폴리 (p- 자일 릴렌) 폴리머 22, 23, PMMA (16)과 가장 일반적으로, PDMS 24-28. 실리콘 및 폴리 (P-크실렌) 폴리머 스텐실은 생물학적 사용자에게 자신의 접근성을 제한하는 특수 장비 20-23로 관통 구멍의 직접 에칭이 필요합니다. PDMS 스텐실은 통상적으로 3 μm 인 2,000 ㎛의 범위 11,26-29 필요한 피처 크기에 따라 다른 방법에 의해 제조 될 수있다. 작은 특성이 요구되는 경우, 얇은 스텐실 시트는 미세 패턴 (28)의 릴리프를 포함하는 미세 가공 된 실리콘 템플릿에서 프레스 성형 PDMS 예비 중합체가 생성 될 수있다. 기능> 1000 μm의 들면, CO 2 레이저 커터 직접 스텐실 제조 동안에 프리 캐스트 PDMS 시트의 패턴을 절단하는 쉽고 저렴한 방법을 제공한다. PDMS 스텐실의 재활용도 충분한 일관성 일련의 실험을 수행하도록 경제적한다.
<p cl= "jove_content"엉덩이> 여기서 우리는 레이저 절단에 의해 1000 μm의 기능을 가진 PDMS 스텐실의 제조 및 hESC의의 미세 패턴의 생성에 대한 자세한 방법론을 제시한다. 이 hESC의의 미세 패턴은 인테그린의 정도를 조절하는 데 사용하고, 세포 부착의 공간 편광 세포 운명의 이질성 (10) 결과 방법을 조사하기 위해 E-cadherin의 응집력 hESC의 식민지 내의 유착을 중재.Protocol
Representative Results
Discussion
미세 패턴 스텐실의 제작
스텐실 미세화 틈새 매개 분화 패턴을 조사하기위한 hPSC의 미세 패턴을 생성 할 수있는 이상적인 방법을 제공한다. 이러한 마이크로 콘택트 인쇄, 포토 패터닝과 같은 다른 미세 가공 기술 위에 스텐실 패턴의 주요 장점은 표면 개질을 필요로하지 않고, 종래의 FPC 기판의 기판 상에 구현 될 수 있다는 것이다. 따라서, 다른 hPSC 라?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 작품은 그랜트를 시작 NUS에 의해 (R-397-000-192-133) 및 ETPL 간격 기금 (R-397-000-198-592)를 지원합니다. GS는 NUS 연구 학자이다. 저자는 셀의 미세화에 그녀의 기술 지원을위한 박사 Jiangwa 싱에게 감사의 말씀을 전합니다.
Materials
| 2 mm thick PDMS sheet | Specialty Silicone Products Inc., USA | SSPM823-.005 | Used to form reservoir for stencil |
| 120-150 μm thick PDMS sheet | Specialty Silicone Products Inc., USA | SSPM823-.040 | Used to form stencil |
| 60 mm petri dish | Nunc Nunclon Delta | 150326 | Substrate for micropatterning |
| Accutase | Accutase, Merck Millipore, Singapore | SCR005 | Enzyme to break H9 Cells into single cells |
| Activin | R&D Systems, Singapore | 338-AC-010 | Growth factor for H9 differentiation |
| BMP4 | R&D Systems, Singapore | 338-BP-010 | Growth factor for H9 differentiation |
| Plasma system | Femto Science, Korea | CUTE-MP | For plasma oxidation of stencil |
| Dispase | StemCell™ Technologies, Singapore | 7923 | Enzyme used to weaken the cell-ECM adhesion during passaging |
| DMEM/F12 | GIBCO, USA | 11330032 | Basal medium for H9 cells |
| FGF2 | R&D Systems, Singapore | 233–FB–025 | Growth factor for H9 differentiation |
| H9 Cell line | WiCell Research Institute, Inc., USA | WA09 | Human embryonic stem cells |
| hESC-qualified basement membrane matrix | Matrigel, BD Biosciences, Singapore | 354277 | Extra-cellular matrix coating to support growth of H9 cells |
| Inverted microscope | Leica Microsystems, Singapore | DMi1 | For capturing bright-field images |
| Laser cutter | Epilog Helix 24 Laser System | Used to generate through holes in PDMS sheet | |
| mTeSR™1 medium | StemCell™ Technologies, Singapore | 5850 | Maintainence medium for H9 cells |
| PDMS | SYLGARD® 184, Dow Corning Co., USA | 3097358-1004 | Used for sticking the PDMS stencil and reservior |
| ROCKi Y27632 | Calbiochem, Merck Millipore, Singapore | 688000 | Maintains H9 cells as single cells |
| STEMdiff™ APEL™ medium | StemCell™ Technologies, Singapore | 5210 | Differentiation medium for H9 cells |
| Polyethylene terephthalate film | SureMark Singapore | SQ-6633 | Used to form stencil |
| Cell culture compatible non-ionic surfactant | Pluronic acid F-127, Sigma, Singapore | P2443 | Passivating reagent to repel cell adhesion in non-micropatterned substrates |
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