Summary
ヒト多能性幹細胞（hPSCs）は差別化した別個の組織パターンに自己組織化するための固有の能力を持っています。これは、空間的な環境勾配の提示を必要とするが。我々はHPSC分化パターンを制御するための生化学的および機械的な勾配を生成するためのシンプルかつ堅牢な方法としてステンシル微細を提示します。
Introduction
胚性幹細胞（hESC）と人工多能性幹細胞（hiPSCs）を含む、ヒト多能性幹細胞（hPSCs）は、広くすべての細胞系譜に、それらの分化能の正常および罹患器官の実験モデルならびに再生医療に利用されます三胚葉1,2。 hPSCsの分化運命は、物理的な手がかり3-5によって媒介される1と同様にメカノプロセスをシグナリングオートクリンまたはパラクリンを調節することができる地域の環境要因に対して非常に敏感です。セルの微細化は、空間的に、このような細胞-細胞相互作用6及び細胞-マトリックス相互作用を3として、局所的な細胞の微小環境を制御するための手段として、細胞集団の幾何学的形状と位置を整理するために開発された技術の集合を含みます。 hPSCsの文脈では、細胞は、微細ニッチ依存する方法に重要な洞察を得るために使用されていますENT自己分泌シグナル伝達は、初期胚の分化パターン6へのhESC多能性分化の決定7および組織を調節します。 2Dおよび3D微細hPSCsは、順番に3種の胚層8,9への分化決定に影響を与え、多パターンのコロニーの大きさを制御するために使用されています。我々は、インテグリンEカドヘリンクロストークは、細胞運命の異質10を生じさせることができるか調べるためにHPSCコロニー内の細胞-細胞および細胞-マトリックス相互作用の程度を調節するために多HPSCの微細パターンを採用しています。上記レポート発達疾患11のための薬物毒性スクリーニングのための実験モデルとしてhPSCsの多微細パターンの適用に向けたオープンな新しい道からデモンストレーション、組織または器官、開発中の成長因子およびホルモンの効果を研究するために、との形成を解明します組織パターン。
セルmicropatterの無数Falconnet らによって見直さとしてニング技術が開発されています。アル。12しかし、そのようなマイクロコンタクトは7,8,13印刷などのほんの一握りは、マイクロウェル文化14,15、光パターンは6とmicrostencils 16が正常に hPSCsで実装されています。微細hPSCsでのチャレンジは、その脆弱性と細胞の付着と生存のための特定の細胞外マトリックス（ECM）と成長条件の厳しい要件です。 2D HPSCパターンについて、マイクロコンタクト印刷は、組織培養、ガラス基板13上にHPSCの微細パターンを生成するための最も一般的な方法の一つです。方法は、マトリゲルなどラミニンおよび基底膜マトリックス、を含むHPSC文化、で使用されるパターンの共通ECMに使用することができます。しかし、それは、典型的には、ポリ-D-リジンにより支援二段階コーティングプロセスを必要とし、hPSCsは6,13に付着するための安定したECMの微細パターンを作製するために、特定の不活性大気の湿度条件を必要とします。各微細法の最も重要な考慮事項は、周辺地域への非特異的な細胞の付着を最小限に抑えながら、表面改質政権が希望の幾何学的な解像度でHPSC接着ECMパターンを生成することができるかどうかです。
ここでは、前に取り付けるためのhPSCs用接着ECMパターンの生成に追加の表面改質工程なしHPSCの微細パターンを生成するための簡単な方法として、ステンシル微細の使用を報告しています。細胞ステンシルは、スルーホール物理的にECMコーティングし、その後播種hPSCsを格納するための細胞培養基板上にシールサイズをミリメートルミクロンで、薄い膜、 例えば、ポリジメチルシロキサン（PDMS）シートで構成されています。ステンシルパターニングは物理的にHPSCにアクセスし、基礎となるECMコーティングされた基板に直接接続することができる場所を抑制することによって動作したように、この方法は、HPSC培養をサポートすることができる様々な基板と互換性があります。のみrequirementは、ステンシル材料の選択は、基板と可逆的シールを形成することができるということです。これらの基板は、従来の組織培養ポリスチレン（TCPS）17、リガンド共役基材18と同様に、調整可能な剛性を有するエラストマー材が挙げられる（ 例えば 、PDMS）19。この方法はまた、適切な取り付けとhPSCsの分化を可能にするために、このようなビトロネクチン（またはVTNタンパク質）、ラミニンおよび基底膜マトリックス（ 例えば 、マトリゲルとGeltrax）として異なるECMのコーティングを可能にします。したがって、我々は最適な細胞 - マトリックス接着、生存および分化のためのステンシル微細に特定のHPSCラインのための最適化されたECM-基板の構成を転送することができます。最近、同様の方法はまた、ポリ（メチルメタクリレート）（PMMA）マイクロステンシルアレイ16を使用してヒトES細胞を微細によって肝臓分化を導くことが報告されています。
細胞ステンシルが満たさ含む、異なる材料から製造することができますALS 20,21、ポリ（p-キシリレン）ポリマー22,23、PMMA 16、最も一般的には、PDMS 24-28。シリコン及びポリ（p-キシリレン）は、ステンシルは、貫通孔生物ユーザーへのアクセス可能性を制限する特殊な装置20-23との直接エッチングを必要とするポリマーです。 PDMSステンシルは、典型的には3ミクロンから2,000ミクロン11,26-29の範囲で必要な特徴の大きさに応じて異なる方法で製造することができます。小さ な特徴が所望される場合には、薄いステンシルシートは、微細パターン28のレリーフを含む微細加工シリコンテンプレート上にプレス成形PDMSプレポリマーによって製造することができます。機能>千μmのために、CO 2レーザーカッターは、直接ステンシル製作中プレキャストPDMSシート上のパターンをカットするための簡単かつ低コストの方法を提供します。 PDMSステンシルのリサイクルにも十分な一貫性のある一連の実験を実施するためにそれら費用対効果になります。
10をもたらした方法空間を調査するために、凝集のhESCコロニー内のインテグリンの程度およびE-カドヘリン媒介性接着を調節するために使用しました。
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Protocol
注：このプロトコルは、PDMSステンシルを使用してのhESCラインのレーザー切断および微細、H9によって千μmのパターンとPDMSステンシルの製造を説明しています。
1.設計とマイクロパターニングのためのPDMSステンシルの作製
- 所望の形状や大きさ（ 例えば 、1000μmで丸）およびコンピュータ支援設計ソフトウェア10を使用して、ステンシルガスケットの貫通穴を有するステンシルシートを設計します。
- レーザーカット、それぞれ120から150μmの厚さ2mmのポリジメチルシロキサン（PDMS）シート上にステンシルシートとガスケットをCO 2レーザーカッター10を使用して。
- 微細用PDMSステンシルを得るために3-4時間、60℃で液状の未硬化PDMSとベークを使用して、PDMSステンシルシートでPDMSガスケットを接着。
- 使用前にオーブンで30分間、乾燥、120℃でオートクレーブ処理することによりPDMSステンシルを滅菌します。
2.ヒトES細胞の主ナンス
- 培養1×のhESC修飾基底膜マトリックス上で無フィーダー維持培地中でhESC株は、37℃で細胞培養プレートをコーティングし、5％CO 2。
- パッセージヒトES細胞を、彼らはディスパーゼ処理した37℃で3分間のインキュベーションにより約70％のコンフルエントであり、機械的に100から200μmの塊にhESCコロニーを解離。 6分割比：1での基底膜マトリックスでコーティングした組織培養ポリスチレン上で増殖エリア9.6 1cm 2当たり30〜50塊の密度でヒトES細胞の塊をプレート。
ヒト胚性幹細胞の3ステンシルマイクロパターニング
- 前の細胞パターニングへの準備
- ペトリ皿に超純水で700μlの70％の分析グレードのエタノールを分配し、上部にステンシルを配置し、60 mmのペトリ皿上にPDMSステンシルを密封します。
- トン一晩せるためにバイオセーフティキャビネット内のペトリ皿を置きます彼は乾燥エタノール。
- 全く気泡がステンシルは、ペトリ皿との良好なシールを形成することを確実にするために、ステンシルの下に存在していないか確認してください。これは、ECMコーティング液の漏れを防止します。それは細胞播種のための準備ができるまで、無菌条件下でのペトリ皿や店舗を封印。
- 分析証明書に従ってhESCの修飾基底膜マトリックスのアリコートを準備します。ダルベッコ改変イーグル培地25mlに希釈した場合、各アリコート利回り1×hESCの修飾基底膜マトリックス溶液いることを確認してください：栄養混合物F-12（DMEM / F12）メーカーの製品シートによると。
- 1.5×のhESC修飾基底膜マトリックス溶液を作るためにDMEM / F12 16.7 mlのへのhESC修飾基底膜マトリックスの1つのアリコートを添加することにより、ECMの塗布液を調製。ゲル化を防止するために氷の上のすべてのECMコーティング液を保管してください。
- 10μMのROCK阻害剤（Y27632）でのhESCの維持培地を補います。
- 90秒間100 2 WOプラズマでペトリ皿を扱います。無菌性を確保するために、唯一の前のプラズマ処理をプラズマ室内ペトリ皿のカバーを開いて、すぐに処理が完了した後、ペトリ皿をバックカバー。これは、表面の濡れを促進し、ECMコーティング溶液の添加の間に貫通孔微細に気泡の形成を防止します。
- 全体のステンシルをカバーする1.5倍のhESC修飾基底膜マトリックス溶液の450μlのを追加します。乾燥から溶液を防止し、使用前に37℃で5時間インキュベートし、例えば、パラフィルムのように、自己密封可能なフィルムをペトリ皿を密封します。
- ステンシル基板上にヒトES細胞を播種
- 丸みを帯びた、しっかりpackeの典型的なヒトES細胞の形態の損失を示す分化した細胞領域を識別するために、6ウェルプレート中でhESCコロニーを調べ（ 例えば、損失D上皮形態、顕著な核小体を有する高核/細胞質比）。真空吸引器を使用して差別化領域を削除します。
- ウェル当たり2ミリリットルのDMEM / F12で二回洗浄します。
- 6ウェルプレートのウェルあたり、などのAccutaseなどの消化酵素の1ミリリットルを加え、8分間37℃でインキュベートします。基板から全てのコロニーを分離するために静かにプレートをタップします。
- 消化酵素の1ミリリットル当たりDMEM / F12の少なくとも4ミリリットルで各ウェルを洗浄し、15ミリリットルコニカルチューブに細胞懸濁液を収集します。
- 室温で3分間、200×gで細胞懸濁液を遠心します。
- 吸引して上清を除去し、細胞を再懸濁するためにROCK阻害剤（ROCKI）を補充したhESC維持培地400μlのを追加します。単一細胞に塊を壊すために静かに上下に3回細胞懸濁液をピペットで。
- 単一細胞懸濁液をよく混合し、DMEM / F12（1：20希釈）190μlの中に細胞サンプルを10μlを希釈。 hemocytomeを使用してくださいターストック細胞懸濁液中の細胞密度を決定します。
- 与えられたステンシルのために必要な細胞播種密度を計算します。
注：例では、実験的に、単一の細胞のコンフルエントな単層を得るために、細胞播種密度が約4,444細胞/ mm 2で決定しました。したがって、450ミリメートル2の面積と400μlと播種量とのステンシルは2百万個の細胞/400μlの濃度になるように細胞懸濁液が必要になります。 - ROCKIを補充したhESC培養培地で（ステップ3.3.8を参照してください。注）必要な播種密度に株式細胞懸濁液を希釈します。
- 各ステンシルへの細胞の必要な数を含有する細胞懸濁液の指定されたボリュームを追加し、ペトリ皿を残す細胞が沈降することを可能にするために室温で5分間フード内で平静。
- インキュベーターにペトリ皿を移し、細胞付着を可能にするために1時間インキュベートします。中にペトリ皿のレベルを維持するために注意してください細胞はステンシルで単層として残るように処理を移します。
- パターン化されていない基板のステンシルの除去とパッシベーション
- 細胞が適切に下にある基板上に付着しているかどうかを確認するために顕微鏡下でペトリ皿を調べます。
- ステンシルから細胞懸濁液を離れて吸引します。
- ステンシルの周囲にDMEM / F12中の0.5％の細胞培養適合性の非イオン性界面活性剤を2ml /ディッシュを加えます。
- 静かにステンシルを剥離し、オートクレーブ処理ピンセットを使用してください。ステンシルは、乾燥から細胞を防ぐために剥離される非イオン性界面活性剤溶液を周囲に渦。視覚的にペトリ皿にマイクロパターン細胞を観察します。
- 37℃で10分間、0.5％の非イオン性界面活性剤、DMEM / F12溶液中の微細細胞をインキュベートします。
- 吸引離れて非イオン性界面活性剤、DMEM / F12溶液。 2ミリリットル/ DMEM / F12の皿で3回洗浄します。
- ヒトES細胞の2ミリリットル/皿を追加します。維持培地は、ROCKIを補充し、37℃で一晩インキュベートします。
- 一晩インキュベートした後、吸引のhESCの維持培地は、ROCKIを補充したDMEM / F12で一回洗浄し、100ng / mlのアクチビン、25 ngの/ mlのBMP4及び10ng / mLのFGF2で補充した分化培地2ml /ディッシュを添加することによりmesoendoderm分化を誘導します。
- 位相コントラストイメージングを用いて微細パターンを評価し、以前に8説明したように、各パターンの平均短尾（T）の強度プロファイルを計算します。
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Representative Results
本稿では、1000μmでの特徴を生成するために、レーザーカッターを使用することにより、細胞ステンシルの製作を説明します。貫通孔微細パターンを含む薄いステンシルシート（厚さ約100〜200ミクロン）、およびECMコーティング溶液又は細胞懸濁液を含有するPDMSガスケット：ステンシルは2部品で構成しました。ここでは、127ミクロン及び厚さ2mmの市販のPDMSシートは、それぞれ、ステンシルシートおよびガスケットとして使用しました。スピンコーティングのような制御可能な厚さのPDMSシートを製造するための他の方法は、また、部品を製造するために使用することができます。二つの成分は、接着剤やプラズマ結合のような液体未硬化のPDMSプレポリマー架橋剤の混合物を使用して互いに結合し、3~4時間、60°C（ 図1）で焼成しました。
ステンシルシートの材料は、細胞培養物の選択に基づいて選択しました。ubstrate。培養基質のような従来の組織培養ポリスチレン（TCPS）を使用する場合PDMSステンシルシートのコンプライアンスが剛性TCPS（E〜3 GPA）（ 図2A）との良好なシールを形成するので、PDMSステンシルを使用することができます。一つは、このような5キロパスカルMPaの30 2の可変剛性範囲を有するエラストマーPDMS基板として柔らかい細胞培養基質上に幹細胞の運命の空間的な不均一性を調査することを希望する実験の設計において、より剛性ステンシル材料を用いることができます。例として、約5キロパスカル（ 図2B）の剛性を有する柔らかいPDMS基板上HPSCコロニーを微細化1ミリメートル生成するために、ポリエチレンテレフタレート（PET）、ステンシル（E〜2 GPA）の使用を実証しました。 PETステンシルは、市販のPETフィルム（ 図2B、挿入図 ）からなるステンシルシート上にPDMSガスケットを接着することによって作製しました。私たちは、なお、微細化時に必要な細胞付着時間プロセスは、従来のTCPS基板に比べて剛性〜5キロパスカルのより柔らかいPDMS基板上に（〜3時間）長かったです。
我々は可能性パターンの早期mesoendoderm分化細胞接着媒介機械的な力でその空間的不均一性を実証するために、ステンシル微細化hESCコロニーを利用しました。我々は以前にH9ヒトES細胞は、コロニー周辺にアクチビン、BMP4及びFGF2 31（ 図で誘導時ブラキュリ（T）陽性mesoendoderm細胞へのそれらの優先的分化を生じたコロニー内部の細胞、より高いインテグリン癒着を経験することを示している。図3A ）。細胞は一定のコロニーエリアで異なる形状（円、正方形、長方形、半円弧）にパターニングしたところ、インテグリン媒介牽引力の局所濃度につながった正方形、長方形、凸の曲率の隅に幾何学的異方性そして、増加mesoendをもたらしましたoderm分化32,33。実際に、単一のコロニー内の異なる位置で、マッピングTの発現強度によって、我々はmesoendoderm誘導の程度は図 （正方形と長方形のコロニー（ 図3B）の鋭い角に、半円 弧の凸曲率でより高いことがわかりました異方性ジオメトリ32,33で報告された高インテグリン媒介応力領域に対応していた。3C）、。そのため、微細に続く分化プロセスを制御する手段として、無傷HPSCコロニー内の細胞接着媒介機械的な力の空間分布を調節するために使用することができます。
微細用PDMSステンシルの図1.生成。回路図（A）ステンシル製造における重要なステップを表します。 127μmの厚さのPDMSシートがlaました設計されたパターンを生成するためにSERはカットし、さらに2 mmの厚さは、PDMSシートガスケットを製造するためにレーザー切断しました。これらの2つの成分はステンシルを組み立てる未硬化PDMSと一緒に結合させた。（B）画像がスルーホール1ミリメートルの円形とPDMSステンシルを形成するために、部品の組み立てを示す。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
異なる培養基板上の 図2.マイクロパターンhESCコロニー（千 μmの丸）。hESCの微細コロニーの顕微鏡画像をすぐに硬い基板、上のhESCの微細パターンを生成するために使用される（A）PDMSステンシル（挿入図）を除去した後、例えば 、剛性のTCPS〜 2 GPaであり、（B）PETステンシル（インセット） 例えば、PDMS剛性〜5 kPaでの、より柔らかい基板上に微細パターンを生成するために使用される。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
そのmesoendoderm分化 8 上の異なる幾何学的形状のヒトES細胞の微細パターンの図3.影響 。異なる幾何学的形状の（A）のhESC微細パターンが、同じコロニー面積はPDMSステンシルを用いて作製しました。 mesoendoderm分化の24時間後の位相画像（上のパネル）とT式（下のパネル）の強度マップ。（（A）の白い点線に沿って）（B）の平均Tの強度プロファイルアイソメトリック円形コロニーまたは非等長正方形と長方形のコロニーで。すべてのコロニーは、同じ面積の元を持っていましたコロニー面積の半分を持っていた50％の円、（C）平均Tの強度プロファイル凹状または凸状のエッジからの半円弧でコロニー内部に、（A）において白い点線で示すようにCEPT。 （BC）のそれぞれの強度プロファイルは、4個のコロニーから得られた16の強度プロファイルの平均値です。画像は藤らの許可を得て再印刷されています。ら 、8。スケールバー= 200μmのとRFUは相対蛍光単位である。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図4. hESCコロニーを微細パターンおよび分化を誘導するワークフローの概略図。のhESC微細パターンの成功の世代のための主要なステップは、灰色のボックスで強調されています。.COM /ファイル/ ftp_upload / 54097 / 54097fig4large.jpg "ターゲット=" _空白 ">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
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Discussion
微細ステンシルの作製
ステンシル微細ニッチ媒介分化のパターニングを調査するためのHPSCの微細パターンを生成するための理想的な方法を提供します。このようなマイクロコンタクト印刷及び光パターンのような他の微細技術上のステンシルパターン形成の重要な利点は、それが表面改質を必要とせず、従来のTCPS基板上に実装することができることです。したがって、異なるHPSCラインの最適化培養培地およびECMコーティングは容易にステンシル微細に転送することができます。
良い微細パターンの生成に寄与する細胞ステンシルの製造中の重要なステップの数があります。 HPSCの微細パターンで設計された形状を再現の忠実度は、ステンシルシートの貫通穴加工の品質と一貫性に依存します。多micropatを含む研究のため>1000μmでのアジサシ、貫通孔を直接プリキャストPDMSシートのレーザ切断によって作製することができます。レーザー切断の解像度は、レーザビームのスポットサイズ及びレーザービームの経路を制御する機械的なステージの精度に依存します。従来のCO 2レーザーカッターのために、我々はそれが（ 例えば 、正方形）、円形または湾曲の良好な忠実度での機能ではなく、鋭い角を持つ形状を作り出すことができることを見出しました。小さ いまたは鋭い特徴が所望される用途においては、貫通孔ステンシルシートの微細パターン28のレリーフを含む微細加工シリコンテンプレート上にPDMSを成形することによって製造することができます。成形方法の課題は、貫通孔シリコンテンプレートレリーフ上に残存PDMSの薄いPDMSシートにおけるマイクロサイズを製造することです。リーらにより記載されているように、いくつかの戦略がこの問題に対処するために開発されてきました。アル 。28
などの間semblyステンシルシートとセルステンシルを製造するためのガスケットの一つは、ステンシルシートをステンシルからの漏れを防止するために、接合プロセス中にフラットやほこりのないことを確認すべきです。接合プロセス中にステンシルシートの座屈は、ECMと細胞溶液はスルーホール微細から漏出させ、培養基質にステンシルの密封を危うくすることができます。ステンシルは、オートクレーブ（120℃、30分）によって滅菌されるべきであり、十分にそれを培養基質との良好なシールを形成できるようにオーブン内で乾燥させます。
もう一つの重要な要因は、ステンシルシート材料の選択です。 PDMSステンシルは〜2万気圧の剛性を有するようなTCPSのような剛性培養基板上への微細hPSCsに最適です。しかしながら、一つのそのような一般的にチューニングセル基板の剛性34、PDMSのコンプライアンスに使用されるPDMS基板上などの柔らかい基板上hPSCsを微細したい場合ステンシルシートは、それが困難な為HPSCの微細パターンを破壊し、細胞播種処理後のステンシルを剥離するようになります。この場合には、ステンシルのステンシルシートの材料の選択は、培養基質とのシールを形成することができるが、容易に剥離できるように選択されなければなりません。
HPSCの微細パターンの生成
ここで提示PDMSステンシルを使用してTCPS基板上にH9ヒトES細胞を微細するためのプロトコルは、良好な細胞生存率およびパターニング忠実にコンフルエントコロニーを達成するために最適化されています。 hPSCsは1ジオメトリに依存する因子が分化運命にどのように影響するかを調べることができるように、微細パターンによって定義された特定の形状の空間閉じ込め内の適切な細胞 - 細胞および細胞 - マトリックス相互作用を形成することが不可欠です。我々が正常にHPSCの微細パターン（ 図4）を生成するには、いくつかの重要なステップを特定しました以下のように、それらは説明されています。
まず、HPSC文化の質が重要。分化した領域を除去しながら未分化HPSC形態を示すコロニーの大半は、70から80パーセントの合流点にHPSCコロニーを収穫することが重要です。過剰コンフルエントHPSC培養物は、通常、自発的な分化を引き起こし、そして分化した領域は、細胞播種前に除去されない場合、分化した細胞は、正常な分化パターン形成を破壊するであろう。
単一細胞懸濁液にHPSCコロニーを収穫するとき、これは多くの場合、細胞は最初に添付することができたとしても一晩のインキュベーション後、細胞死をもたらすため、2番目、消化酵素で過剰治療を回避することが重要です。私たちは、酵素処理の8分が私たちの研究室で培養H9 hESCのラインに最適であることがわかりました。我々は、細胞剥離の処理時間は、異なる細胞株について別々に最適化されるべきであることをお勧めしません。
最後に、微細パターン内に細胞を増殖または分化拘束するために、非細胞接着分子とHPSCの微細パターンの周囲の基板を不動態化する必要があります。これはHPSCの微細パターンの忠実度を維持するために不可欠であり、ひいては、分化パターンのための生化学的および機械的な環境勾配が開発します。例えばプルロニックF-127のような細胞培養適合性の非イオン性界面活性剤は、不動態化剤として使用することができます。界面活性剤と不動態化すると、処理時間と濃度が原因で長時間露光での界面活性剤の細胞毒性に最適化されるべきです。我々は上述したように、提示されたプロトコルは、PDMSステンシルを使用してhPSCsを微細するための詳細なガイドラインを提供しますが、このプロトコルの最適化、特に上記の重要なステップのために、suすることが奨励されていますccessfully HPSCの微細パターンを生成します。
ステンシル微細の1つの制限は、それが100-1,500ミクロンの範囲、より大きな微細パターンを生成するために適しているということです。前述したように単一細胞のパターニングのために意図された非常に小さな特徴を生成するために、スルーホール<50ミクロンを有するステンシルシートの製造は非常に困難です。したがって、我々はステンシルマイクロパターンhPSCsの使用は、異なる発生プロセス（ 例えば、神経上皮の折り畳みまたは内胚葉パターニング）中の多細胞組織のパターン形成を調査するのに非常に適していることを期待しています。
幾何学的にHPSC集団を閉じ込めるために微細を使用することにより、我々は、結果として得られる分化運命の空間的な組織を制御し、理解するために細胞接着媒介機械10およびパラクリンシグナル勾配6を確立することができます。空間的に編成differentiatioを有するこれらのマイクロパターンHPSCモデルnが順番に先天性先天性欠損のためのヒト特異的疾患または催奇形物質のスクリーニングモデル11に変換することができます。
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Disclosures
著者には、競合する金融利害関係を持っていません。
Acknowledgments
この作品は、付与（R-397-000-192-133）を起動し、ETPLギャップ・ファンド（R-397-000-198-592）NUSによってサポートされています。 GSはNUSの研究学者です。著者らは、細胞の微細化の彼女の技術サポートのために博士Jiangwa興に感謝したいと思います。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2 mm thick PDMS sheet | Specialty Silicone Products Inc., USA | SSPM823-.005 | Used to form reservoir for stencil |
| 120-150 μm thick PDMS sheet | Specialty Silicone Products Inc., USA | SSPM823-.040 | Used to form stencil |
| 60 mm Petri dish | Nunc Nunclon Delta | 150326 | Substrate for micropatterning |
| Accutase | Accutase, Merck Millipore, Singapore | SCR005 | Enzyme to break H9 cells into single cells |
| Activin | R&D Systems, Singapore | 338-AC-010 | Growth factor for H9 differentiation |
| BMP4 | R&D Systems, Singapore | 338-BP-010 | Growth factor for H9 differentiation |
| Plasma system | Femto Science, Korea | CUTE-MP | For plasma oxidation of stencil |
| Dispase | StemCell™ Technologies, Singapore | 7923 | Enzyme used to weaken the cell-ECM adhesion during passaging |
| DMEM/F12 | GIBCO, USA | 11330032 | Basal medium for H9 cells |
| FGF2 | R&D Systems, Singapore | 233–FB–025 | Growth factor for H9 differentiation |
| H9 cell line | WiCell Research Institute, Inc., USA | WA09 | Human embryonic stem cells |
| hESC-qualified basement membrane matrix | Matrigel, BD Biosciences, Singapore | 354277 | Extra-cellular matrix coating to support growth of H9 cells |
| Inverted microscope | Leica Microsystems, Singapore | DMi1 | For capturing bright-field images |
| Laser cutter | Epilog Helix 24 Laser System | Used to generate through holes in PDMS sheet | |
| mTeSR™1 medium | StemCell™ Technologies, Singapore | 5850 | Maintainence medium for H9 cells |
| PDMS | SYLGARD® 184, Dow Corning Co., USA | 3097358-1004 | Used for sticking the PDMS stencil and reservior |
| ROCKi Y27632 | Calbiochem, Merck Millipore, Singapore | 688000 | Maintains H9 cells as single cells |
| STEMdiff™ APEL™ medium | StemCell™ Technologies, Singapore | 5210 | Differentiation medium for H9 cells |
| Polyethylene terephthalate film | SureMark Singapore | SQ-6633 | Used to form stencil |
| Cell culture compatible non-ionic surfactant | Pluronic acid F-127, Sigma, Singapore | P2443 | Passivating reagent to repel cell adhesion in non-micropatterned substrates |
References
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