Stencil Micropatterning of Human Pluripotent stamceller for undersøkelser romlige organiseringen av differensiering Fates

Summary

Menneskelige pluripotente stamceller (hPSCs) har den iboende evne til å differensiere og selvtillit organisere inn i forskjellige vev mønstre; selv om dette krever presentasjon av romlige miljø gradienter. Vi presenterer sjablong micropatterning som en enkel og robust metode for å generere biokjemiske og mekaniske gradienter for å styre hPSC differensieringsmønster.

Abstract

Human pluripotent stem cells (hPSCs), including embryonic stem cells and induced pluripotent stem cells, have the intrinsic ability to differentiate into all three germ layers. This makes them an attractive cell source for regenerative medicine and experimental modeling of normal and diseased organogenesis. However, the differentiation of hPSCs in vitro is heterogeneous and spatially disordered. Cell micropatterning technologies potentially offer the means to spatially control stem cell microenvironments and organize the resultant differentiation fates. Micropatterning hPSCs needs to take into account the stringent requirements for hPSC survival and maintenance. Here, we describe stencil micropatterning as a method that is highly compatible with hPSCs. hPSC micropatterns are specified by the geometries of the cell stencil through-holes, which physically confine the locations where hPSCs can access and attach to the underlying extracellular matrix-coated substrate. Due to this mode of operation, there is greater flexibility to use substrates that can adequately support hPSCs as compared to other cell micropatterning methods. We also highlight critical steps for the successful generation of hPSC micropatterns. As an example, we demonstrate that stencil micropatterning of hPSCs can be used to modulate spatial polarization of cell-cell and cell-matrix adhesions, which in turn determines mesoendoderm differentiation patterns. This simple and robust method to micropattern hPSCs widens the prospects of establishing experimental models to investigate tissue organization and patterning during early embryonic development.

Introduction

Humane pluripotente stamceller (hPSCs), inkludert embryonale stamceller (hESCs) og induserte pluripotente stamceller (hiPSCs), allment utnyttes i regenerativ medisin samt eksperimentelle modellering av normal og sykelig organogenese på grunn av deres differensiering potensial inn i cellen linjer av alle tre bakterie lag ^1,2. Differensieringen skjebne hPSCs er svært følsomme for lokale miljøfaktorer som kan modulerer autokrine eller parakrine signaliserer ^en samt mechanotransduction prosesser mediert av fysiske signaler ^3-5. Cell micropatterning omfatter et sett av teknikker som er utviklet for å romlig organisere geometri og plassering av en cellepopulasjon som et middel for å kontrollere den lokale mobilmikromiljøet, slik som celle-celle interaksjoner ⁶ og celle-matriks interaksjoner ^3. I sammenheng med hPSCs har celle micropatterning vært ansatt for å oppnå betydelige innsikt i hvordan nisje-avhengigeent autokrint signale modulerer hESC pluripotency-differensiering beslutninger ⁷ og organisasjon i tidlig embryonale differensieringsmønster ^6. 2D og 3D micropatterned hPSCs har blitt brukt til å styre kolonien størrelsen på flercellede mønstre, som i sin tur påvirket differensiering beslutninger i de tre bakterie lag ^8,9. Vi har anvendt flercellede hPSC micropatterns å modulere den grad av celle-celle og celle-matriks-vekselvirkninger innenfor et hPSC koloni å undersøke hvordan integrin-E-cadherin krysstale kan gi opphav til celle skjebne heterogenitet ^10. Demonstrasjonene fra de ovennevnte rapporter åpne nye veier mot anvendelsen av flercellede micropatterns av hPSCs som eksperimentelle modeller for narkotika toksisitet screening for utviklings sykdommer ^11, for å studere effekten av vekstfaktorer og hormoner i løpet av vev eller organ utvikling, og å rakne dannelsen av vev mønstre.

En myriade av celle micropatterNing teknikker har blitt utviklet som anmeldt av Falconnet et. al. ^12, men bare en håndfull, for eksempel mikro-kontakt utskrift ^7,8,13, mikrokultur ^14,15, photopatterning ⁶ og microstencils ¹⁶ har blitt implementert med hPSCs. Utfordringen med micropatterning hPSCs ligger i deres sårbarhet og strenge krav om konkrete ekstracellulære matriser (ECM) og vekstvilkår for cellebinding og overlevelse. For 2D hPSC mønstre, er mikro-kontakt utskrift en av de vanligste metodene for å generere hPSC micropatterns på vev kultur og glass underlag ^13. Fremgangsmåten kan brukes til å påføre mønster felles ECM som brukes i hPSC kultur, inkludert laminin og basalmembran matriser, slik som Matrigel. Imidlertid, er det vanligvis krever en totrinns belegningsprosess hjulpet av poly-D-lysin, og trenger spesielle inerte atmosfæriske og fuktighetsforhold for å lage stabile ECM micropatterns for hPSCs å feste på ^6,13. Den fremste hensyn til hver micropatterning metode er om overflaten ombygging regime kan generere hPSC-lim ECM mønstre på ønsket geometrisk oppløsning mens uspesifikke cellebinding minimere til de omkringliggende områdene.

Her rapporterer vi bruk av sjablongen micropatterning som en enkel metode for å generere hPSC micropatterns uten ytterligere overflatemodifikasjonstrinn før generering av selvklebende ECM mønstre for hPSCs å feste på. Cellen sjablongen består av en tynn membran, for eksempel polydimetylsiloksan (PDMS) ark, med mikron til millimeter størrelse, gjennomgående hull forseglet på en cellekultur substrat for fysisk å inneholde ECM belegg og deretter sådd hPSCs. Som sjablong mønster virker ved fysisk tilbakeholdende det sted hvor hPSC kan få tilgang til og festes direkte på den underliggende ECM belagte substrat, er denne metode som er kompatibel med forskjellige substrater som kan støtte hPSC kulturer. De eneste requirement er at valg av sjablongen materiale kan danne en reversibel tetning med substratet. Disse substrater inkluderer konvensjonelle vevskulturpolystyren (TCPS) ^17, ligand-konjugerte substrater ^18, samt elastomere substrater med avstembar stivhet (f.eks., PDMS) ^19. Denne metoden gir også belegg av forskjellig ECM, som vitronectin (eller VTN protein), laminin og basalmembran matriser (f.eks Matrigel og Geltrax) for å få riktig feste og differensiering av hPSCs. Derfor kan vi overføre optimalisert ECM-substrat konfigurasjoner for en bestemt hPSC linje til sjablong micropatterning for optimal celle-matrix adhesjon, overlevelse og differensiering. Nylig har en lignende metode også blitt rapportert til å dirigere hepatisk differensiering av micropatterning hESCs ved hjelp av poly (metylmetakrylat) (PMMA) mikro sjablong matriser ^16.

Celle sjablonger kan fremstilles av forskjellige materialer, inkludert møttals ^20,21, poly (p-xylylen) polymerer ^22,23, PMMA ¹⁶ og mest, PDMS ^24-28. Silisium og poly (p-xylylen) polymerer sjabloner krever direkte etsning av de gjennomgående hullene med spesialutstyr ^20-23, noe som begrenser deres biologiske tilgjengelighet til brukerne. PDMS sjabloner kan fremstilles ved forskjellige metoder, avhengig av trekkstørrelse nødvendig, noe som er typisk i området fra 3 mikrometer til 2000 mikrometer ^11,26-29. Hvis små funksjoner er ønskelig, kan tynne spraye plater produseres ved trykk molding PDMS pre-polymer på en microfabricated silisium mal som inneholder relieffer av de micropatterns ^28. For funksjoner> 1000 mikrometer, gir et CO ₂ laser cutter en enkel og rimelig metode for å direkte kutte mønstrene på en pre-støpt PDMS ark under sjablongen fabrikasjon. Den resirkulering av PDMS sjablonger gjør dem også kostnadseffektivt å gjennomføre en rekke eksperimenter med tilstrekkelig konsistens.

<p class = "jove_content"> Her presenterer vi detaljert metodikk for fabrikasjon av en PDMS sjablong med 1000 mikrometer funksjoner ved laserskjæring og generering av hESC micropatterns. Disse hESC micropatterns ble anvendt for å modulere den grad av integrin og E-cadherin mediert adhesjon innenfor en sammenhengende hESC koloni for derved å undersøke hvordan romlig polarisering av celleadhesjon resulterte i celle skjebne heterogenitet ^10.

Protocol

MERK: Denne protokollen beskriver fabrikasjon av PDMS sjablong med 1000 mikrometer mønstre av laserskjæring og micropatterning av hESC linje, H9 bruke PDMS sjablong. 1. Design og fabrikasjon av PDMS Stencil for Micropatterning Design spraye arket med gjennomgående hull med ønsket geometri og størrelse (f.eks 1000 mikrometer sirkler) og sjablongen pakning bruker dataassistert design software 10. Laser-kutt spraye arket og pakning på 120-150 nm og…

Representative Results

I denne artikkelen beskriver vi fabrikasjon av en celle sjablong ved hjelp av en laser cutter å generere 1000 mikrometer funksjoner. Sjablongen var sammensatt av 2 deler: en tynn spraye ark (ca. 100-200 mikrometer tykk) inneholdende micropattern gjennomgående hull, og et PDMS pakning for å inneholde den ECM beleggløsningen eller cellesuspensjon. Her ble 127 mikrometer og 2 mm tykke kommersielt tilgjengelige PDMS ark anvendes som spraye ark og pakning henholdsvis. Andre fremgangsmåte…

Discussion

Fabrikasjon av micropatterning sjablonger

Stencil micropatterning gir en ideell metode for å generere hPSC micropatterns for å undersøke nisje-mediert differensiering mønster. Den viktigste fordelen med sjablongen mønster i forhold til andre micropatterning teknikker, slik som mikrokontakttrykking og photopatterning, er at den ikke krever overflatemodifisering og kan implementeres på konvensjonelle TCPS substrater. Derfor kan optimaliserte dyrkningsmedier og E…

Materials

2 mm thick PDMS sheet	Specialty Silicone Products Inc., USA	SSPM823-.005	Used to form reservoir for stencil
120-150 μm thick PDMS sheet	Specialty Silicone Products Inc., USA	SSPM823-.040	Used to form stencil
60 mm petri dish	Nunc Nunclon Delta	150326	Substrate for micropatterning
Accutase	Accutase, Merck Millipore, Singapore	SCR005	Enzyme to break H9 Cells into single cells
Activin	R&D Systems, Singapore	338-AC-010	Growth factor for H9 differentiation
BMP4	R&D Systems, Singapore	338-BP-010	Growth factor for H9 differentiation
Plasma system	Femto Science, Korea	CUTE-MP	For plasma oxidation of stencil
Dispase	StemCell™ Technologies, Singapore	7923	Enzyme used to weaken the cell-ECM adhesion during passaging
DMEM/F12	GIBCO, USA	11330032	Basal medium for H9 cells
FGF2	R&D Systems, Singapore	233–FB–025	Growth factor for H9 differentiation
H9 Cell line	WiCell Research Institute, Inc., USA	WA09	Human embryonic stem cells
hESC-qualified basement membrane matrix	Matrigel, BD Biosciences, Singapore	354277	Extra-cellular matrix coating to support growth of H9 cells
Inverted microscope	Leica Microsystems, Singapore	DMi1	For capturing bright-field images
Laser cutter	Epilog Helix 24 Laser System		Used to generate through holes in PDMS sheet
mTeSR™1 medium	StemCell™ Technologies, Singapore	5850	Maintainence medium for H9 cells
PDMS	SYLGARD® 184, Dow Corning Co., USA	3097358-1004	Used for sticking the PDMS stencil and reservior
ROCKi Y27632	Calbiochem, Merck Millipore, Singapore	688000	Maintains H9 cells as single cells
STEMdiff™ APEL™ medium	StemCell™ Technologies, Singapore	5210	Differentiation medium for H9 cells
Polyethylene terephthalate film	SureMark Singapore	SQ-6633	Used to form stencil
Cell culture compatible non-ionic surfactant	Pluronic acid F-127, Sigma, Singapore	P2443	Passivating reagent to repel cell adhesion in non-micropatterned substrates