Summary
Menselijke pluripotente stamcellen (hPSCs) hebben de intrinsieke vermogen om onderscheid te maken en zichzelf organiseren in verschillende weefsel patronen; hoewel dit vereist de presentatie van ruimtelijke milieu-hellingen. Wij presenteren stencil micropatterning als een eenvoudige en robuuste methode om biochemische en mechanische gradiënten genereren voor het besturen van HPSC differentiatie patronen.
Introduction
Menselijke pluripotente stamcellen (hPSCs), waaronder embryonale stamcellen (hESCs) en geïnduceerde pluripotente stamcellen (hiPSCs), wordt gebruik moeten regeneratieve geneeskunde en experimentele modellering van normale en zieke organogenese vanwege hun differentiatie potentieel in cellijnen van drie kiem lagen 1,2. De differentiatie lot van hPSCs zijn zeer gevoelig voor lokale omgevingsfactoren die autocriene of paracriene signalen 1 en mechanotransductie processen gemedieerd door fysische signalen 3-5 kunnen moduleren. Micropatterning cel omvat een reeks technieken die zijn ontwikkeld om ruimtelijk organiseren van de geometrie en de locatie van een celpopulatie als een middel om de lokale cellulaire micro-omgeving regelen, zoals cel-cel interacties 6 en cel-matrix interacties 3. In de context van hPSCs is cel micropatterning toegepast om belangrijke inzichten in hoe niche-afhankelijk krijgenent autocriene signalering moduleert hESC pluripotentie-differentiatie beslissingen 7 en organisatie in de vroege embryonale differentiatie patronen 6. 2D en 3D micropatterned hPSCs zijn gebruikt om de kolonie grootte van multicellulaire patronen, waardoor differentiatie factoren van invloed zijn op de drie kiemlagen 8,9 beheersen. We hebben multicellulaire HPSC micropatterns toegepast om de mate van cel-cel en cel-matrix interacties te moduleren bij een HPSC kolonie sonderen hoe integrine-E-cadherine overspraak tot lot van de cel heterogeniteit 10 kunnen geven. De demonstratie van de bovenstaande rapporten opent nieuwe wegen naar de toepassing van meercellige micropatterns van hPSCs als experimentele modellen voor geneesmiddeltoxiciteit screenen op ontwikkelingsziekten 11, om het effect van groeifactoren en hormonen studie tijdens weefsel of orgaan ontwikkeling en de vorming van ontrafelen weefsel patronen.
Een groot aantal cel micropatterning technieken ontwikkeld zoals beoordeeld door Falconnet et. al. 12, maar slechts een handvol, zoals micro-contact afdrukken 7,8,13, microwell cultuur 14,15, photopatterning 6 en microstencils 16 zijn met succes geïmplementeerd hPSCs. De uitdaging met micropatterning hPSCs ligt in hun kwetsbaarheid en een strenge eis van specifieke extracellulaire matrix (ECM) en de groeiomstandigheden voor celhechting en overleving. 2D HPSC patronen, micro-contactdruk is een van de meest gebruikte methoden voor HPSC micropatterns met weefselkweek en glassubstraten 13 genereren. De werkwijze kan worden gebruikt om gemeenschappelijke patroon ECM gebruikt HPSC cultuur, zoals laminine en basaalmembraan matrices, zoals Matrigel. Het vereist echter typisch een tweestaps bekledingswerkwijze geholpen door Poly-D-Lysine en specifieke behoeften inerte atmosfeer en vochtigheidsgraad stabiele ECM micropatterns maken hPSCs te bevestigen op 6,13. De belangrijkste overweging van elk micropatterning methode is de vraag of de modificatie van het oppervlak regime HPSC-lijm ECM patronen op de gewenste geometrische resolutie kan genereren, terwijl het minimaliseren aspecifieke celhechting naar de omliggende gebieden.
Hier melden wij het gebruik van stencil micropatterning een eenvoudige methode om HPSC micropatterns genereren zonder andere oppervlaktemodificatie stappen voor de generatie van lijm patronen voor ECM hPSCs te bevestigen op. De cel stencil bestaat uit een dun membraan, bijvoorbeeld polydimethylsiloxaan (PDMS) plaat, met micron op maat doorlopende gaten verzegeld op een celcultuur substraat fysiek ECM coatings en vervolgens uitgezaaid hPSCs bevatten millimeter. Stencilsets patroonvorming werkt door het fysiek beperken van de locatie waar HPSC direct naar onderliggende ECM beklede substraat toegang en voeg deze methode is geschikt voor diverse substraten die HPSC culturen kunnen ondersteunen. De enige requirement is dat de keuze van sjabloon materiaal een omkeerbare afdichting met het substraat kan vormen. Deze substraten omvatten gebruikelijke weefselkweek polystyreen (TCPS) 17, ligand geconjugeerd substraten 18, alsook elastomere substraten met instelbare stijfheid (bijv., PDMS) 19. Deze methode maakt het ook mogelijk coating van verschillende ECM, zoals vitronectine (of VTN eiwit), laminine en basaal membraan matrices (bijv Matrigel en Geltrax) te zorgen voor een goede hechting en differentiatie van hPSCs. Daarom kunnen we doorzenden geoptimaliseerde ECM-substraat configuraties voor een specifiek HPSC lijn stencil micropatterning optimale cel-matrix hechting, overleving en differentiatie. Onlangs heeft een soortgelijke werkwijze ook gerapporteerd hepatische differentiatie micropatterning hESCs behulp poly (methylmethacrylaat) (PMMA) micro-arrays stencil 16 sturen.
Cell stencils kunnen worden vervaardigd van verschillende materialen, waaronder ontmoetteals 20,21, poly (p-xylyleen) polymeren 22,23, 16 en PMMA meest, PDMS 24-28. Silicium en poly (p-xylyleen) polymeren mallen vereisen directe etsen van de doorgaande gaten met 20-23 gespecialiseerde apparatuur, die de toegankelijkheid beperkt tot biologische gebruikers. PDMS mallen kunnen worden vervaardigd door verschillende methoden, afhankelijk van de functie vereiste grootte, die typisch varieert van 3 urn tot 2000 urn 11,26-29. Als kleine functies gewenst zijn, kan dunne sjabloneren platen worden geproduceerd door persvormen PDMS pre-polymeer op een microfabricated silicium template met reliëfs van de micropatterns 28. Voor elementen> 1000 urn, een CO 2 lasersnijmachine biedt een eenvoudige en goedkope manier om de patronen op een vooraf gegoten PDMS plaat tijdens fabricage stencil direct gesneden. De recycleerbaarheid van PDMS sjablonen maakt ze rendabel een reeks experimenten met voldoende consistentie voeren.
10.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
LET OP: Dit protocol beschrijft de fabricage van PDMS stencil met 1000 micrometer patronen door lasersnijden en micropatterning van de hESC lijn, H9 met behulp van de PDMS stencil.
1. Ontwerp en fabricatie van PDMS Stencil voor micropatterning
- Ontwerp de sjabloneren blad met doorgaande gaten van de gewenste geometrie en grootte (bijvoorbeeld 1000 micrometer cirkels) en de pakking stencil met behulp van computer-aided design software 10.
- Laser-snijd de sjabloneren blad en pakking op 120-150 pm en 2 mm dik polydimethylsiloxaan (PDMS) bladen respectievelijk met behulp van een CO 2 laser-cutter 10.
- Binden de PDMS pakking met de PDMS stencil vel met behulp van vloeibare niet uitgeharde PDMS en bakken bij 60 ° C gedurende 3-4 uur naar het PDMS stencil voor micropatterning verkrijgen.
- Steriliseer de PDMS sjabloon autoclaaf bij 120 ° C gedurende 30 minuten en drogen in een oven te gebruiken.
2. hESCs Mainonderhoud
- Cultuur hESC lijnen in een feeder-vrij onderhoudsmedium op 1 x hESC gekwalificeerde basaalmembraan matrix gecoate celcultuur platen bij 37 ° C en 5% CO2.
- Passage de hESCs als ze ongeveer 70% confluent door 3 minuten incubatie bij 37 ° C met dispase behandeling en mechanisch dissociëren de hESC kolonies in 100-200 urn klonten. De plaat hESCs klonten met een dichtheid van 30-50 klonten per 9,6 cm2 groeigebied op basaalmembraan matrix gecoate weefselkweek polystyreen op 1: 6 splitsverhouding.
3. Stencil micropatterning van menselijke embryonale stamcellen
- Voorbereiding voorafgaand aan patroonvorming cel
- Zegel een PDMS stencil op een 60 mm petrischaal door het afgeven van 700 ul 70% analytische kwaliteit ethanol in ultrapuur water in de petrischaal en het plaatsen van de stencil bovenop.
- Plaats de petrischaal binnenkant bioveiligheid kast 's nachts te laten tHij ethanol droog.
- Controleer geen bel bestaat onder de sjabloon zodat de sjabloon vormt een goede afdichting met de Petrischaal. Dit voorkomt lekkage van ECM bekledingsoplossing. Dicht de petrischaal en opslag onder steriele omstandigheden totdat het klaar is voor het zaaien van cellen.
- Bereid hoeveelheden van hESC-gekwalificeerde basaal membraan matrix volgens de Certificate of Analysis. Zorgen dat elk aliquot levert 1 × hESC gekwalificeerde basaalmembraan matrix oplossing verdund in 25 ml Dulbecco's Modified Eagle Medium: Nutrient Mixture F-12 (DMEM / F12) volgens productblad fabrikant.
- Bereid de ECM coating oplossing door het toevoegen van een hoeveelheid van hESC-gekwalificeerde basaal membraan matrix in 16,7 ml DMEM / F12 tot 1,5 × hESC gekwalificeerde basaal membraan matrix oplossing te maken. Houd alle ECM bekledingsoplossing op ijs gelering te voorkomen.
- Supplement hESC onderhoud medium met 10 pM ROCK-remmer (Y27632).
- Behandel de petrischaal met 100 WO 2 plasma voor 90 sec. Om steriliteit te verzekeren, maar opent de petrischaal deksel in de plasmakamer vóór de plasmabehandeling, en snel terug bedekken de petrischaal na beëindiging van de behandeling. Dit vergemakkelijkt oppervlaktebevochtiging en voorkomt dat lucht belvorming in de micropatroon doorgaande gaten bij de toevoeging van ECM bekledingsoplossing.
- Voeg 450 ul van 1,5 x hESC gekwalificeerde basaal membraan matrix oplossing voor het hele stencil te dekken. Verzegel de petrischaal met zelf-lasbare film, zoals Parafilm, te voorkomen dat de oplossing uitdroogt en incubeer gedurende 5 uur bij 37 ° C vóór gebruik.
- Seeding hESCs op het gestencilde substraat
- Onderzoek hESC kolonies in 6-well plaat om de gedifferentieerde celgebieden Verliesresultaten typische hESC morfologie identificeren (bijvoorbeeld verlies afgeronde, strak packed epitheliale morfologie, hoge kern / cytoplasma verhouding met prominente nucleoli). Verwijder gedifferentieerde regio's met behulp van een vacuüm aspirator.
- Was tweemaal met 2 ml DMEM / F12 per putje.
- Voeg 1 ml spijsverteringsenzymen, zoals Accutase, per putje van 6-well plaat en incubeer bij 37 ° C gedurende 8 min. Tik de plaat voorzichtig om alle kolonies los te maken van substraat.
- Spoel elk putje met ten minste 4 ml DMEM / F12 per 1 ml van spijsverteringsenzymen en verzamel de celsuspensie in 15 ml conische buis.
- Centrifugeer de celsuspensie bij 200 x g gedurende 3 minuten bij kamertemperatuur.
- Zuig aan het supernatant te verwijderen en voeg 400 ul van hESC onderhoud medium aangevuld met ROCK-remmer (Rocki) om opnieuw te schorten de cellen. Pipet de celsuspensie op en neer 3 keer zachtjes klonten breken in enkele cellen.
- Meng de enkele celsuspensie goed en verdun 10 ul van de cel monsters in 190 ul DMEM / F12 (1:20 verdunning). Gebruik een hemocytometer naar de cel dichtheid in de voorraad celsuspensie te bepalen.
- Bereken het vereiste cel zaaidichtheid gedurende een be- paalde stencil.
Opmerking: Zo hebben we experimenteel bepaalde cel entdichtheid het verkrijgen van een confluente monolaag van afzonderlijke cellen is ongeveer 4444 cellen / mm2. Zo zal een sjabloon met een oppervlakte van 450 mm2 en zaaien volume van 400 pi celsuspensie eisen dat bij een dichtheid van 2 miljoen cellen / 400 pl. - Verdun de voorraad celsuspensie om de vereiste zaaien dichtheid (zie stap 3.3.8 NB) met hESC kweekmedium aangevuld met Rocki.
- Voeg een aangewezen hoeveelheid celsuspensie die het vereiste aantal cellen in elk sjabloon en laat de petrischaal ongestoord in kap gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur om de cellen te regelen.
- Breng de petrischaal in de incubator en incubeer gedurende 1 uur om voor celhechting. Zorg ervoor dat de petrischaal niveau tijdens de te houdenoverdracht proces waardoor cellen als monolaag in het sjabloon blijven.
- Stencil verwijdering en passiveren van unpatterned substraat
- Onderzoek de petrischaal onder een microscoop om te controleren of de cellen goed zijn bevestigd op het onderliggende substraat.
- Aspireren weg celsuspensie van het stencil.
- Voeg 2 ml / schaal van 0,5% celkweek compatibel niet-ionogene oppervlakteactieve stof in DMEM / F12 met de omgeving van het stencil.
- Gebruik een paar geautoclaveerd pincet om voorzichtig afpellen van de stencil. Zwenk de niet-ionogene oppervlakteactieve oplossing rond de sjabloon afgepeld te voorkomen dat de cellen uitdrogen. Visueel waarnemen de micropatterned-cellen in de petrischaal.
- Incubeer de micropatterned-cellen in 0,5% niet-ionische surfactant-DMEM / F12 gedurende 10 min bij 37 ° C.
- Aspireren weg de niet-ionische surfactant-DMEM / F12 oplossing. Was 3 maal met 2 ml / schaal van DMEM / F12.
- Voeg 2 ml / schotel van hESConderhoud medium aangevuld met rocki en incubeer bij 37 ° C overnacht.
- Na incubatie gedurende de nacht, zuig hESC onderhoud medium aangevuld met rocki, eenmaal wassen met DMEM / F12 en induceren mesoendoderm differentiatie door toevoeging van 2 ml / schaal van differentiatie medium gesupplementeerd met 100 ng / ml activine, 25 ng / ml BMP4 en 10 ng / ml FGF2 .
- Evalueer de micropatterns met behulp van fase contrast beeldvorming en bereken de gemiddelde Brachyury- (T) intensiteit profielen voor elk patroon, zoals eerder beschreven 8.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
In dit artikel beschrijven we de fabricage van een cel sjabloon met behulp van een laser cutter om 1000 urn functies te genereren. Het sjabloon bestond uit 2 delen: een dunne plaat sjabloneren (ongeveer 100-200 micrometer dik) die de micropattern doorgaande gaten en een PDMS pakking om de ECM bekledingsoplossing of celsuspensie bevatten. Hier werden 127 pm en 2 mm dik handel verkrijgbare PDMS platen respectievelijk gebruikt als sjabloneren plaat en pakking. Andere werkwijzen voor het bereiden PDMS vel regelbare dikte, zoals spin-coating, kan ook worden gebruikt om de onderdelen te fabriceren. De twee componenten werden met elkaar verbonden met behulp van vloeibare uitgeharde PDMS-prepolymeer verknopingsmiddel mengsel als kleefstof of plasma binden, en gebakken bij 60 ° C gedurende 3-4 uur (fig. 1).
Het materiaal voor het sjabloneren vel werd gekozen op basis van de keuze van de celkweek substrate. Bij gebruik van conventionele weefselkweek polystyreen (TCPS) als substraat cultuur, kan PDMS mallen worden gebruikt, omdat de verenigbaarheid van de PDMS sjabloneren vel een goede afdichting met de stijve TCPS (E ~ 3 GPa) (Fig. 2A) te vormen. In experimentele modellen waar men wil ruimtelijke heterogeniteit stamcellen lot onderzoeken op zachtere celkweek substraten zoals elastomere PDMS substraten met een afstembare stijfheidsgebied van 5 kPa tot 2 MPa 30, kan stijver sjabloneren materialen worden toegepast. Als voorbeeld toonden we het gebruik van een polyethyleen tereftalaat (PET) stencil (E ~ 2 GPa) tot 1 mm genereren micropatterned HPSC kolonies op zachtere PDMS substraat met een stijfheid van ~ 5 kPa (fig. 2B). De PET sjabloon werd vervaardigd door lijmen een PDMS pakking op een sjabloneren plaat uit in de handel verkrijgbare PET-film (fig. 2B, bijvoegsel). We merken op dat de gewenste tijd celhechting tijdens de micropatterningWerkwijze langer was (~ 3 uur) op de zachtere PDMS substraat stijfheid ~ 5 kPa in vergelijking met conventionele TCPS substraten.
We gebruik gemaakt van stencil micropatterned hESC kolonies die ruimtelijke heterogeniteit in cel-adhesie gemedieerde mechanische krachten kon patroon vroege mesoendoderm differentiatie aan te tonen. We hebben eerder aangetoond dat H9 hESCs de kolonie omtrek ervaren hoger integrine adhesies dan cellen in de kolonie interieur, waardoor hun preferentiële differentiatie in Brachyury (T) -positieve cellen mesoendoderm wanneer geïnduceerd met activine, BMP4 en FGF2 31 (Fig. 3A ). Wanneer de cellen werden gevormd in verschillende geometrieën (cirkel, vierkant, rechthoek halve cirkelboog) met een constante kolonie gebied, geometrisch anisotropie op de hoeken van vierkanten, rechthoeken en bolle krommingen tot een lokale concentratie van door integrine gemedieerde trekkrachten en resulteerde in een verhoogde mesoendoderm differentiatie 32,33. Inderdaad, door mapping T expressie intensiteit op verschillende plaatsen binnen een enkele kolonie, vonden we dat de omvang van mesoendoderm inductie hoger in scherpe hoeken van vierkante en rechthoekige kolonies (Fig. 3B) en bolle krommingen van een halve cirkelboog (Fig . 3C), die een anisotrope geometrie overeen met 32,33 gaf hoge integrine gemedieerde stress-regio. Derhalve kan micropatterning worden gebruikt om de ruimtelijke verdeling van celadhesie gemedieerde mechanische krachten binnen een intacte HPSC kolonie moduleren als middel om de daaropvolgende differentiatie te beheersen.
Figuur 1. Het genereren van PDMS stencil voor micropatterning. (A) Schematische weergave die de kritische stappen in stencil fabricage. Een 127 pm dikke PDMS vel was laser snelkoppeling naar de aangewezen data leest en een 2 mm dikke PDMS vel werd laser gesneden om het profiel te produceren. Deze twee componenten werden aan elkaar gebonden met niet uitgeharde PDMS om het stencil te monteren. (B) beelden die de montage van de onderdelen van een PDMS stencil met 1 mm ronde door gaten te vormen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2. micropatterned hESC kolonies (1000 um cirkels) op andere cultuur substraten. Microscopische beelden van hESC micropattern kolonie direct na het verwijderen van (A) PDMS stencils (inzet) gebruikt om hESC micropatterns op stijve substraten, het genereren van bijvoorbeeld TCPS stijfheid ~ 2 GPa, en (B) PET stencils (inzet) Gebruikt om micropatterns op zachtere ondergrond, bijvoorbeeld genereren, PDMS van stijfheid ~ 5 kPa. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3. Effect van hESC micropatterns van verschillende geometrische vormen op hun mesoendoderm differentiatie 8. (A) hESC micropatterns van verschillende geometrische vormen, maar dezelfde kolonie gebied werden gegenereerd met behulp van PDMS stencils. Fase beelden (bovenste paneel) en de intensiteit kaarten van T-expressie (onderste paneel) na 24 uur van mesoendoderm differentiatie. (B) Gemiddeld T intensiteit profielen (samen witte stippellijnen in (A)) in het isometrische cirkelvormige kolonies of anisometrische vierkante en rechthoekige kolonies . Alle kolonies had hetzelfde gebied ex cept de 50% cirkel, die de helft van de kolonie gebied had. (C) Gemiddelde T intensiteitprofielen van de concave of convexe randen in de kolonie interieur in een halfronde boog, zoals aangegeven door witte stippellijnen in (A). Elk intensiteitprofiel in (BC) is gemiddeld 16 intensiteitprofielen verkregen uit 4 kolonies. De beelden worden opnieuw afgedrukt met toestemming van Toh et. al., 8. Schaal bar = 200 pm en RFU is relatieve fluorescentie-eenheid. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 4. Schematische weergave van de workflow om hESC kolonies micropattern en differentiatie kunnen induceren. Belangrijke stappen voor de succesvolle generatie van hESC micropatterns zijn gemarkeerd in grijze vakken..com / files / ftp_upload / 54097 / 54097fig4large.jpg "target =" _ blank "> Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Fabricage van micropatterning stencils
Stencil micropatterning biedt een ideale methode om HPSC micropatterns te genereren voor het onderzoeken van niche-gemedieerde differentiatie patronen. Het belangrijkste voordeel van stencil patronen micropatterning boven andere technieken, zoals microcontactprinten en photopatterning, is dat het niet oppervlaktemodificatie vereist en kan worden uitgevoerd op conventionele TCPS substraten. Daarom kan geoptimaliseerd kweekmedium en ECM coatings voor verschillende HPSC lijnen gemakkelijk worden overgedragen aan micropatterning stencil.
Er zijn een aantal belangrijke stappen tijdens de fabricage van de cel stencil die bijdragen aan de generatie van goede micropatterns. De betrouwbaarheid van het reproduceren van de ontworpen geometrieën in de HPSC micropatterns afhankelijk van de kwaliteit en consistentie van de doorgaande opening fabricage in het sjabloneren vel. Voor studies met meercellige micropatsternen van> 1000 urn, de doorgaande gaten kan direct worden vervaardigd door laser snijden op een vooraf gegoten PDMS vel. De resolutie van lasersnijden is afhankelijk van de vlekgrootte van de laserbundel en de precisie van de kruistafel regelen van de baan van de laserstraal. Voor conventionele CO 2 lasersnijmachines, vonden we dat het cirkelvormig of gebogen functies met goede trouw, maar niet geometrieën met scherpe hoeken kan produceren (bijv., Vierkant). In toepassingen waar kleine of scherpe functies gewenst zijn, de doorgaande gaten in het sjabloneren vel kan worden vervaardigd door het vormen van PDMS op een microfabricated silicium template met reliëfs van de micropatterns 28. De uitdaging van de gietmethode is om micro-maat produceren doorgaande gaten in dunne platen PDMS zonder residuele PDMS via silicium template reliëfs. Verscheidene strategieën zijn ontwikkeld om dit probleem zoals beschreven door Li et. al. 28
Tijdens ALStage van het sjabloneren vel en de pakking aan de cel stencil te produceren, moet men ervoor zorgen dat het sjabloneren plaat is vlak en vrij van stof tijdens de bonding proces om lekkages van het stencil te voorkomen. Het ontzetten van het sjabloneren plaat tijdens het verbindingsproces kan de afdichting van het sjabloon compromis om de cultuur substraat, waardoor ECM en mobiele oplossingen lekken uit de micropattern doorgaande gaten. Het sjabloon moet worden gesteriliseerd in de autoclaaf (120 ° C, 30 min) en grondig gedroogd in een oven zodat het een goede afdichting met de cultuur substraat kan vormen.
Een andere belangrijke factor is de selectie van het sjabloneren plaatmateriaal. De PDMS sjabloon is ideaal voor micropatterning hPSCs op rigide cultuur substraten, zoals TCPS met een stijfheid van ~ 2 GPa. Echter, als men wil hPSCs op zachtere ondergrond, bijvoorbeeld op PDMS substraten gewoonlijk gebruikt wordt om celsubstraat 34 stijfheid, de overeenstemming van een PDMS micropatroonsjabloneren sheet zal het moeilijk maken om loslaten van de stencil na de cel zaaien proces, dus het vernietigen van de HPSC micropatterns. In dit geval moet de materiaalkeuze voor het sjabloneren vel van het sjabloon zodanig worden gekozen dat het een afdichting met het kweeksubstraat kan vormen maar kunnen worden afgepeld gemakkelijk.
Generating HPSC micropatterns
Het protocol voor micropatterning H9 hESCs op TCPS substraten met behulp van een PDMS stencil hier gepresenteerde is geoptimaliseerd om een confluente kolonie met een goede levensvatbaarheid van de cellen en patroonvorming trouw te bereiken. Het is essentieel dat de hPSCs vormen juiste cel-cel en cel-matrix interacties binnen het ruimtelijk vasthouden van een bijzondere geometrie gedefinieerd door de micropatterns zodat men onderzoeken hoe geometrie-afhankelijke factoren beïnvloeden differentiatie lot. We hebben een paar kritische stappen om met succes te genereren HPSC micropatterns geïdentificeerd (Fig. 4)en zij worden als volgt besproken.
Ten eerste, de kwaliteit van de HPSC cultuur belangrijk. Het is belangrijk om de HPSC kolonies geoogst bij 70-80% confluentie met meeste kolonies geeft ongedifferentieerde HPSC morfologie tijdens het verwijderen van de gedifferentieerde gebieden. Over-confluente kweken HPSC veroorzaken meestal spontane differentiatie, en als de gedifferentieerde gebieden niet voorafgaand aan zaaien van cellen verwijderd, de cellen gedifferentieerde normale differentiatie patroonvorming verstoren.
Ten tweede, bij het oogsten HPSC kolonies enkelvoudige celsuspensie, vermijden over-behandeling met digestieve enzymen is essentieel omdat dit resulteert vaak in celdood na overnacht incubatie, zelfs als de cellen aanvankelijk kan hechten. We vonden dat de 8e minuut van de enzymatische behandeling optimaal is voor de H9 hESC lijn gekweekt in ons lab; hoewel raden wij aan dat de cel detachement behandelingstijd afzonderlijk voor verschillende cellijnen moet worden geoptimaliseerd.
Tot slot is er een behoefte om het substraat rond de HPSC micropatterns met niet-hechtende cellen moleculen gepassiveerd teneinde beperken proliferatieve of differentiërende cellen binnen de micropatroon. Dit is essentieel om de betrouwbaarheid van de HPSC micropattern handhaven, en op zijn beurt, de biochemische en mechanische milieu helling differentiatie patronen te ontwikkelen. Celkweek compatibele niet-ionogene oppervlakteactieve stoffen zoals Pluronic F-127 kan worden gebruikt als passiveringsmiddel. Wanneer passiveren met schoonmaakmiddelen, dient de behandelingstijd en de concentratie worden geoptimaliseerd door cytotoxiciteit surfactant bij lange blootstelling. Zoals we hierboven besproken, de gepresenteerde protocol biedt een gedetailleerde leidraad om hPSCs met behulp van een PDMS stencil micropattern, maar de optimalisatie van dit protocol, met name voor de bovengenoemde kritische stappen, wordt aangemoedigd om successfully genereren HPSC micropatterns.
Een beperking van stencil micropatterning is dat het meer geschikt voor het genereren van grotere micropatterns variërend van 100-1,500 urn. Zeer kleine elementen bestemd voor enkelvoudige cel patronen, de fabricage van platen met sjabloneren <50 urn doorgangen genereren zeer uitdagend als eerder vermeld. Daarom verwachten we dat het gebruik van stencil micropatterned hPSCs is geschikt voor multicellulaire weefselvorming patroon tijdens verschillende ontwikkelingsprocessen (bijv neuroepithelium vouwen of endoderm patronen) te onderzoeken.
Via micropatterning om een geometrisch beperken HPSC populatie, kunnen we vaststellen celadhesie gemedieerde mechanische 10 en paracrienen gradiënten 6 te beheersen en begrijpen van de ruimtelijke organisatie van de resulterende differentiatie lot. Deze micropatterned HPSC modellen met ruimtelijk georganiseerd differentiation kunnen op hun beurt worden vertaald in mens-specifieke ziekte of teratogeen screening modellen 11 voor aangeboren afwijkingen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben geen concurrerende financiële belangen.
Acknowledgments
Dit werk wordt ondersteund door NUS Start subsidie (R-397-000-192-133) en ETPL Gap Fund (R-397-000-198-592). GS is een NUS Research geleerde. Auteurs willen bedanken Dr. Jiangwa Xing voor haar technische ondersteuning op de mobiele micropatterning.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2 mm thick PDMS sheet | Specialty Silicone Products Inc., USA | SSPM823-.005 | Used to form reservoir for stencil |
| 120-150 μm thick PDMS sheet | Specialty Silicone Products Inc., USA | SSPM823-.040 | Used to form stencil |
| 60 mm Petri dish | Nunc Nunclon Delta | 150326 | Substrate for micropatterning |
| Accutase | Accutase, Merck Millipore, Singapore | SCR005 | Enzyme to break H9 cells into single cells |
| Activin | R&D Systems, Singapore | 338-AC-010 | Growth factor for H9 differentiation |
| BMP4 | R&D Systems, Singapore | 338-BP-010 | Growth factor for H9 differentiation |
| Plasma system | Femto Science, Korea | CUTE-MP | For plasma oxidation of stencil |
| Dispase | StemCell™ Technologies, Singapore | 7923 | Enzyme used to weaken the cell-ECM adhesion during passaging |
| DMEM/F12 | GIBCO, USA | 11330032 | Basal medium for H9 cells |
| FGF2 | R&D Systems, Singapore | 233–FB–025 | Growth factor for H9 differentiation |
| H9 cell line | WiCell Research Institute, Inc., USA | WA09 | Human embryonic stem cells |
| hESC-qualified basement membrane matrix | Matrigel, BD Biosciences, Singapore | 354277 | Extra-cellular matrix coating to support growth of H9 cells |
| Inverted microscope | Leica Microsystems, Singapore | DMi1 | For capturing bright-field images |
| Laser cutter | Epilog Helix 24 Laser System | Used to generate through holes in PDMS sheet | |
| mTeSR™1 medium | StemCell™ Technologies, Singapore | 5850 | Maintainence medium for H9 cells |
| PDMS | SYLGARD® 184, Dow Corning Co., USA | 3097358-1004 | Used for sticking the PDMS stencil and reservior |
| ROCKi Y27632 | Calbiochem, Merck Millipore, Singapore | 688000 | Maintains H9 cells as single cells |
| STEMdiff™ APEL™ medium | StemCell™ Technologies, Singapore | 5210 | Differentiation medium for H9 cells |
| Polyethylene terephthalate film | SureMark Singapore | SQ-6633 | Used to form stencil |
| Cell culture compatible non-ionic surfactant | Pluronic acid F-127, Sigma, Singapore | P2443 | Passivating reagent to repel cell adhesion in non-micropatterned substrates |
References
- Graf, T., Stadtfeld, M. Heterogeneity of embryonic and adult stem cells. Cell Stem Cell. 3 (5), 480-483 (2008).
- Nishikawa, S., Goldstein, R. A., Nierras, C. R. The promise of human induced pluripotent stem cells for research and therapy. Nat Rev Mol Cell Biol. 9 (9), 725-729 (2008).
- Guilak, F., Cohen, D. M., Estes, B. T., Gimble, J. M., Liedtke, W., Chen, C. S. Control of stem cell fate by physical interactions with the extracellular matrix. Cell Stem Cell. 5 (1), 17-26 (2009).
- Dalby, M. J., Gadegaard, N., Oreffo, R. O. Harnessing nanotopography and integrin-matrix interactions to influence stem cell fate. Nat Mater. 13 (6), 558-569 (2014).
- Joddar, B., Ito, Y. Artificial niche substrates for embryonic and induced pluripotent stem cell cultures. J Biotechnol. 168 (2), 218-228 (2013).
- Warmflash, A., Sorre, B., Etoc, F., Siggia, E. D., Brivanlou, A. H. A method to recapitulate early embryonic spatial patterning in human embryonic stem cells. Nat Methods. 11 (8), 847-854 (2014).
- Peerani, R., et al. Niche-mediated control of human embryonic stem cell self-renewal and differentiation. EMBO J. 26 (22), 4744-4755 (2007).
- Lee, L. H., Peerani, R., Ungrin, M., Joshi, C., Kumacheva, E., Zandstra, P. Micropatterning of human embryonic stem cells dissects the mesoderm and endoderm lineages. Stem Cell Res. 2 (2), 155-162 (2009).
- Hwang, Y. S., Chung, B. G., Ortmann, D., Hattori, N., Moeller, H. C., Khademhosseini, A. Microwell-mediated control of embryoid body size regulates embryonic stem cell fate via differential expression of WNT5a and WNT11. Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (40), 16978-16983 (2009).
- Toh, Y. C., Xing, J., Yu, H. Modulation of integrin and E-cadherin-mediated adhesions to spatially control heterogeneity in human pluripotent stem cell differentiation. Biomaterials. 50 (0), 87-97 (2015).
- Xing, J., Toh, Y. C., Xu, S., Yu, H. A method for human teratogen detection by geometrically confined cell differentiation and migration. Sci Rep. 5, 10038 (2015).
- Falconnet, D., Csucs, G., Grandin, H. M., Textor, M. Surface engineering approaches to micropattern surfaces for cell-based assays. Biomaterials. 27 (16), 3044-3063 (2006).
- Bauwens, C. L., et al. Control of human embryonic stem cell colony and aggregate size heterogeneity influences differentiation trajectories. Stem Cells. 26 (9), 2300-2310 (2008).
- Khademhosseini, A., et al. Co-culture of human embryonic stem cells with murine embryonic fibroblasts on microwell-patterned substrates. Biomaterials. 27 (36), 5968-5977 (2006).
- Mohr, J. C., de Pablo, J. J., Palecek, S. P. 3-D microwell culture of human embryonic stem cells. Biomaterials. 27 (36), 6032-6042 (2006).
- Yao, R., et al. Hepatic differentiation of human embryonic stem cells as microscaled multilayered colonies leading to enhanced homogeneity and maturation. Small. 10 (21), 4311-4323 (2014).
- Mei, Y., et al. Combinatorial development of biomaterials for clonal growth of human pluripotent stem cells. Nat Mater. 9 (9), 768-778 (2010).
- Melkoumian, Z., et al. Synthetic peptide-acrylate surfaces for long-term self-renewal and cardiomyocyte differentiation of human embryonic stem cells. Nat Biotechnol. 28 (6), 606-610 (2010).
- Evans, N. D., et al. Substrate stiffness affects early differentiation events in embryonic stem cells. Eur Cell Mater. 18, 1-13 (2009).
- Carter, S. B. Haptotactic islands: a method of confining single cells to study individual cell reactions and clone formation. Exp Cell Res. 48 (1), 189-193 (1967).
- Jimbo, Y., Robinson, H. P., Kawana, A. Simultaneous measurement of intracellular calcium and electrical activity from patterned neural networks in culture. IEEE Trans Biomed Eng. 40 (8), 804-810 (1993).
- Wright, D., et al. Reusable, reversibly sealable parylene membranes for cell and protein patterning. J Biomed Mater Res. A. 85 (2), 530-538 (2008).
- Jinno, S., et al. Microfabricated multilayer parylene-C stencils for the generation of patterned dynamic co-cultures. J Biomed Mater Res A. 86 (1), 278-288 (2008).
- Jackman, R. J., Duffy, D. C., Cherniavskaya, O., Whitesides, G. M. Using elastomeric membranes as dry resists and for dry lift-off. Langmuir. 15 (8), 2973-2984 (1999).
- Folch, A., Jo, B. H., Hurtado, O., Beebe, D. J., Toner, M. Microfabricated elastomeric stencils for micropatterning cell cultures. J Biomed Mater Res. 52 (2), 346-353 (2000).
- Park, J., et al. Microfabrication-based modulation of embryonic stem cell differentiation. Lab Chip. 7 (8), 1018-1028 (2007).
- Choi, J. H., Lee, H., Jin, H. K., Bae, J. S., Kim, G. M. Micropatterning of neural stem cells and Purkinje neurons using a polydimethylsiloxane (PDMS) stencil. Lab Chip. 12 (23), 5045-5050 (2012).
- Li, W., et al. NeuroArray: a universal interface for patterning and interrogating neural circuitry with single cell resolution. Sci Rep. 4, 4784 (2014).
- Guvanasen, G. S., Mancini, M. L., Calhoun, W. A., Rajaraman, S., DeWeerth, S. P. Polydimethylsiloxane Microstencils Molded on 3-D-Printed Templates. J Microelectromech S. 23 (5), 1045-1053 (2014).
- Palchesko, R. N., Zhang, L., Sun, Y., Feinberg, A. W. Development of polydimethylsiloxane substrates with tunable elastic modulus to study cell mechanobiology in muscle and nerve. PLoS One. 7 (12), 51499 (2012).
- Chowdhury, F., et al. Material properties of the cell dictate stress-induced spreading and differentiation in embryonic stem cells. Nat Mater. 9 (1), 82-88 (2010).
- Gjorevski, N., Boghaert, E., Nelson, C. M. Regulation of Epithelial-Mesenchymal Transition by Transmission of Mechanical Stress through Epithelial Tissues. Cancer Microenviron. 5 (1), 29-38 (2012).
- Thery, M. Micropatterning as a tool to decipher cell morphogenesis and functions. J Cell Sci. 123, (Pt 24) 4201-4213 (2010).
- Eroshenko, N., Ramachandran, R., Yadavalli, V. K., Rao, R. R. Effect of substrate stiffness on early human embryonic stem cell differentiation. J Biol Eng. 7 (1), 7 (2013).
