Summary
نقدم تقنيات بسيطة لعزل العملاقة الكروموسومات فرجونية النشطة transcriptionally من البويضات من الضفادع والسلمندر الحية. نحن تصف كيفية مراقبة هذه الكروموسومات "على قيد الحياة" على النقيض من مرحلة أو تفاضلي تدخل النقيض من ذلك، وكيفية اصلاحها لفلوري في التهجين الموضعي أو تلطيخ مناعي.
Abstract
وصفنا طرق لدراسة العملاقة الكروموسومات فرجونية النشطة transcriptionally (LBCs) وجدت في البويضة، أو بيضة unlaid، الضفادع والسلمندر. يمكن LBCs الفردية أن تصل إلى 1 ملم في الطول ويقيمون في نواة عملاقة، في حد ذاته ما يصل الى 0.5 ملم في القطر. حجم كبير من الكروموسومات يسمح الملاحظات لا مثيل لها من الجينات النشطة بواسطة المجهر الضوئي الضوء، ولكن في نفس الوقت هناك حاجة تقنيات خاصة لعزل نواة، وإزالة الغلاف النووي، ونشر الكروموسومات على شريحة المجهر. يتم عزل نواة البويضة، وتسمى أيضا الحويصلة الجرثومية (GV)، في وسيلة تسمح التبلور الجزئي للالأكتين النووية ويحافظ على هيكل الدقيق للLBCs. تتم هذه الخطوة يدويا تحت المجهر تشريح باستخدام ملقط صائغ. وبعد ذلك، تتم إزالة الغلاف النووي، ومرة أخرى يدويا مع ملقط المجوهرات. يتم نقل محتويات النووية بسرعة إلى المتوسطة التي الدهاناتrses هلام الأكتين ويسمح للLBCs التالفة ليستقر على شريحة المجهر. عند هذه النقطة LBCs والعضيات النووية الأخرى ويمكن الاطلاع على النقيض من مرحلة أو تدخل الفرق المجهر النقيض من ذلك، على الرغم من أن التفاصيل الدقيقة يتم حجب من قبل الحركة البراونية. لارتفاع الملاحظة قرار المجهري أو تحليل الجزيئي، يتم طرد إعداد كله إرفاق LBCs الحساسة بحزم إلى الشريحة. ثم تبعتها وتثبيت وجيزة في امتصاص العرق من قبل تلوين مناعي أو التهجين. LBCs في حالة نشطة transcriptionally وحجمها الهائل يسمح التحليل الجزيئي على مستوى الجينات الفردية باستخدام متحد البؤر أو فائقة الدقة المجهر.
Introduction
معظم الفقاريات، مع استثناء ملحوظ من الجرابيات والثدييات المشيمية، وإنتاج البيض yolky كبيرة. وعلى الرغم من حجمها الهائل في بعض الأحيان، هذه البويضات هي الخلايا الوحيدة التي تصل إلى البعد النهائي في حين لا يزال في المبيض من الاناث. ودعا البيض المبيض البويضات وكل عادة ما تحتوي على نواة العملاقة واحدة، والمعروف منذ أوائل القرن ال 19 كما الحويصلة الجرثومية أو ببساطة GV. 1 البويضات من الضفادع مختبر المشتركة، القيطم المورق ومداري القيطم، يصل قطرها إلى أقصى حد من 1.2 ملم و 0.8 ملم على التوالي (الشكل 1). ومشاهد عامة من البويضات الناضجة من هذه الضفادع هما 0،3-0،4 مم في القطر (أرقام 2 و 3). السلمندر وعادة ما يكون البويضات حتى أكبر ومشاهد عامة. البويضات الناضجة تماما وقنفذ البحر المكسيكي، Ambystoma mexicanum، أكثر من 2 مم في القطر وGV حوالي 0.5 مم. وهكذا، هذه النوى مرئية بسهولة بالعين المجردة ويمكنيمكن التلاعب بها في العديد من الطرق التي من المستحيل مع نوى الخلايا الجسدية نموذجية.
على قدم المساواة لافت للنظر هو حجم هائل من الكروموسومات داخل GV، وهذه حقيقة معترف بها بالفعل في نهاية القرن التاسع 19. الكروموسومات الفردية Ambystoma والسلمندر أخرى يمكن أن تصل إلى 1 ملم في الطول (أرقام 4، 5). تلك هي القيطم كبيرا أصغر، على الرغم من بأطوال تصل إلى 100 ميكرون أو أكثر، انها تفوق الكروموسومات الجسدية النموذجية لمعظم الكائنات الحية. سمة هامة من الكروموسومات بويضة هو النشاط النسخي غير عادي، مما يؤدي إلى واحدة من أهم سمات شكلية متميزة لهم - المئات من الحلقات الجانبية يقترن (الشكل 5). وتتكون كل حلقة واحدة أو عدد قليل من الوحدات النسخ أن تجميع بنشاط الحمض النووي الريبي. الحلقات تعطي بويضة صبغيات مظهر غامض، مما أدى إلى اسم كروموسوم "فرجونية" بعد سطحية بهاتشابه في الفرش المستخدمة في أوقات سابقة لتنظيف المداخن مصباح الكيروسين. 2
وتركز هذه الورقة على استخدام مشاهد عامة معزولة لدراسة LBCs والعضيات النووية (نويات والهيئات هيستون مكان، والبقع). ويمكن وصفها اثنين من تقنيات مختلفة نوعا ما. في أول تقنية، أكثر شيوعا، يتم عزل مشاهد عامة في محلول ملحي باستخدام ملقط الجواهري، وتشطف لفترة وجيزة لإزالة صفار ملتصقة، وإزالة الغلاف النووي، ومرة أخرى مع ملقط المجوهرات. محتويات الجيلاتينية، التي تحتوي على LBCs والعضيات النووية، ويسمح ليستقر على شريحة المجهر والزجاج أو ساترة. هذه المستحضرات يمكن فحص مباشرة على النقيض من المرحلة أو مدينة دبي للإنترنت المجهر. بدلا من ذلك، يمكن طرد الاستعدادات لإرفاق LBCs والعضيات إلى الشريحة أو ساترة. ويمكن بعد هذه الاستعدادات تتم معالجتها للتحليل الجزيئي مفصل من الأحماض النووية والبروتينات، في المقام الأول المناعي وfluorescenتي في الموقع التهجين (FISH). 3-7
وتتضمن تقنية الثانية عزل GV في الزيوت المعدنية. تبقى 8 مشاهد عامة معزولة النفط النشطة transcriptionally لساعات طويلة ومفيدة محتملة للدراسات التي يكون فيها أحد يريد محتويات النووية ليكون نابض بالحياة قدر الإمكان. 9،10 لأن معامل الانكسار من "ساب" النووي هو قريب من ذلك من LBCs وغيرها من العضيات النووية (الشكل 3)، وتقنيات مجهرية يمكن أن يكون تحديا مع مشاهد عامة معزولة للنفط.
أخيرا، بسبب حجمها وسهولة التلاعب، ومشاهد عامة هي المادة المثالية للدراسات على الغلاف النووي. وقد وصفت مجمع المسام النووي أولا من الدراسات المجهرية الإلكترون على المظاريف GV البرمائيات 11 وأكثر الملاحظات superresolution الأخيرة استخدمت نفس المادة. 12،13
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
معلومات عامة حول الضفادع والسلمندر، فضلا عن مصادر من الحيوانات، ويمكن الاطلاع على المواقع الإلكترونية التالية: Xenbase (http://www.xenbase.org) وسال الموقع (http://www.ambystoma.org). يتبع هذا البروتوكول المبادئ التوجيهية رعاية الحيوان قسم علم الأجنة من معهد كارنيجي للعلوم.
1. حلول
- جعل 10 L "المياه ضفدع": إضافة 10 مل من 1 M CaCl 2 و 10 مل من 1 M NaHCO 3-10 L منزوع الأيونات أو إزالة الكلور H 2 O مع التحريك.
- جعل 1 L 20٪ امتصاص العرق: جعل 1 لتر من 4 ملي نا 2 CO 3. في غطاء الكيميائية إضافة 200 غرام من مسحوق امتصاص العرق، والحرارة إلى نحو 80 درجة مئوية إلى حل. بارد، ومرشح من خلال ورقة الترشيح. تحذير: امتصاص العرق هو السامة ويجب التعامل معها بحذر. بدلا من ذلك، شراء حل لامتصاص العرق التجاري.
- جعل 1 لتر محلول مخدر البرمائيات: إضافة 1.5 غرام من إيثيل 3-aminobenmethanesulfonate zoate على المياه ضفدع 1 لتر. تخزين في درجة حرارة الغرفة.
- جعل 1 L ثقافة بويضة المتوسطة OR2 14: 82.5 مم كلوريد الصوديوم، 2.5 ملي بوكل، 1 ملم CaCl 2، 1 ملم MgCl 2، 1 ملم نا 2 هبو 4، 5 ملي HEPES (من 500 ملي الأسهم، ودرجة الحموضة 8.3). إن الأس الهيدروجيني النهائية ستكون حول درجة الحموضة 7.8. إضافة 100 الأمبيسلين ملغ و 100 ملغ الستربتومايسين لمنع نمو البكتيريا.
- جعل 1 L GV العزلة حل: 83 ملي بوكل، 17 مم كلوريد الصوديوم، 6.5 ملي نا 2 هبو 4، 3.5 مم KH 2 PO 4، 1 ملم MgCl 2، 1 ملم dithiothreitol (DTT). ضبط لدرجة الحموضة 7.0.
- جعل 100 مل من محلول GV تشتت: 20.7 ملي بوكل، 4.3 ملي مول كلوريد الصوديوم، 1.6 ملي نا 2 هبو 4، 0.9 مم KH 2 PO 4، 1 ملم MgCl 2، 1 ملم dithiothreitol (DTT)، 0.1٪ امتصاص العرق. ضبط لدرجة الحموضة 7.0. لتسهيل مزيد من التشتت السريع من هلام النووي، إضافة 10-50 ميكرومتر CaCl 2.
- جعل 500 مل من محلول العمل كبديل. الانتفاخ 0.5 غرام من الجيلاتين التجارية في 20 مل H 2 O ل5-10 دقيقة. إضافة 500 مل الغليان H 2 O ودوامة بعناية لإذابة الجيلاتين. بارد وإضافة CRK 50 ملغ (SO 4) 2 · 12 H 2 O. تصفية مع الشفط وتخزينها في 4 درجة مئوية.
- جعل 10 مل المتوسطة المتزايدة. حل 10 ملغ phenylenediamine في 5 مل برنامج تلفزيوني (135 ملي مول كلوريد الصوديوم، 2.5 ملي بوكل، 4.3 ملي نا 2 هبو 4، 1.5 مم KH 2 PO 4، بعد تعديلها لدرجة الحموضة 9). إضافة 5 مل الجلسرين. مخزن في 250 مكل في -80 درجة مئوية.
2. المواد
- للشرائح subbed، الشرائح مكان 3 بوصة × 1 بوصة زجاج المجهر في حل المنظفات التجارية وفرك لهم لإزالة أي ملوثات. ضع في رفوف الشريحة وشطف جيدا في ماء الصنبور، ثم في الماء منزوع الأيونات. تراجع الشرائح في حل العمل كبديل، واستنزاف في زاوية، وتخبز بين عشية وضحاها في 60 درجة مئوية.
- المربعات البلاستيكية، وقطع 25 الساحات مم من ورقة من 1 ملم بولي سميكة (ميتاكريليت الميثيل). حفرحفرة 5 ملم جولة في وسط كل مربع. الرمال على حد سواء وجوه وحواف مربع فضلا عن محيط الحفرة.
ملاحظة: كبديل لالساحات البلاستيك والشرائح جيدا محلية الصنع، كما هو موضح في الفقرة التالية، استخدام لاصق التجاري في الموقع PCR وغرف التهجين (25 ميكرولتر). يمكن للمرء أن من المحتمل أيضا استخدام إعادة استخدامها عوازل السيليكون للثقافة الخلية، على الرغم من أن ذلك لم يتم اختباره حتى الآن. - للشرائح جيدا، تذوب 20-30 غرام من شمع البارافين (56-57 درجة مئوية) في 50 مل دورق زجاجي على طبق ساخن. مع ماصة 20 ميكرولتر، نشر قطرة واحدة 5 ميكرولتر من البارافين على كل جانب من وسط شريحة subbed. اضغط مربع من البلاستيك في البارافين ووضع شريحة على طبق ساخن. والبارافين تذوب ويجب أن تنتشر بالتساوي تحت مربع من البلاستيك.
- إزالة الشريحة من طبق ساخن واتركها تبرد. وضع الدعم تحت كل نهاية الشريحة، بحيث الشريحة لا اتصال الطاولهETOP أثناء عملية التبريد. إذا كان البارافين يبرد بسرعة كبيرة جدا، قد سحب بعيدا عن حفرة المركزي. إعداد 10 أو أكثر الشرائح جيدا: يستخدم كل إعداد GV شريحة جيدا جديدة.
- لناقلات شريحة لالطرد المركزي، واستخدام شيدت خصيصا لشركات الدوار المستخدمة. توفر العديد من الشركات المصنعة أجهزة الطرد المركزي مع شركات النقل لمدة 96 - جيدا لوحات بلاستيكية. شركات الطيران هذه يمكن تكييفها بسهولة تامة لعقد شرائح المجهر.
3. عزل البويضات
- وضع الضفدع الإناث البالغات من (القيطم المورق أو مداري القيطم) أو السمندل (Ambystoma mexicanum) ما يكفي من حل مخدر لتغطية الحيوان تماما. عندما يتوقف الحيوان الحركة، وضعه البطن حتى على سرير من الثلج المجروش في وعاء مناسب.
- مع مقص جراحي جعل 2 - سم شق 3 في أسفل البطن الوحشي على خط الوسط. نقل الأعضاء الداخلية بلطف جانبا للعثور على المبيض على جانب شق (اليحرث نوعان من المبايض، واحدة على كل جانب من البطن). قطع جزء من المبيض مع البويضات كافية للتجارب مخطط لها. وبما أن هناك الآلاف من البويضات في كل مبيض، قطعة صغيرة نسبيا من المبيض - سوف (1 3 سم) يكفي عادة.
- مكان واحد أو بضع قطع من المبيض في OR2 المالحة في طبق بتري كبير (100 ملم) في درجة حرارة الغرفة. البويضات يمكن تخزينها في حالة جيدة لعدة أيام، إذا تم إزالة البويضات التالفة ويتم تغيير الحل OR2 يوميا.
- خياطة شق مع الحرير الجراحية والعودة الحيوان إلى وعاء زجاجي الفردية لتحقيق الانتعاش. إضافة ما يكفي من "المياه الضفدع" لتغطية الحيوان حتى يستعيد وعيه (حوالي 15 دقيقة). بعد يظهر الحيوان الحركات الطوعية، وملء وعاء مع الماء. على الرغم من أن المياه العذبة وينبغي أن تستخدم، والعقم ليس من الضروري، كما البرمائيات تقريبا لم يصابوا بعد الجراحة. إذا رغبت في ذلك، يمكن تطبيق النيوميسين إلى الغرز. الجرح عادة ما يشفى تماما بعد لا الحصرأيام ث ونفس الحيوان يمكن استخدامها مرة أخرى بعد حوالي 2 أشهر.
4. عزل من جرمينال الحويصلة (GV)
- وضع جزء من المبيض (10-20 البويضات كبيرة) في طبق بتري صغيرة (35 × 10 ملم) التي تحتوي على حل OR2.
- إزالة بويضة من المبيض باستخدام اثنين من أزواج من ملقط # 5 المجوهرات المسيل للدموع ساق رقيقة من الأنسجة التي تربط البويضة على جدار المبيض. وضع البويضة في طبق بتري آخر صغير يحتوي على GV العزلة المتوسطة.
ملاحظة: حالة LBCs يعتمد على حجم (النضج) من البويضة. LBCs تصل طول القصوى مع الحلقات البارزة في البويضات التي هي أقل قليلا من حجم الكامل. غالبا ما تحتوي على البويضات الأكثر نضجا الكروموسومات قصيرة مع الحلقات المتعاقد عليها. - نفذ الخطوات التالية في ظل تضخم منخفض من تشريح المجهر (قطر الحقل حوالي 10-20 ملم).
- فهم البويضة مع كل من أزواج من ملقط قرب القطب الحيواني (نصف الكرة الأرضية المظلمة) وجعل ن خكل المسيل للدموع. ابحث في صفار مقذوف لنواة بويضة شفافة، وتسمى أيضا الحويصلة الجرثومية أو GV.
- بدلا من ذلك، كزة حفرة كبيرة قرب القطب الحيواني مع زوج واحد من الملقط وبلطف اخراج GV جنبا إلى جنب مع صفار البيض (الشكل 2).
- لفة بلطف GV بعيدا عن الجزء الأكبر من صفار البيض. وعادة ما يكون هناك كمية صغيرة من صفار ملتصقة بإحكام على GV.
5. إزالة مغلف النووية
- لاكس المورق والعاشر مداري، ونقل GV من المتوسط العزلة إلى وسيلة نشر في 60 ثانية من العزلة، حتى إذا كان لا يزال هناك القليل من صفار ملتصقة.
ملاحظة: مشاهد عامة من هذين النوعين "التشدد" في غضون نحو 60 ثانية إذا تركت في وسط العزل ولن تنتشر في الخطوات اللاحقة. لذلك السرعة هي ذات أهمية قصوى عند فحص محتويات القيطم GV.- فهم الغلاف النووي بالقرب من أعلى الشاشة GV مع زوج واحدمن ملقط المجوهرات، مع الحرص على عدم الضغط باستمرار. فهم المغلف مع الزوج الثاني من ملقط أقرب إلى أول وقت ممكن. سحب اثنين من أزواج من ملقط بعيدا عن بعضها البعض، وسوف محتويات GV "البوب" للخروج خالية من المغلف، التي تلتزم بإحكام على واحد أو كلا ملقط.
- التقاط محتويات GV في ماصة الزجاج أو قابل للتعديل 20 ميكرولتر micropipette. إذا باستخدام ماصة للتعديل، تعيين ماصة 10 ميكرولتر وقطع نهاية غيض من البلاستيك مع شفرة حلاقة. رسم في 5 ميكرولتر من السائل قبل التقاط GV في 5 ميكرولتر المتبقية.
- نقل محتويات النووية لا تزال تبلور لمركز شريحة جيدا شغل سابقا مع نشر الحل. يجب أن يكون الحل نشر سطح محدب بحيث لا يتم المحاصرين فقاعة عند إضافة ساترة.
- إضافة ساترة (18 ملم)، ووضع شريحة في غرفة رطبة. فإن جل النووي تفريق ببطء على مدى القادم 10-60 دقيقة، حتى يتسنى للكروموسومالصورة والعضيات النووية تأتي على الاستلقاء على سطح شريحة زجاجية.
ملاحظة: مشاهد عامة من السلمندر A. mexicanum وN. viridescens لا "تصلب" على نحو غير ملائم في وسط العزل. لذلك يمكن للمرء أن المضي قدما أكثر على مهل مع إزالة الغلاف النووي من علبة واحدة مع القيطم.
- إزالة الغلاف النووي من GV السمندل كما هو موضح في القسم 5.1.1، ولكن القيام بذلك على المدى المتوسط العزلة.
- التقاط محتويات GV تبلور قليلا مع ماصة ونقل إلى طبق بتري تحتوي على حل الانتشار.
- شطف بسرعة غيض ماصة في حل نشر، والتقاط هلام النووي، ووضعه في وسط شريحة جيدا شغل سابقا مع نشر الحل. إضافة ساترة 18 ملم ووضع الشريحة بأكملها في غرفة رطبة. سوف تستنزف النووي تفريق ببطء على مدى القادم 10-60 دقيقة وسوف الكروموسومات والعضيات النووية يأتي على الاستلقاء على سطح الزجاج. </ رأ>
6. مراقبة الأولية LBCs والعضيات
- عرض LBCs والعضيات النووية على النقيض من المرحلة (المجهر تستقيم التقليدية) في التكبير المنخفض بعد تشتت محتويات النووية في الغرفة الانتشار. لأن الغرفة هي حوالي 1 ملم عميقة ومحتويات النووية هي في القاع، واستخدام الهدف تضخم منخفض مع مسافة العمل الطويلة (5X - 10X).
ملاحظة: السبب الرئيسي للدراسة إعداد في هذا الوقت هو لتحديد ما إذا كان الأمر يستحق تحمل من خلال الخطوات التالية. في التحضير الجيد الكروموسومات هي دون انقطاع، وقد استقر في الجزء السفلي من الغرفة. انتقل إلى الخطوة الطرد المركزي في غضون ساعة من جعل التحضير، حيث سيؤدي ذلك إلى ضمان مرفق الأمثل للحلقات فرجونية كروموسوم إلى الشريحة.
7. الطرد المركزي من المحتويات النووية
- ضع قطعة من ورق الترشيح على ساترة واضغط لأسفللإزالة السائل الزائد من الغرفة.
- وضع حوالي 1 ملم 3 من الفازلين على كل جانب من ساترة. إذابة الفازلين بقضيب معدني ساخن إلى حوالي 70-80 درجة مئوية لختم ساترة على الساحة البلاستيك الأساسي.
- مكان الشرائح في شركات الطيران شريحة لالطرد المركزي، والتأكد من الناقلات التي المعاكس متوازنة. أجهزة الطرد المركزي الشرائح في حوالي 4800 x ج لمدة 30 دقيقة - 1 ساعة. في 4 درجة مئوية استخدام ميزة بداية بطيئة في أجهزة الطرد المركزي.
8. تحديد المحتويات النووية
- بالنسبة لمعظم الإجراءات اللاحقة، وتحديد محتويات النووية مع امتصاص العرق.
- وضع رف الشريحة في طبق تلطيخ المجهر الشريحة القياسية ثم وضع الشرائح بشكل فردي في الرف. إضافة تثبيتي يكفي لتغطية الشرائح (2-4٪ لامتصاص العرق في OR2 أو PBS).
- مع زوج من الملقط حادة، ودفع ساترة أفقيا، يستلم، وتخلص منه في سلة المهملات الزجاج المناسبة.ترك الشرائح في تثبيتي لا يقل عن 15 - 30 دقيقة. لفي الموقع التهجين والبقع الأكثر الأجسام المضادة، فترات أطول من تثبيت (ح أو د) هي المسموح بها.
- لإزالة مربع من البلاستيك، ومكان الشرائح في وقت واحد في الجليد الباردة OR2 أو برنامج تلفزيوني في طبق تلطيخ. إدراج شفرة حلاقة حادة على حافة مربع من البلاستيك ويحيلها رخوة.
ملاحظة: من الناحية المثالية البلاستيك سوف تؤتي ثمارها نظيفة، وترك جميع شمع البارافين على الشريحة. يقدم الشمع غرضا مفيدا: لأنه يحيط المنطقة الوسطى الصغيرة، حيث تم إرفاق محتويات النووية إلى الشريحة، انها بمثابة السد الذي يسمح احد للعمل مع كميات صغيرة (5-10 ميكرولتر) الكاشف لالمناعية وغيرها. الشرائح يمكن عقد إلى أجل غير مسمى في OR2 البارد أو برنامج تلفزيوني.
9. المناعية من LBCs والعضيات النووية
- إزالة إعداد GV ثابتة من تخزين في OR2 أو برنامج تلفزيوني. تمحو السائل الزائد ومكان على الدعم في غرفة رطبة. وتعمدت مريحةإيه هو 90 × 15 مم طبق بتري تحتوي على دائرة 90 ملم من ورق الترشيح رطبة.
ملاحظة: عند هذه النقطة هي التي تعلق على محتويات النووية بقوة إلى الشريحة في منطقة دائرية 5 مم خالية من شمع البارافين. لأن الشمع هو الماء طارد، يمكن للمرء تغيير الحلول من خلال إضافة وإزالة كميات صغيرة من السائل إلى حافة المنطقة المركزية مع ماصة 20 ميكرولتر. الاحتياطات الرئيسي هو تجنب لمس منطقة خالية من الشمع مع طرف ماصة. - تنفيذ المناعية مع كميات صغيرة (10-20 ميكرولتر) من الكواشف. لأن الكروموسومات والعضيات النووية هي صغيرة جدا وعلى اتصال مباشر مع الكواشف وأضاف، أن بروتوكولات تلطيخ تكون قصيرة. مرات تلوين الأجسام المضادة الأولية والثانوية يمكن أن تكون قصيرة بقدر 1 ساعة أو أقل. لا تشمل المنظفات في أي خطوة، وهذا يسبب ضررا للإعداد. إذا رغبت في ذلك، وصمة عار على إعداد مع دابي (1 ميكروغرام / مل) ل10-20 دقيقة لإبراز محاور LBCs.
- جبل في الجلسرين أو جبل التجاريجي مناسبة سيلة لالمناعي. لتجنب محاصرة فقاعة الهواء أثناء الخطوة المتصاعدة، والمضي قدما على النحو التالي.
- سحب 15 ميكرولتر من تصاعد المتوسطة في غيض من ماصة 20 ميكرولتر. إزالة كسائل أكبر قدر ممكن من المنطقة على الفور حول انتشار النووي "فتل" تشغيله مع قطعة من ورق الترشيح (قطع على شكل مثلث رقيقة جدا من دائرة 90 ملم من رقم 1 ورقة فلتر).
- ماصة معظم المتوسطة المتزايدة على إعداد، والحرص على عدم لمس المنطقة من انتشار الأسلحة النووية. وضع 1 ميكرولتر الماضية أو نحو ذلك من تصاعد المتوسطة في وسط ساترة 22 مم (سمك # 1.5). عكس ساترة على إعداد وإسقاط بعناية في مكانها.
- ليتصاعد مؤقتة، وتصل إلى بضعة أيام، استخدم 1 ملغ / مل phenylenediamine في 50٪ الجلسرين. ليتصاعد دائمة، خاصة بالنسبة للدراسات superresolution، استخدم المتوسطة مضان منخفض أن يصلب لمعامل الانكسار من حوالي 1.46.
10. نيون في الموقع التهجين (FISH) لLBCs والعضيات النووية
- لأن بروتوكولات FISH تتطلب عادة خطوة في درجة حرارة مرتفعة، وإزالة شمع البارافين من التحضير. كشط بعناية بشفرة حلاقة، على الرغم من أن هذا الإجراء هو مملة ويمكن أن يؤدي إلى تلف عرضي من التحضير. ومن المفيد للاحتفال مجال التحضير على الجزء الخلفي من الشريحة مع نقطة الماس.
- بدلا من ذلك، حل شمع البارافين مع زيلين. اقامة سلسلة من الجرار Coplin أو أطباق تلطيخ تحتوي على: 30٪، 50٪، 70٪، 95٪، والإيثانول بنسبة 100٪. 3 حاويات من زيلين. 2 حاويات المزيد من الايثانول٪ 100 والأسيتون واحد.
- وضع الشرائح في الناقل الشرائح ويذوى منهم في سلسلة الإيثانول، وترك شرائح 3-5 دقيقة في كل تركيز (أقصر الأوقات إذا تحريكها).
- حل شمع البارافين عن طريق تمرير الشرائح من خلال 3 حاويات من زيلين، حوالي 5 دقائق لكل منهما إذا تحريكها. مسح الالزيلين عن طريق تمرير من خلال اثنين من 100٪ ethanols، وأخيرا إزالة الايثانول مع الأسيتون. تأخذ الشرائح من الأسيتون وتشجيعهم لتجف.
- تنفيذ في الموقع التهجين باستخدام أي بروتوكول قياسي. 15،16
11. عزل من GV تحت النفط
- التقاط البويضة من الحل OR2 مع ملقط المجوهرات، بما في ذلك الأنسجة المحيطة أقل قدر ممكن. وضع البويضة على قطعة صغيرة من رقم 1 ورق الترشيح. وحل OR2 الزائد نقلها إلى ورقة الترشيح، وترك البويضة تقريبا خالية من السائل. التقاط "الجافة" بويضة ووضعه تحت سطح النفط الوزن المعدنية الخفيفة (زيت البرافين) في طبق بتري صغيرة (35 × 10 ملم).
- مع إبرة التنغستن غرامة أو طينة واحدة من الملقط، كزة ثقب صغير في البويضة بالقرب من القطب الحيواني الظلام. التقاط البويضة مع زوج واحد من ملقط (تجنب النصائح) والضغط بلطف. سوف GV قذف جنبا إلى جنب مع أصغر أو لكمية arger من صفار البيض على سطحه (الشكل 3).
- إزالة الكثير من صفار ممكن عن طريق تجتاح بلطف GV مع الجانب ملقط. في معظم الحالات، سوف يكون من الصعب إزالة كافة صفار البيض. ومع ذلك، بالنسبة لمعظم الأغراض كمية صغيرة من صفار البيض ليست مشكلة.
- لمراقبة محتويات GV، تتسطح GV إلى حد أكبر أو أقل.
- إزالة مربع البلاستيك من شريحة جيدا واستخدام شمع البارافين المتبقية بمثابة وعاء ضحل لزيت البرافين. 10 التقط GV جنبا إلى جنب مع زيت البارافين في ماصة 20 ميكرولتر ونقل إلى مركز منطقة البارافين. إضافة ساترة ومراقبة محتويات GV بالارض جزئيا. هذا الأسلوب لا تضر LBCs.
- بدلا من ذلك، تتسطح GV إلى ما يقرب من 10 ميكرون سمك لمراقبة العضيات النووية.
- قطع النهائي 1 ملم من غيض ماصة بلاستيكية بشفرة حلاقة حادة. تمتص GV فيتلميح جنبا إلى جنب مع بالضبط 5 ميكرولتر من الزيوت المعدنية. بثق GV وكل النفط على مركز ساترة زجاج 22 مم.
- خفض شريحة 3 "س 1" زجاج القياسية ببطء حتى مجرد تلامس انخفاض اسعار النفط. سيتم رفع قطرة وساترة من الشعرية وسوف النفط تنتشر على حواف ساترة. عندما انتشر انخفاض تماما، فإن النفط سيكون حوالي 10 ميكرون سميكة. سوف تتضرر LBCs وسيتم ضغط نويات كبيرة قليلا، ولكن معظم العضيات النووية الصغيرة سوف تظهر أكثر أو أقل لأنها موجودة في GV سليمة (الشكل 3).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
لفحص الكروموسومات فرجونية عملاقة واحدة تبدأ من خلال عزل البويضات من الضفادع أو السمندل. ويبين الشكل 1 مجموعة من البويضات الناضجة في محلول ملحي مخزنة بعد إزالة من المبيض من الضفادع، القيطم. لا تزال هذه البويضات في حالة جيدة لعدة أيام في درجة حرارة الغرفة. ثم تتم إزالة النواة (أو الحويصلة الجرثومية) من بويضة مع ملقط المجوهرات، سواء في محلول ملحي (الشكل 2) أو في مجال النفط (الشكل 3). محتويات النووية لنواة معزولة للنفط يمكن فحصها من قبل سحق بلطف نواة ومراقبة على النقيض من مرحلة أو فرق التدخل النقيض (DIC) المجهري. لفحص محتويات النواة التي تم عزلها في محلول ملحي، يجب على المرء أولا إزالة الغلاف النووي مع ملقط المجوهرات والسماح للمحتويات ليستقر على شريحة المجهر. ثم يتم طرد إعداد إرفاق رانه الكروموسومات بحزم إلى الشريحة، وبعد ذلك الكروموسومات يمكن ملطخة الأجسام المضادة (الشكل 4) أو يتعرضون لفي الموقع التهجين. الكروموسومات فرجونية من السلمندر هي أكبر بكثير من تلك الضفادع (الشكل 5). وفي كلتا الحالتين يمكن أن ينظر إلى وحدة النسخ الفردية (الجينات)، وحلقات من لونين إسقاط أفقيا من محور كروموسوم.
الشكل 1: الناضجة البويضات من اكس مداري الضفدع. المبيض من الضفادع الإناث الناضجة على آلاف من البويضات في مراحل مختلفة من النضج. أصغر هي حجم الخلايا الجسدية ووصلت بالفعل إلى الطور الأول من الميتوزي الأول. كما تنمو البويضة، فإنه يتراكم تدريجيا صفار البيض، والذي يعطي الخلية مظهر أبيض معتم. أكبر حصيرةالبويضات لدى عودتهم، كما هو موضح هنا، يكتسب غطاء أغمق بسبب تراكم صبغة الميلانين. أكبر البويضات من اكس مداري حوالي 0.8 مم في القطر، وتلك التي عاشرا المورق حوالي 1.4 ملم، في حين أن من قنفذ البحر ما يقدر هائلة 2.2 مم. باستثناء حجم، كل الثلاثة متشابهة في المظهر العام. شريط مقياس = 1 مم.
الشكل 2: إزالة من GV من سيت من اكس مداري. اليسار. وقدم ثقب صغير مع ملقط صائغ في القطب الحيواني المظلم من بويضة وكان GV مقذوف بلطف. في هذا المثال كان GV تقريبا خالية من صفار البيض لأنه خرج من البويضة. صفار ملتصقة يمكن إزالتها عن طريق مص GV داخل وخارج ماصة مع قطر الحافة فقط أكبر قليلا من قطر GV نفسها. حق. تhree مشاهد عامة من اكس مداري. تركت هذه لقطات عامة لبضع دقائق في المتوسط (GV حل العزلة تعديلها لدرجة الحموضة 5.8) حامض قليلا، والذي يسبب الغلاف النووي إلى تضخم بعيدا عن محتويات النووية تبلور. ومشاهد عامة يعامل بهذه الطريقة لم تنتشر على الفحص الخلوي. ومع ذلك، هذه لقطات عامة مثالية للتحليل الجزيئي: يمكن إزالة المغلف مع المجوهرات ملقط، وتوفير عينة من محتويات النووية خالية تماما من التلوث حشوية. 17،18 شريط مقياس = 0.5 مم. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل (3): GV من اكس مداري المعزولة في النفط. اليسار. بعد أن تم عمل ثقب صغير في البويضة بالقرب من بو الحيوان الظلامجنيه، بدأت GV لبثق. في هذه الحالة جاء GV الخروج مع أي ما يقرب من صفار ملتصقة. الوسط. وGV هو الآن خالية تماما من السيتوبلازم البويضة. تستمر هذه مشاهد عامة لنسخ الحمض النووي الريبي لساعات. حق. بعد سحق وGV بلطف في النفط تحت ساترة، العضيات النووية يمكن عرضها من قبل مدينة دبي للإنترنت، كما هو موضح هنا، أو عن طريق النقيض من المرحلة. وGV كله هو أكبر بكثير من مساحة صغيرة كما هو موضح هنا. HLB = الجسم هيستون مكان مع ثلاث بقع على سطحها. شريط مقياس = 0.5 ملم لوحات الأولين، 10 ميكرون للثالث. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 4: فرجونية الكروموسومات (LBCs) من قنفذ البحر A. mexicanum. اليسار. حق. إعداد نفسه ينظر اليه من جانب إضاءة الساحة المظلمة. يمكن للمرء أن يرى الآن العديد من نويات تضخيم غير ملوثين. شريط مقياس = 250 ميكرون. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الرقم 5: LBC واحدة من قنفذ البحر A. mexicanum ومداري الضفدع اكس، في التكبير نفسه. هذه الصور توضح اختلاف حجم المدقع بين LBCs من السمندل والضفدع (الشكل). حجم مختلفام يرتبط المحتوى الكلي لمجموع الحمض النووي للجينوم (حوالي 30 زوج الجنيه الإسترليني لA. mexicanum مقابل 1.7 الجنيه الإسترليني لاكس مداري). الحلقات الجانبية الفردية (وحدات النسخ) هي أيضا وقتا أطول في السمندل مما كانت عليه في الضفدع. شريط مقياس = 100 ميكرون. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
وتمت هذه الملاحظات الأولى من LBCs "الحياة" من مشاهد عامة معزولة يد الضفادع والسلمندر قبل نحو 80 سنوات من قبل عالم الأحياء الأمريكي وليام Duryee، 19 قبل إدخال النقيض من مرحلة ومدينة دبي للإنترنت المجهر، قبل المناعية الفلورسنت، وقبل FISH. مزايا LBCs للتحقيق في تفاصيل هيكل كروموسوم والنسخ على مستوى الجينات الفردية تنمية المطلوب من تقنيات إرفاق LBCs على الشرائح الزجاجية، لمعالجتها بطريقة واقعية، وتطبيق التقنيات الجزيئية دون تدمير التشكل الأساسي. تقريبا كل تقنية لتحقيق هذه الأهداف يتطلب بعض التكيف مع الأنواع قيد التحقيق وبعض الحلول الوسط بين الحفاظ نابض بالحياة والتوصيف الجزيئي. على سبيل المثال، لقطات عامة وLBCs من البرمائيات الذيل من السهل على غير العادة للعمل مع لحجمها الهائل والسهولة التي محتويات GV تفريق في الوسط المناسب. Until الأخيرة، ومع ذلك، فإن القليل جدا من المعرفة حول علم الجينوم، مما يجعل من الصعب ربط ثروة من الميزات الخلوي مع التفاصيل الجزيئية. على العكس من ذلك، LBCs من القيطم صغيرة جدا مقارنة مع تلك التي البرمائيات الذيل (الشكل 5)، ولكن تم التسلسل جينومات كل من اكس مداري وعاشرا المورق وتوضع حواشي جيدا إلى حد معقول.
بالنسبة لأولئك أول استخدام لقطات عامة من البرمائيات، فإن التحدي الرئيسي يتمثل في عزل GV وإزالة الغلاف النووي دون الإضرار LBCs. حتى الآن، لا أحد قد اكتشف طريقة لإزالة المغلف إلا باليد مع ملقط المجوهرات. سيكون من تقدم تقني كبير إذا وجدت وسيلة ل"حل" أو "هضم" المغلف ولكن ترك الكروموسومات والعضيات النووية الأخرى لم يلحق بها أذى. سيكون لهذه التقنية أن تكون مفيدة أيضا للدراسات الجزيئية. في تحقيقاتنا على الحمض النووي الريبي النووي وحشوية وجدنا أنه من الضروري لإزالة الغلاف النووي قبل تحليل الحمض النووي الريبي النووي (الشكل 2). 17،18 إذا لم يتم إزالة المغلف، وطغى على كمية صغيرة من الحمض النووي الريبي النووي RNA عن طريق تلويث حشوية أن تلتزم الخارجي للغلاف.
سوف تحسن كبير آخر هو اكتشاف بعض الطريق إرفاق LBCs أكثر إحكاما على شريحة المجهر. الطرد المركزي من إعداد أمر بالغ الأهمية، ولكن حتى الطرد المركزي لفترة طويلة (1 ساعة في 4500 x ج) لا يضمن المرفق. يمكن للمرء أن أقول عادة عندما يتم LBCs تعلق بشكل جيد من قبل دراستها مع تباين مرحلة تحت التكبير المتوسط. حسنا المرفقة الكروموسومات لا تظهر أي حركة البراونية على الإطلاق. إن وجدت الحركة البراونية من الحلقات قابلا للاكتشاف، واللاحقة المناعية أو FISH بروتوكولات يؤدي إلى ضرر أو خسارة مادية جسيمة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Paraformaldehyde (reagent grade, crystalline) | Sigma-Aldrich | P6148-500G | Despite warnings in many protocols, a concentrated solution can be stored indefinitely at RT |
| Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate | Sigma-Aldrich | A5040-100G | Sometimes referred to as MS-222 |
| Ethicon RB-1 1/2 circle taper point 3-0 sutures | VWR | 95057-000 | |
| Paraplast (paraffin wax) | Sigma-Aldrich | P3558-1KG | |
| p-Phenylenediamine | Sigma-Aldrich | P6001 | |
| Gelatin | Grocery Store | Commercial Knox gelatin works fine | |
| ProLong Gold antifade mountant | ThermoFisher Scientific | P10144 | |
| Gold Seal cover glass 22 x 22 mm #1 1/2 (0.16 - 0.19 mm thick) | Electron Microscopy Sciences | 63786-01 | These coverslips are the recommended thickness for superresolution microscopy |
| Dumont forceps #5 | Electron Microscopy Sciences | 72700-D | http://www.emsdiasum.com/microscopy/products/tweezers/dumont_positive_action.aspx |
| Paraffin oil (light) | EMD Chemicals | PX0047-1 | For isolating GVs in oil |
| Adhesive in situ PCR and hybridization chambers (25 µL) | BioRad | Frame-Seal Slide Chambers #SLF0201 | http://www.bio-rad.com/en-us/sku/slf0201-frame-seal-slide-chambers |
| Silicone isolators | Grace-Biolabs | select from catalog link | http://www.gracebio.com/life-science-products/microfluidics/silicone-isolators.html |
| Coplin jars and staining dishes | Electron Microscopy Sciences | select from catalog link | http://www.emsdiasum.com/microscopy/products/histology/staining.aspx |
References
- Purkinje, J. E. Symbolae ad ovi avium historiam ante incubationem. , Leopold Vossi. (1830).
- Rückert, J. E. Zur Entwickelungsgeschichte des Ovarialeies bei Selachiern. Anat. Anz. 7, 107-158 (1892).
- Callan, H. G. Lampbrush Chromosomes. 36, Springer-Verlag. (1986).
- Gall, J. G., Callan, H. G., Wu, Z., Murphy, C. Lampbrush chromosomes. Xenopus laevis: Practical Uses in Cell and Molecular Biology. Kay, B. K., Peng, H. B. Vol. 36 Methods in Cell Biology , Academic Press. 149-166 (1991).
- Gall, J. G., Wu, Z. Examining the contents of isolated Xenopus germinal vesicles. Methods. 51, 45-51 (2010).
- Penrad-Mobayed, M., Kanhoush, R., Perrin, C. Tips and tricks for preparing lampbrush chromosome spreads from Xenopus tropicalis oocytes. Methods. 51, 37-44 (2010).
- Morgan, G. T. Working with oocyte nuclei: cytological preparations of active chromatin and nuclear bodies from amphibian germinal vesicles. Methods Mol. Biol. 463, 55-66 (2008).
- Paine, P. L., Johnson, M. E., Lau, Y. T., Tluczek, L. J., Miller, D. S. The oocyte nucleus isolated in oil retains in vivo structure and functions. Biotechniques. 13, 238-246 (1992).
- Handwerger, K. E., Cordero, J. A., Gall, J. G. Cajal bodies, nucleoli, and speckles in the Xenopus oocyte nucleus have a low-density, sponge-like structure. Mol Biol Cell. 16, 202-211 (2005).
- Patel, S., Novikova, N., Beenders, B., Austin, C., Bellini, M. Live images of RNA polymerase II transcription units. Chromosome Res. 16, 223-232 (2008).
- Gall, J. G.
- Löschberger, A., et al. Super-resolution imaging visualizes the eightfold symmetry of gp210 proteins around the nuclear pore complex and resolves the central channel with nanometer resolution. J Cell Sci. 125, 570-575 (2012).
- Gottfert, F., et al. Coaligned dual-channel STED nanoscopy and molecular diffusion analysis at 20 nm resolution. Biophys J. 105, L01-L03 (2013).
- Wallace, R. A., Jared, D. W., Dumont, J. N., Sega, M. W. Protein incorporation by isolated amphibian oocytes: III. Optimum incubation conditions. J. Exp. Zool. 184, 321-333 (1973).
- Bridger, J. Fluorescence in situhybridization to DNA. Cells: A Laboratory Manual. Spector, D. L., Goldman, R. D., Leinwand, L. A. 3, Cold Spring Harbor Press. 111.111-111.136 (1998).
- Singer, R. H. In situ hybridization to RNA. Cells: A Laboratory Manual. Spector, D. L., Goldman, R. D., Leinwand, L. A. 3, Cold Spring Harbor Press. 111-116 (1998).
- Gardner, E. J., Nizami, Z. F., Talbot, C. C. Jr, Gall, J. G. Stable intronic sequence RNA (sisRNA), a new class of noncoding RNA from the oocyte nucleus of Xenopus tropicalis. Genes Dev. 26, 2550-2559 (2012).
- Talhouarne, G. J., Gall, J. G. Lariat intronic RNAs in the cytoplasm of Xenopus tropicalis oocytes. RNA. 20, 1476-1487 (2014).
- Duryee, W. R. Isolation of nuclei and non-mitotic chromosome pairs from frog eggs. Arch. Exp. Zellforsch. 19, 171-176 (1937).
