Summary
Vi præsenterer enkle teknikker til isolering gigantiske transkriptionelt aktive børstekromosomer kromosomer fra levende oocytter af frøer og salamandre. Vi beskriver, hvordan overholdelse af disse kromosomer "live" af fasekontrast eller differentiel interferens kontrast, og hvordan man kan løse dem for fluorescerende in situ hybridisering eller immunfluorescensfarvning.
Abstract
Vi beskriver metoder til at studere de gigantiske transkriptionelt aktive børstekromosomer kromosomer (LBC'er) findes i ægget, eller unlaid æg, frøer og salamandre. Individuelle LBC'er kan være op til 1 mm i længden og de bor i et gigantisk kerne, selv op til 0,5 mm i diameter. Den store størrelse af kromosomerne tillader enestående observationer af aktive gener ved let optisk mikroskopi, men samtidig er nødvendigt med særlige teknikker til isolering kernen, fjerne kernemembranen, og spredning kromosomerne på et objektglas. Oocyt kerne, også kaldet germinale vesikel (GV), isoleres i et medium, der tillader delvis gelering af nukleare actin og bevarer den fine struktur af LBC'er. Dette trin udføres manuelt under et dissektionsmikroskop under anvendelse smykkeforretninger pincet. Dernæst kernekappen fjernet, igen manuelt med smykkeforretninger pincet. De nukleare indhold hurtigt overført til et medium, der disperses actin gel og tillader de ubeskadigede LBC'er til rette på et objektglas. På dette tidspunkt LBC'er og andre nukleare organeller kan ses af fasekontrast eller differentiel interferens kontrast mikroskopi, skønt finere detaljer skjules af Brownsk bevægelse. For høj opløsning mikroskopisk observation eller molekylær analyse, er hele forberedelse centrifugeret for at fastgøre de sarte LBC'er fast til slæden. En kort fiksering i paraformaldehyd efterfølges af immunfluorescensfarvning eller in situ hybridisering. LBC'er er i en transkriptionelt aktiv tilstand og deres enorme størrelse tillader molekylær analyse på det individuelle gen niveau ved hjælp af konfokal eller super-opløsning mikroskopi.
Introduction
De fleste hvirveldyr, med undtagelse af pungdyr og placentale pattedyr, producere store yolky æg. På trods af deres til tider enorme størrelse, disse æg er enkelte celler, der når deres endelige dimension, mens du stadig i æggestokken af den kvindelige. Æggestokkene æg kaldes oocytter og hver indeholder typisk en enkelt giant kerne, kendt siden begyndelsen af det 19. århundrede som germinale vesikel eller blot GV. 1 oocytter fra de almindelige forsøgsdyr frøer, Xenopus laevis og Xenopus tropicalis, nå en maksimal diameter af 1,2 mm og 0,8 mm (figur 1). De GV'er fra modne oocytter fra disse to frøer er 0,3 - 0,4 mm i diameter (figur 2, 3). Salamandre har typisk endnu større oocyter og GV'er. Fuldt modne oocytter af den mexicanske Axolotl, Ambystoma mexicanum, er mere end 2 mm i diameter og GV er omkring 0,5 mm. Således er disse kerner er umiddelbart synlige for det blotte øje og kanmanipuleres på mange måder, som er umulige med kernerne i typiske somatiske celler.
Lige så bemærkelsesværdigt er det gigantiske størrelse kromosomerne i GV, en kendsgerning anerkendt allerede i slutningen af det 19. århundrede. Individuelle kromosomer Ambystoma og andre salamandre kan være op til 1 mm i længden (figur 4, 5). De af Xenopus er betydelige mindre, selvom med længder på op til 100 um eller mere, de dværg de typiske somatiske kromosomer fleste organismer. Et vigtigt træk ved oocyt kromosomer er deres ekstraordinære transkriptionel aktivitet, hvilket fører til en af deres mest karakteristiske morfologiske træk - hundredvis af parrede laterale loops (figur 5). Hver sløjfe består af en eller nogle få transkriptionsenheder, der aktivt syntetiserer RNA. Løkkerne giver oocyt kromosomer en fuzzy udseende, som førte til navnet "børstekromosom" kromosom efter deres overfladiskelighed med børsterne, der anvendes i tidligere tider at rense petroleumslampe skorstene. 2
Fokus for dette oplæg er på brugen af isolerede GV'er at studere LBC'er og nukleare organeller (nucleoli, histon locus organer og prikker). To ret forskellige teknikker vil blive beskrevet. I den første, mere almindelig teknik, er GV'er isoleret i en saltvandsopløsning ved hjælp smykkeforretninger pincet, skylles kortvarigt at fjerne vedhæftende æggeblomme, og kernekappen fjernes, igen med smykkeforretninger pincet. De gelatinøse indhold, der indeholder LBC'er og nukleare organeller, får lov til at slå sig ned på et objektglas eller dækglas. Sådanne præparater kan undersøges direkte ved fasekontrast eller DIC mikroskopi. Alternativt kan præparater centrifugeres at fastgøre LBC'er og organeller til dias eller dækglas. Sådanne præparater kan derefter bearbejdes til detaljeret molekylær analyse af nukleinsyrer og proteiner, primært ved immunofluorescens og fluorescent in situ hybridisering (FISH). 3-7
En anden teknik indebærer isolering af GV i mineralolie. 8 Olie-isolerede GV'er forblive transkriptionelt aktiv i mange timer og er potentielt nyttige for undersøgelser, hvor man ønsker de nukleare indhold til at være så naturtro som muligt. 9,10 Fordi brydningsindekset for den nukleare "saft" er tæt på den for de LBC'er og andre nukleare organeller (figur 3), kan mikroskopiske teknikker være en udfordring med olie-isolerede GV'er.
Endelig grund af deres størrelse og nem manipulation, GV'er er ideelle materiale til undersøgelser af den nukleare kuvert. Det nukleare pore kompleks blev først beskrevet fra elektron mikroskopiske undersøgelser af padder GV kuverter 11 og nyere superresolution observationer har brugt det samme materiale. 12,13
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Generel information om frøer og salamandre, samt kilder af dyr, kan findes på følgende hjemmesider: Xenbase (http://www.xenbase.org) og Sal-Site (http://www.ambystoma.org). Denne protokol følger retningslinjerne for dyr pleje af Institut for Embryologi af Carnegie Institution for Science.
1. Opløsninger
- Lav 10 L "frøen vand": Tilsæt 10 ml 1 M CaCl2 og 10 ml 1 M NaHCO 3 til 10 L deioniseret eller dechlorinated H2O med omrøring.
- Lav en L 20% paraformaldehyd: Lav 1 liter 4 mM Na 2 CO 3. I en kemisk hætte tilsættes 200 g pulveriseret paraformaldehyd, og opvarm til ca. 80 ° C til opløsning. Cool, og filtreres gennem filtrerpapir. Forsigtig: paraformaldehyd er giftige og skal håndteres med forsigtighed. Alternativt købe kommercielle paraformaldehydopløsning.
- Lav 1 L padde bedøvelsesmiddel løsning: Tilføj 1,5 g ethyl 3-aminobenZoate methansulfonat til en L frøen vand. Opbevares ved stuetemperatur.
- Lav 1 L oocyt dyrkningsmedium OR2 14: 82.5 mM NaCl, 2,5 mM KCI, 1 mM CaCl2, 1 mM MgCl2, 1 mM Na 2 HPO 4, 5 mM HEPES (fra 500 mM stamopløsning, pH 8,3). Slut-pH vil være ca. pH 7,8. Tilsæt 100 mg ampicillin og 100 mg streptomycin for at forhindre bakterievækst.
- Lav 1 L GV isolation opløsning: 83 mM KCI, 17 mM NaCl, 6,5 mM Na 2 HPO 4, 3,5 mM KH 2 PO 4, 1 mM MgCl2, 1 mM dithiothreitol (DTT). Juster til pH 7,0.
- Gør 100 ml GV spredning opløsning: 20,7 mM KCI, 4,3 mM NaCl, 1,6 mM Na 2 HPO 4, 0,9 mM KH 2 PO 4, 1 mM MgCl2, 1 mM dithiothreitol (DTT), 0,1% paraformaldehyd. Juster til pH 7,0. For at lette en hurtigere spredning af den nukleare gel, tilsættes 10-50 uM CaCl2.
- Lav 500 ml subbing løsning. Swell 0,5 g kommerciel gelatine i 20 mL H 2 O i 5 - 10 min. Tilføj 500 ml kogende H2O og omhyggeligt hvirvel for at opløse gelatinen. Cool og tilsæt 50 mg CRK (SO 4) 2 · 12 H2O Filter med sug og opbevares ved 4 ° C.
- Lav 10 ml montering medium. Opløs 10 mg phenylendiamin i 5 ml PBS (135 mM NaCl, 2,5 mM KCI, 4,3 mM Na 2 HPO 4, 1,5 mM KH 2 PO 4, indstillet til pH 9). Tilsæt 5 ml glycerol. Opbevares i 250 pi alikvoter ved -80 oC
2. Materialer
- For subbed dias, sted 3 tommer x 1 tomme glas objektglas i en kommerciel rengøringsmiddel og gnid dem for at fjerne eventuelle forureninger. Placer i en slide rack og skyl godt i ledningsvand, derefter i deioniseret vand. Dyp dias i subbing løsning, drænes i en vinkel, og bages natten over ved 60 ° C.
- For plast firkanter, skæres 25 mm kvadrater af et ark af 1 mm tyk poly (methylmethacrylat). Bor et5 mm rundt hul i midten af hver firkant. Sand begge flader og kanter kvadratet samt omkredsen af hullet.
BEMÆRK: Som alternativ til hjemmelavet plast torve og vel dias, som beskrevet i næste afsnit, skal du bruge kommerciel lim in situ PCR og hybridisering kamre (25 ul). Man kunne sikkert også bruge genbrugelige silikone isolatorer til cellekultur, selv om dette ikke er blevet grundigt testet endnu. - For såvel dias, smelte 20 - 30 g paraffin (56-57 ° C) i en 50 ml glas bægerglas på en varmeplade. Med en 20 pi pipette, spredes en 5 pi dråbe paraffin på hver side af midten af en subbed objektglas. Tryk på en plastik firkant ind i paraffin og placer slide på den varme plade. Paraffinen vil smelte og bør fordeles jævnt under plastikken firkant.
- Fjern dias fra varmepladen og lad den køle. Placer en støtte under hver ende af slæden, så at glideren ikke kommer i kontakt med tabletop under køleprocessen. Hvis paraffinen afkøles for hurtigt, kan det trække sig væk fra det centrale hul. Forbered 10 eller flere såvel dias: hver GV forberedelse bruger en ny brønd dias.
- For slide bærere for centrifugering bruge specielt konstrueret luftfartsselskaber for rotoren anvendes. Flere producenter giver centrifuger med bærere for 96 - godt plastplader. Disse bærere kan tilpasses helt let at holde objektglas.
3. Isolering af oocytter
- Placer en voksen kvinde frog (Xenopus laevis eller Xenopus tropicalis) eller salamander (Ambystoma mexicanum) i tilstrækkelig bedøvelse løsning til at dække dyret helt. Når dyret ophører bevægelsen, placere den mave-up på en seng af skåret is i en egnet beholder.
- Med kirurgiske sakse lave en 2 - 3 i cm snit i underlivet lateralt for midterlinien. Flytte de indre organer forsigtigt til side for at finde ovariet på siden af indsnittet (there er to æggestokke, en på hver side af underlivet). Skære en del af æggestokkene med nok oocytter til de planlagte eksperimenter. Da der er tusindvis af oocytter i hver æggestok, en relativt lille stykke af æggestok - vil (1 3 cm) sædvanligvis være tilstrækkeligt.
- Placere en eller nogle få stykker af ovarie i OR2 saltvand i en stor petriskål (100 mm) ved stuetemperatur. Oocytter kan opbevares i god stand i flere dage, hvis beskadigede oocytter fjernes, og OR2 løsningen ændres dagligt.
- Sy snittet med kirurgisk silke og sende dyret tilbage til en individuel glasskål til nyttiggørelse. Tilføj lige nok "frøen vand" til at dække dyret, indtil det kommer til bevidsthed (ca. 15 min). Efter dyret viser frivillige bevægelser, fylde skålen med vand. Selv om der bør anvendes ferskvand, sterilitet er ikke nødvendigt, da padder næsten aldrig bliver smittet efter operationen. Om ønsket kan neomycin anvendes på suturerne. Såret normalt heler fuldstændigt efter en few dage og det samme dyr, kan bruges igen efter ca 2 måneder.
4. Isolering af et kimblære (GV)
- Placer en del af ovarie (10 - 20 store oocytter) i en lille petriskål (35 x 10 mm) indeholdende OR2 opløsning.
- Fjern en oocyt fra æggestokken ved hjælp af to par # 5 smykkeforretninger pincet til at rive den tynde stilk af væv, der forbinder oocyt til æggestokkene væg. Placer oocyt i en anden lille petriskål indeholdende GV isolation medium.
BEMÆRK: Staten af LBC'er afhænger af størrelsen (løbetid) af oocyt. LBC'er nå maksimal længde med prominente sløjfer i oocytter, der er lidt mindre end fuld størrelse. De mest modne oocytter indeholder ofte korte kromosomer med indgåede sløjfer. - Udfør følgende trin under lav forstørrelse af et dissektionsmikroskop (felt diameter på cirka 10 - 20 mm).
- Tag fat i ægget med begge par pincet nær dyret pol (mørk halvkugle) og lave en smalle tåre. Kig i det ekstruderede blommen for en gennemsigtig oocyt kerne, også kaldet germinale vesikel eller GV.
- Alternativt stikke et stort hul nær dyret stang med en tang og forsigtigt presse den GV sammen med æggeblomme (figur 2).
- Forsigtigt rulle GV væk fra hovedparten af blommen. Normalt vil der være en lille mængde af æggeblomme tæt klæbende til GV.
5. Fjernelse af Nuclear Envelope
- For X. laevis og X. tropicalis, overføre GV fra isolation medium til spredning medium inden for 60 s isolation, selv om der er stadig lidt klæbende æggeblomme.
BEMÆRK: GV'er af disse to arter "hærde" inden for ca. 60 s, hvis venstre i isolation medium og vil ikke spredes i de efterfølgende trin. Derfor hastighed er af største betydning, når den undersøger Xenopus GV indhold.- Tag fat kernekappen nær toppen af GV med et paraf smykkeforretninger pincet, pas på ikke at trykke ned. Tag fat i konvolutten med et andet par pincet så tæt på den første som muligt. Træk de to par tænger væk fra hinanden, og GV indhold vil "pop" ud fri af konvolutten, som klæber fast til den ene eller begge pincet.
- Saml de GV indholdet i et glas pipette eller en justerbar 20 uL mikropipette. Hvis der anvendes en justerbar pipette, indstille pipetten til 10 pi og afbrød slutningen af plast spids med et barberblad. Tegn i fem pi væske før optagning GV i de resterende 5 uL.
- Overfør den stadig gelerede nukleare indhold til centrum af en brønd slide tidligere fyldt med spredende opløsning. Spredning opløsning skal have en konveks overflade, således at en boble ikke er fanget, når der tilsættes dækglasset.
- Tilføj et dækglas (18 mm) og placer dias i et fugtigt kammer. Den nukleare gel vil langsomt sprede over de næste 10 - 60 min, således at kromosomets og nukleart organeller kommer til at ligge på overfladen af objektglasset.
BEMÆRK: GVS af salamandre A. mexicanum og N. viridescens ikke "hærde" urimeligt i isolation medium. Derfor kan man fortsætte mere afslappet med fjernelse af den nukleare kuvert end en dåse med Xenopus.
- Fjern det nukleare kuvert fra en salamander GV som beskrevet i afsnit 5.1.1, men gøre det i isolation medium.
- Saml de lidt geldannede GV indhold med en pipette og overføres til en petriskål indeholdende sprede løsning.
- Hurtigt skylle pipettespidsen i spredning løsning, afhente den nukleare gel, og placere den i midten af en brønd dias tidligere fyldt med sprede løsning. Tilføj en 18 mm dækglas og placere hele dias i et fugtigt kammer. Det nukleare saft vil langsomt sprede løbet af de næste 10-60 min, og kromosomerne og nukleare organeller vil komme til at ligge på glasoverfladen. </ Ol>
6. Indledende Observation af LBC'er og organeller
- Se de LBC'er og nukleare organeller ved fasekontrast (konventionel opretstående mikroskop) ved lav forstørrelse efter spredning af det nukleare indhold i spredning kammer. Fordi kammeret er cirka 1 mm dyb og de nukleare indhold er i bunden, skal du bruge en lav forstørrelse mål med en lang arbejdsafstand (5X - 10x).
BEMÆRK: Den største grund til at undersøge præparatet på dette tidspunkt er at afgøre, om det er værd at gennemføre de næste skridt. I en god forberedelse kromosomerne er ubrudt og har slået sig ned til bunden af kammeret. Fortsæt til centrifugeringen trin inden for en time for at gøre præparatet, da dette vil sikre optimal fastgørelse af børstekromosom kromosom sløjfer til dias.
7. Centrifugering af nukleare Indhold
- Læg et stykke filterpapir på dækglasset og tryk nedat fjerne overskydende væske fra kammeret.
- Sætte ca. 1 mm 3 vaseline på hver side af dækglasset. Smelt vaseline med en metalstang opvarmet til ca. 70 - 80 ° C for at forsegle dækglasset på den underliggende plast firkant.
- Anbring objektglassene i slide bærere for centrifugering, og sørg for, at modsatte luftfartsselskaber er i balance. Centrifugeres objektglassene ved ca. 4.800 x g i 30 min - 1 time. ved 4 ° C. Brug den langsomme start funktionen på centrifugen.
8. Fastsættelse af nukleart Indhold
- For de fleste efterfølgende procedurer, fastsætte de nukleare indhold med paraformaldehyd.
- Sæt et dias rack i en standard objektglas farvning fad og derefter placere dias individuelt i racket. Tilsæt så fiksativ til at dække de slides (2 - 4% paraformaldehyd i OR2 eller PBS).
- Med et par stumpe pincet, skubbe dækglas sideværts, samle den op, og kassér det i den rigtige glas papirkurven.Efterlad objektglassene i fiksativ i mindst 15 - 30 min. For in situ hybridisering og mest antistof pletter, længere fiksering (h eller d) er tilladt.
- For at fjerne plastik firkant, sted glider en ad gangen i iskold OR2 eller PBS i en farvning fad. Sæt en skarp barberblad på kanten af plast firkant og lirke den løs.
BEMÆRK: Ideelt plasten kommer ud rent, forlader alle de paraffin på diaset. Voksen tjener et nyttigt formål: da den omgiver den lille centrale område, hvor de nukleare indhold er knyttet til det dias, det virker som en dæmning, der tillader en at arbejde med små volumener (5 - 10 ul) af reagenser til immunfarvning, osv. Slides kan holdes på ubestemt tid i koldt OR2 eller PBS.
9. immunfarvning af LBC'er og nukleare organeller
- Fjern en fast GV præparat fra lagring i OR2 eller PBS. Tør overskydende væske og sted på støtter i et fugtigt kammer. En bekvem ChaER er en 90 x 15 mm petriskål indeholdende et 90 mm cirkel med fugtigt filtrerpapir.
BEMÆRK: På dette tidspunkt de nukleare indhold solidt fastgjort til dias i en 5 mm cirkulært område fri for paraffin. Fordi voksen er vandafvisende, kan man ændre løsninger ved at tilføje og fjerne små volumener af væske til kanten af det centrale område med en 20 pi pipette. Den største forholdsregel er at undgå at røre ved voks-frit område med pipettespidsen. - Udfør immunfarvning med små volumener (10 - 20 gi) af reagenser. Fordi kromosomer og nukleare organeller er meget små og i umiddelbar kontakt med tilsatte reagenser, kan farvningsprotokoller være kort. Primære og sekundære antistoffarvning tider kan være så kort som 1 time eller mindre. Må ikke indeholde vaskemiddel i ethvert skridt, da dette forårsager skade på præparatet. Hvis det ønskes, plette præparatet med DAPI (1 ug / ml) i 10 - 20 min at fremhæve akser LBC'er.
- Mount i glycerol eller en kommerciel mounting medium egnet til immunfluorescens. For at undgå at fange en luftboble under monteringen trin, gøres følgende.
- Træk 15 pi af monteringsmedium ind i spidsen af en 20 pi pipette. Fjern så meget væske som muligt fra området umiddelbart omkring den nukleare spredning af "væge" det af med et stykke filtrerpapir (skåret i form af en meget tynd trekant fra en 90 mm cirkel med # 1 filterpapir).
- Pipette meste af montering medium på forberedelse, være omhyggelig med ikke at berøre det område af nukleare spredning. Placer de sidste 1 pi eller så af monteringsmedium i centrum af en 22 mm dækglas (tykkelse # 1.5). Vend dækglasset over forberedelse og slip forsigtigt på plads.
- For midlertidige mounts, op til et par dage, bruge 1 mg / ml phenylendiamin i 50% glycerol. Til permanente mounts, især for superresolution studier, bruge en lav-fluorescens medium, der hærder til et brydningsindeks på ca. 1,46.
10. Fluorescent in situ-hybridisering (FISH) af LBC'er og nuklear organeller
- Fordi FISH protokoller kræver normalt et skridt ved forhøjet temperatur, fjerne paraffin fra præparatet. Omhyggeligt skrabe med et barberblad, selv om proceduren er trættende og kan føre til utilsigtet beskadigelse af præparatet. Det er nyttigt at markere det område af præparatet på bagsiden af objektglasset med en diamant punkt.
- Alternativt opløse paraffin med xylen. Opsæt en række Coplin-skåle eller farvning retter, der indeholder: 30%, 50%, 70%, 95% og 100% ethanol; 3 beholdere xylen; 2 flere beholdere af 100% ethanol og én acetone.
- Placer dias i slide luftfartsselskab og dehydrere dem i ethanol-serien, der forlader slides 3 - 5 min i hver koncentration (kortere gange, hvis ophidset).
- Opløs paraffin ved at passere objektglassene gennem 3 beholdere xylen, omkring 5 min hver, hvis agiteres. Fjernxylen ved passage gennem to 100% ethanoler, og endelig fjernes ethanolen med acetone. Tag dias fra acetone og vip dem tørre.
- Udføre in situ hybridisering under anvendelse af en standard protokol. 15,16
11. Isolering af en GV under Oil
- Pick up en oocyt fra OR2 løsning med smykkeforretninger pincet, herunder så lidt omgivende væv som muligt. Placer oocyt på et lille stykke af # 1 filterpapir. Overskydende OR2 løsning vil overføre til filtrerpapiret, forlader oocyt næsten fri for væske. Løft "tørre" oocyt og placere den under overfladen af letvægts mineralolie (paraffinolie) i en lille petriskål (35 x 10 mm).
- Med en fin wolfram nål eller en tand af tangen, stikke et lille hul i oocytten nær den mørke dyr pol. Saml ægget med et par pincet (undgå de tips) og klem forsigtigt. GV vil ekstrudere sammen med en mindre eller larger mængde æggeblomme på sin overflade (figur 3).
- Fjern så meget som muligt blommen ved forsigtigt fejer GV med den side af tangen. I de fleste tilfælde vil det være vanskeligt at fjerne alle af blommen. Men for de fleste formål en lille mængde af æggeblomme er ikke et problem.
- At observere GV indhold, flade GV i større eller mindre grad.
- Fjern plastik firkant fra en brønd dias og bruge den resterende paraffin som en overfladisk beholder til paraffinolie. 10 Løft GV sammen med paraffinolie i en 20 uL pipette og overføres til midten af paraffin-området. Tilføj et dækglas og observere indholdet af den delvist fladtrykt GV. Denne teknik er ikke beskadiger LBC'er.
- Alternativt, flade GV til ca. 10 um tykkelse for observation af nukleare organeller.
- Skær endelig 1 mm af en plast pipettespids med en skarp barberblad. Suge GV ind itip sammen med præcis 5 uL af mineralsk olie. Ekstrudere GV og al olien på midten af en 22 mm dækglas.
- Sænke en standard 3 "x 1" objektglas langsomt, indtil den lige berører olie dråbe. Drop og dækglas vil blive løftet af kapillære kræfter og olien vil spredes til kanterne af dækglasset. Når dråben har spredt fuldstændigt, vil olien være ca. 10 um tyk. De LBC'er vil blive beskadiget og store nucleoli komprimeres lidt, men de fleste af de mindre nukleare organeller vil fremstå mere eller mindre som de findes i det intakte GV (figur 3).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
For at undersøge gigantiske børstekromosomer kromosomer man begynder ved at isolere oocytter fra en frø eller salamander. Figur 1 viser en gruppe af modne oocytter i en saltopløsning efter fjernelse fra ovariet af frøen, Xenopus. Sådanne oocytter forbliver i god stand for dage ved stuetemperatur. Kernen (eller germinal vesikel) fjernes derefter fra en oocyt med smykkeforretninger pincet, enten i en saltvandsopløsning (figur 2) eller i olie (figur 3). De nukleare indholdet af en olie-isolerede kerne kan undersøges ved forsigtigt kvaser kernen og observere ved fasekontrast eller differentiel interferens kontrast (DIC) mikroskopi. For at undersøge indholdet af en kerne, som er isoleret i en saltvandsopløsning, må man først fjerne den nukleare konvolut med smykkeforretninger pincet og tillader, at indholdet til rette på et objektglas. Fremstillingen centrifugeres derefter at fastgøre than kromosomer fast til objektglasset, hvorefter kromosomerne kan farves med et antistof (figur 4) eller udsat for in situ-hybridisering. De børstekromosomer kromosomer salamandre er meget større end frøer (figur 5). I begge tilfælde individuelle transkriptionsenheder (gener) kan ses som sløjfer af kromatin rager lateralt fra kromosomet akse.
Figur 1: Modne oocytter fra Frog X. tropicalis. Ovariet af en moden kvindelig frog indeholder tusindvis af oocytter i forskellige stadier af modning. Den mindste er på størrelse med somatiske celler og har allerede nået profase af den første meiotiske deling. Som oocytten vokser, efterhånden akkumuleres blommen, som giver cellen en uigennemsigtig hvid udseende. Den største måttenUre oocytter, der er vist her, erhverve en mørkere hætte grund af ophobning af melanin pigment. De største oocytter fra X. tropicalis er omkring 0,8 mm i diameter, de af X. laevis ca. 1,4 mm, mens de af Axolotl er en enorm 2,2 mm. Bortset fra størrelse, alle tre er ens i helhedsindtrykket. Scale bar = 1 mm.
Figur 2: Fjernelse af GV fra en oocyt af X. tropicalis. Venstre. Et lille hul blev lavet med smykkeforretninger pincet i den mørkere dyr pol en oocyt og GV blev forsigtigt ekstruderes. I dette eksempel var GV næsten fri for æggeblomme, da det kom ud af ægget. Klæbende blommen kan fjernes ved at suge GV ind og ud af en pipette med en spids diameter lige lidt større end diameteren af selve GV. Højre. Three GV'er af X. tropicalis. Disse GV'er blev efterladt et par minutter i en lidt surt medium (GV isolation opløsning indstillet til pH 5,8), som forårsager kernekappen at kvælde væk fra de gelerede nukleare indhold. GV'er behandlet på denne måde, vil ikke sprede sig til cytologisk undersøgelse. Men sådanne GV'er er ideelle til molekylær analyse: konvolutten kan fjernes med juvelerer pincet, tilvejebringelse af en prøve af nukleare indhold helt fri for cytoplasmatisk kontaminering. 17,18 Scale bar = 0,5 mm. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: GV af X. tropicalis Isoleret i olie. Venstre. Efter en lille punktering blev lavet i oocyt nær den mørke dyr pole, GV begyndte at ekstrudere. I dette tilfælde kom GV ud med næsten ingen vedhængende æggeblomme. Mellemøsten. GV er nu helt fri for den oocyt cytoplasmaet. Sådanne GV'er fortsat transkribere RNA i timevis. Højre. Efter GV forsigtigt knust i olie under et dækglas, kan nukleare organeller ses ved DIC, som vist her, eller ved fasekontrast. Hele GV er meget større end mellem, er vist her. HLB = histon locus organ med tre prikker på overfladen. Scale bar = 0,5 mm for første to paneler, 10 um for den tredje. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4: børstekromosomer Kromosomer (LBC'er) fra Axolotl A. mexicanum. Venstre. Højre. Det samme præparat ses af mørkefelt belysning. Man kan nu se de mange ufarvede forstærkede nucleoli. Scale bar = 250 um. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 5: A Single LBC fra Axolotl A. mexicanum og Frog X. tropicalis, med samme forstørrelse. Disse billeder illustrerer den ekstreme størrelse forskel mellem LBC'er af en salamander og en frø (indsat). Størrelsen difference korrelerer med det totale DNA-indhold af genomerne (ca. 30 GBP for A. mexicanum vs 1,7 GBP for X. tropicalis). Individuelle laterale sløjfer (transskription enheder) er også meget længere i salamander end i frøen. Scale bar = 100 um. Klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De første observationer af "levende" LBC'er fra hånd-isolerede GV'er af frøer og salamandre blev foretaget næsten 80 år siden af den amerikanske biolog William Duryee, 19 før indførelsen af fase kontrast og DIC-mikroskopi, før fluorescerende immunfarvning, og før FISH. Fordelene ved LBC'er til undersøgelse detaljer i kromosom struktur og transskription på det individuelle gen niveau, der kræves udvikling af teknikker til at fastgøre LBC'er til objektglas, til at løse dem på en naturtro måde, og at anvende molekylære teknikker uden at ødelægge deres grundlæggende morfologi. Næsten hver teknik til at nå disse mål kræver nogle tilpasning til de arter, der undersøges og nogle kompromis mellem naturtro bevaring og molekylær karakterisering. For eksempel GV'er og LBC'er af tailed padder er usædvanligt let at arbejde med på grund af deres enorme størrelse og den lethed, hvormed de GV indholdet dispergere i det passende medium. Until nylig, dog meget lidt man vidste om deres genomforskning, hvilket gør det vanskeligt at korrelere det væld af cytologiske funktioner med molekylære detaljer. Omvendt LBC'er af Xenopus er ganske små sammenlignet med dem af tailed padder (figur 5), men genomerne af både X. tropicalis og X. laevis er blevet sekventeret og er rimeligt godt kommenteret.
For de første anvender padder GV'er, vil den største udfordring være at isolere GV og fjern nukleare kuvert uden at beskadige LBC'er. Til dato har ingen opdaget en måde at fjerne kuverten undtagen ved hånden med smykkeforretninger pincet. Det ville være en stor teknisk forhånd, hvis en måde viste sig at "opløse" eller "fordøje" konvolutten men lad kromosomerne og andre nukleare organeller ubeskadiget. En sådan teknik ville være lige så anvendelige til molekylære undersøgelser. I vores undersøgelser om nuklear og cytoplasmatisk RNA fandt vi det vigtigt atfjerne kernemembranen før analyse af nukleare RNA (figur 2). 17,18 Hvis konvolutten ikke er fjernet, er den lille mængde af nuklear RNA overvældet af kontaminerende cytoplasmatisk RNA, der klæber til ydersiden af kuverten.
En anden væsentlig forbedring ville være opdagelsen af en eller anden måde at fastgøre LBC'er mere stramt til et mikroskopobjektglas. Centrifugering af præparatet er kritisk, men selv forlænget centrifugering (1 time ved 4.500 xg), tillader ikke vedhæftet fil. Man kan som regel fortælle, når LBC er godt fastgjort ved at undersøge dem med fasekontrast under medium forstørrelse. Well-vedhæftede kromosomer viser ingen Brownske bevægelse overhovedet. Hvis nogen Brownske bevægelse af løkkerne kan påvises, vil efterfølgende Immunofarvning eller FISH-protokoller medføre omfattende skader eller tab af materiale.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Paraformaldehyde (reagent grade, crystalline) | Sigma-Aldrich | P6148-500G | Despite warnings in many protocols, a concentrated solution can be stored indefinitely at RT |
| Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate | Sigma-Aldrich | A5040-100G | Sometimes referred to as MS-222 |
| Ethicon RB-1 1/2 circle taper point 3-0 sutures | VWR | 95057-000 | |
| Paraplast (paraffin wax) | Sigma-Aldrich | P3558-1KG | |
| p-Phenylenediamine | Sigma-Aldrich | P6001 | |
| Gelatin | Grocery Store | Commercial Knox gelatin works fine | |
| ProLong Gold antifade mountant | ThermoFisher Scientific | P10144 | |
| Gold Seal cover glass 22 x 22 mm #1 1/2 (0.16 - 0.19 mm thick) | Electron Microscopy Sciences | 63786-01 | These coverslips are the recommended thickness for superresolution microscopy |
| Dumont forceps #5 | Electron Microscopy Sciences | 72700-D | http://www.emsdiasum.com/microscopy/products/tweezers/dumont_positive_action.aspx |
| Paraffin oil (light) | EMD Chemicals | PX0047-1 | For isolating GVs in oil |
| Adhesive in situ PCR and hybridization chambers (25 µL) | BioRad | Frame-Seal Slide Chambers #SLF0201 | http://www.bio-rad.com/en-us/sku/slf0201-frame-seal-slide-chambers |
| Silicone isolators | Grace-Biolabs | select from catalog link | http://www.gracebio.com/life-science-products/microfluidics/silicone-isolators.html |
| Coplin jars and staining dishes | Electron Microscopy Sciences | select from catalog link | http://www.emsdiasum.com/microscopy/products/histology/staining.aspx |
References
- Purkinje, J. E. Symbolae ad ovi avium historiam ante incubationem. , Leopold Vossi. (1830).
- Rückert, J. E. Zur Entwickelungsgeschichte des Ovarialeies bei Selachiern. Anat. Anz. 7, 107-158 (1892).
- Callan, H. G. Lampbrush Chromosomes. 36, Springer-Verlag. (1986).
- Gall, J. G., Callan, H. G., Wu, Z., Murphy, C. Lampbrush chromosomes. Xenopus laevis: Practical Uses in Cell and Molecular Biology. Kay, B. K., Peng, H. B. Vol. 36 Methods in Cell Biology , Academic Press. 149-166 (1991).
- Gall, J. G., Wu, Z. Examining the contents of isolated Xenopus germinal vesicles. Methods. 51, 45-51 (2010).
- Penrad-Mobayed, M., Kanhoush, R., Perrin, C. Tips and tricks for preparing lampbrush chromosome spreads from Xenopus tropicalis oocytes. Methods. 51, 37-44 (2010).
- Morgan, G. T. Working with oocyte nuclei: cytological preparations of active chromatin and nuclear bodies from amphibian germinal vesicles. Methods Mol. Biol. 463, 55-66 (2008).
- Paine, P. L., Johnson, M. E., Lau, Y. T., Tluczek, L. J., Miller, D. S. The oocyte nucleus isolated in oil retains in vivo structure and functions. Biotechniques. 13, 238-246 (1992).
- Handwerger, K. E., Cordero, J. A., Gall, J. G. Cajal bodies, nucleoli, and speckles in the Xenopus oocyte nucleus have a low-density, sponge-like structure. Mol Biol Cell. 16, 202-211 (2005).
- Patel, S., Novikova, N., Beenders, B., Austin, C., Bellini, M. Live images of RNA polymerase II transcription units. Chromosome Res. 16, 223-232 (2008).
- Gall, J. G.
- Löschberger, A., et al. Super-resolution imaging visualizes the eightfold symmetry of gp210 proteins around the nuclear pore complex and resolves the central channel with nanometer resolution. J Cell Sci. 125, 570-575 (2012).
- Gottfert, F., et al. Coaligned dual-channel STED nanoscopy and molecular diffusion analysis at 20 nm resolution. Biophys J. 105, L01-L03 (2013).
- Wallace, R. A., Jared, D. W., Dumont, J. N., Sega, M. W. Protein incorporation by isolated amphibian oocytes: III. Optimum incubation conditions. J. Exp. Zool. 184, 321-333 (1973).
- Bridger, J. Fluorescence in situhybridization to DNA. Cells: A Laboratory Manual. Spector, D. L., Goldman, R. D., Leinwand, L. A. 3, Cold Spring Harbor Press. 111.111-111.136 (1998).
- Singer, R. H. In situ hybridization to RNA. Cells: A Laboratory Manual. Spector, D. L., Goldman, R. D., Leinwand, L. A. 3, Cold Spring Harbor Press. 111-116 (1998).
- Gardner, E. J., Nizami, Z. F., Talbot, C. C. Jr, Gall, J. G. Stable intronic sequence RNA (sisRNA), a new class of noncoding RNA from the oocyte nucleus of Xenopus tropicalis. Genes Dev. 26, 2550-2559 (2012).
- Talhouarne, G. J., Gall, J. G. Lariat intronic RNAs in the cytoplasm of Xenopus tropicalis oocytes. RNA. 20, 1476-1487 (2014).
- Duryee, W. R. Isolation of nuclei and non-mitotic chromosome pairs from frog eggs. Arch. Exp. Zellforsch. 19, 171-176 (1937).
