Summary
Vi presentiamo semplici tecniche per isolare giganti cromosoma a spazzola trascrizionalmente attivi da ovociti di rane e salamandre vivono. Descriviamo come osservare questi cromosomi "vivo" di contrasto di fase o differenziale contrasto interferenziale, e come risolverli per fluorescente ibridazione in situ o di immunofluorescenza colorazione.
Abstract
Descriviamo i metodi per lo studio dei giganti cromosoma a spazzola trascrizionalmente attivi (LBCs) in ovocita o uovo posata, di rane e salamandre. LBCs individuali possono essere fino a 1 mm di lunghezza e risiedere in un nucleo gigantesca, per sé fino a 0,5 mm di diametro. Le grandi dimensioni dei cromosomi permette osservazioni ineguagliabile geni attivi di microscopia ottica luce, ma allo stesso tempo tecniche speciali sono necessari per isolare il nucleo, la rimozione della membrana nucleare, e diffondere i cromosomi su un vetrino da microscopio. Il nucleo di ovociti, detto anche germinale vescicole (GV), è isolato in un mezzo che permette di gelificazione parziale della actina nucleare e preserva la delicata struttura dei LBCs. Questa fase viene effettuata manualmente sotto un microscopio da dissezione con pinze del gioielliere. Successivamente, l'involucro nucleare viene rimosso, sempre manualmente con le pinze del gioielliere. I contenuti nucleari sono rapidamente trasferiti in un mezzo che VerniceRSES il gel actina e permette ai LBCs intatti di stabilirsi su un vetrino da microscopio. A questo punto i LBCs e altri organelli nucleari possono essere visualizzati da contrasto di fase o microscopio a contrasto di interferenza differenziale, anche se i dettagli più fini sono oscurati da moto browniano. Per l'alta risoluzione di osservazione microscopica o analisi molecolare, tutta la preparazione viene centrifugato per fissare saldamente le LBCs delicati alla diapositiva. Una breve fissazione in paraformaldeide è poi seguita da immunofluorescenza colorazione o ibridazione in situ. LBCs sono in uno stato trascrizionalmente attivo e le loro enormi dimensioni permette l'analisi molecolare a livello di singolo gene utilizzando confocale o la microscopia super-risoluzione.
Introduction
La maggior parte dei vertebrati, con la notevole eccezione di marsupiali e mammiferi placentati, producono grandi uova Yolky. Nonostante la loro talvolta enormi dimensioni, queste uova sono cellule singole che raggiungono la loro dimensione finale, pur nelle ovaie della femmina. Uova ovariche sono chiamati ovociti e ogni genere contiene un singolo nucleo gigante, conosciuta sin dagli inizi del 19 ° secolo come il vescicola germinale o semplicemente GV. 1 ovociti delle rane di laboratorio comuni, Xenopus laevis e Xenopus tropicalis, raggiungono un diametro massimo di 1,2 mm e 0,8 millimetri, rispettivamente (Figura 1). I GVs da ovociti maturi di questi due rane sono 0,3 - 0,4 mm di diametro (figure 2, 3). Salamandre in genere hanno ovociti ancora più grandi e GVs. Ovociti completamente maturi del axolotl messicano, Ambystoma mexicanum, sono più di 2 mm di diametro e GV è di circa 0,5 mm. Così, questi nuclei sono facilmente visibili ad occhio nudo e lattinaessere manipolata in molti modi che sono impossibili con i nuclei di cellule somatiche tipiche.
Altrettanto notevole è il gigantismo dei cromosomi all'interno del GV, un fatto riconosciuto già alla fine del 19 ° secolo. Cromosomi individuali di Ambystoma e altre salamandre possono essere fino a 1 mm di lunghezza (Figure 4, 5). Quelli di Xenopus sono notevoli più piccolo, anche se con lunghezze fino a 100 pm o più, nano cromosomi tipici somatici di maggior parte degli organismi. Una caratteristica importante dei cromosomi degli ovociti è la loro straordinaria attività trascrizionale, che porta ad una delle loro più caratteristici morfologiche - centinaia di loop laterali accoppiati (Figura 5). Ogni ciclo è composto da una o poche unità di trascrizione che sintetizzano attivamente RNA. Le anse conferiscono ovocita cromosomi uno fuzzy aspetto, che ha portato il nome di cromosoma "lampbrush" dopo la loro superficialesomiglianza con le spazzole utilizzate in passato per pulire camini lampada a cherosene. 2
L'obiettivo di questo lavoro è l'uso di GVs isolati per studiare LBCs e organelli nucleari (nucleoli, corpi istone locus, e macchie). Due tecniche piuttosto diverse saranno descritte. Nel primo, la tecnica più comune, GVs sono isolati in una soluzione salina con pinze del gioielliere, brevemente risciacquato per rimuovere tuorlo aderenti, e l'involucro nucleare viene rimosso, ancora una volta con una pinza del gioielliere. I contenuti gelatinosi, contenenti i LBCs e organelli nucleari, sono autorizzati a stabilirsi su un vetrino da microscopio in vetro o coprioggetto. Tali preparati possono essere esaminati direttamente dal contrasto di fase o microscopia DIC. In alternativa, preparati possono essere centrifugati per fissare le LBCs e organelli alla diapositiva o coprioggetto. Tali preparati possono essere trattati per l'analisi molecolare dettagliata degli acidi nucleici e proteine, in primo luogo mediante immunofluorescenza e fluorescent ibridazione in situ (FISH). 3-7
Una seconda tecnica prevede l'isolamento del GV in olio minerale. 8 GVs olio isolato rimangono trascrizionalmente attivo per molte ore e sono potenzialmente utili per gli studi dove si vuole i contenuti nucleari di essere il più realistico possibile. 9,10 Poiché l'indice di rifrazione del "SAP" nucleare è vicino a quello dei LBCs e altri organelli nucleari (Figura 3), tecniche microscopiche può essere una sfida con GVs olio isolato.
Infine, a causa delle loro dimensioni e facilità di manipolazione, GVs sono materiale ideale per studi sulla membrana nucleare. Il complesso del poro nucleare è stata descritta da elettroni studi microscopici sulle buste GV anfibi 11 e osservazioni SuperResolution più recenti hanno utilizzato lo stesso materiale. 12,13
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Informazioni generali su rane e salamandre, così come fonti di animali, si possono trovare presso i seguenti siti: Xenbase (http://www.xenbase.org) e Sal-Site (http://www.ambystoma.org). Questo protocollo segue le linee guida per la cura degli animali del Dipartimento di Embriologia della Carnegie Institution for Science.
1. Soluzioni
- Fare 10 L "acqua rana": aggiungere 10 ml di 1 M CaCl 2 e 10 ml di 1 M NaHCO 3 a 10 L deionizzata o H 2 O declorurata con agitazione.
- Fare 1 L 20% paraformaldeide: fare 1 L di 4 mM Na 2 CO 3. In una cappa chimica aggiungere 200 g di paraformaldeide in polvere, e il calore di circa 80 ° C per sciogliere. Fresco, e filtro attraverso carta da filtro. Attenzione: paraformaldeide è tossico e deve essere maneggiato con cura. In alternativa, l'acquisto di una soluzione paraformaldeide commerciale.
- Fare 1 L soluzione anfibio anestetico: Aggiungere 1,5 g di etil 3-aminobenmethanesulfonate Zoate all'acqua rana 1 L. Conservare a temperatura ambiente.
- Fare 1 L cultura ovocita medio OR2 14: 82.5 mM NaCl, 2,5 mM KCl, 1 mM CaCl 2, 1 mM MgCl 2, 1 mM Na 2 HPO 4, 5 mM HEPES (da 500 mm magazzino, pH 8,3). Il pH finale sarà di circa pH 7,8. Aggiungere 100 mg di ampicillina e 100 mg di streptomicina per prevenire la crescita batterica.
- Fare 1 L soluzione di isolamento GV: 83 mm KCl, 17 mM NaCl, 6,5 mm Na 2 HPO 4, 3,5 mm KH 2 PO 4, 1 mM MgCl 2, 1 mM ditiotreitolo (DTT). Regolare a pH 7,0.
- Fare 100 mL di soluzione GV dispersione: 20.7 mM KCl, NaCl 4,3 mm, 1,6 mm Na 2 HPO 4, 0,9 mm KH 2 PO 4, 1 mM MgCl 2, 1 mM ditiotreitolo (DTT), 0,1% paraformaldeide. Regolare a pH 7,0. Per consentire una più rapida dispersione del gel nucleari, aggiungere 10-50 mM CaCl 2.
- Fare 500 soluzione sottostrato mL. Swell 0,5 g di gelatina commerciale a 20 mL H 2 O per 5 - 10 minuti. Aggiungere 500 mL di ebollizione H 2 O e accuratamente agitare per sciogliere la gelatina. Raffreddare e aggiungere 50 mg Crk (SO 4) 2 · 12 H 2 O. filtrare sotto vuoto e conservare a 4 ° C.
- Fare 10 mL mezzo di montaggio. Sciogliere 10 mg fenilendiammina in 5 ml di PBS (135 mM NaCl, 2,5 mM KCl, 4,3 mm Na 2 HPO 4, 1,5 mm KH 2 PO 4, portata a pH 9). Aggiungere 5 ml di glicerolo. Conservare in 250 microlitri aliquote a -80 ° C.
2. Materiali
- Per diapositive subbed, posto 3 pollici microscopio in vetro x 1 pollice scivola in una soluzione detergente commerciale e strofinare loro di rimuovere tutti gli agenti inquinanti. Mettere in un rack scorrevole e risciacquare bene in acqua di rubinetto, poi in acqua deionizzata. Immergere i vetrini nella soluzione sottostrato, scolare in un angolo, e cuocere per una notte a 60 ° C.
- Per piazze plastica, tagliare 25 mm quadrati da un foglio di 1 mm di spessore poli (metil metacrilato). Praticare unforo 5 mm intorno al centro di ogni quadrato. Sabbia entrambe le facce e gli spigoli del quadrato e la circonferenza del foro.
NOTA: In alternativa casalingo piazze plastica e scivoli e, come descritto nel paragrafo successivo, utilizzare un adesivo commerciale PCR in situ e camere di ibridazione (25 mL). Si potrebbe probabilmente anche usare riutilizzabili isolatori silicone per coltura cellulare, anche se questo non è stato accuratamente testato ancora. - Per pozzetti, fondere 20 - 30 g di paraffina (56 - 57 ° C) in un beaker da 50 ml di vetro su una piastra calda. Con una pipetta 20 microlitri, sviluppa una goccia 5 ml di paraffina su ciascun lato del centro di una diapositiva subbed. Premere un quadrato di plastica nella paraffina e posizionare il vetrino sul piatto caldo. La paraffina si scioglierà e dovrebbe diffondere in modo uniforme sotto la piazza di plastica.
- Rimuovere il vetrino dalla piastra calda e lasciate raffreddare. Posizionare un supporto sotto ogni estremità della slitta, in modo che la slitta non tocchi il tablETOP durante il processo di raffreddamento. Se la paraffina si raffredda troppo rapidamente, può allontanarsi dal foro centrale. Preparare 10 o più diapositive e: ogni preparazione GV utilizza una nuova diapositiva bene.
- Per i vettori scorrevoli per la centrifugazione, utilizzare appositamente costruito vettori per il rotore utilizzato. Diversi produttori forniscono centrifughe con i vettori per 96 - e piatti di plastica. Questi vettori possono essere adattati facilmente a tenere vetrini da microscopio.
3. Isolamento di ovociti
- Inserire un rana femmina adulta (Xenopus laevis o Xenopus tropicalis) o salamandra (Ambystoma mexicanum) in soluzione di anestetico sufficiente a coprire completamente l'animale. Quando l'animale cessa il movimento, metterlo a pancia in su su un letto di ghiaccio scheggiato in un contenitore adatto.
- Con le forbici chirurgiche fanno un 2 - cm un'incisione 3 nel basso addome laterale alla linea mediana. Spostare gli organi interni delicatamente parte per trovare l'ovaio sul lato dell'incisione (there sono due ovaie, uno su ciascun lato dell'addome). Ritagliare una parte delle ovaie con abbastanza ovociti per gli esperimenti programmati. Dato che ci sono migliaia di ovociti in ciascuna ovaia, un relativamente piccolo pezzo di ovaio (1-3 cm) è generalmente sufficiente.
- Mettere uno o alcuni pezzi di ovaio a OR2 soluzione salina in una grande capsula di Petri (100 mm) a temperatura ambiente. Gli oociti possono essere memorizzati in buone condizioni per diversi giorni, se ovociti danneggiati vengono rimossi e la soluzione OR2 è cambiata quotidianamente.
- Suturare l'incisione chirurgica con la seta e rispedire l'animale a una ciotola di vetro individuale per il recupero. Aggiungere appena sufficiente "acqua rana" per coprire l'animale fino a quando non riprende conoscenza (circa 15 min). Dopo l'animale mostra movimenti volontari, riempire la ciotola con acqua. Anche se deve essere utilizzato acqua dolce, la sterilità non è necessario, come anfibi quasi mai diventano infettati dopo la chirurgia. Se lo si desidera, neomicina può essere applicato alle suture. La ferita di solito guarisce completamente dopo una fegiorni W e lo stesso animale può essere utilizzato di nuovo dopo circa 2 mesi.
4. L'isolamento di una vescicola germinale (GV)
- Mettere una porzione di ovaia (10 - 20 grandi ovociti) in una piccola capsula di Petri (35 x 10 mm) contenente soluzione OR2.
- Rimuovere un ovocita dalle ovaie con due coppie di pinze # 5 del gioielliere per strappare il gambo sottile di tessuto che collega l'ovocita alla parete dell'ovaio. Posizionare l'ovocita in un'altra piccola capsula di Petri contenente terreno di isolamento GV.
NOTA: Lo stato del LBCs dipende dalle dimensioni (scadenza) dell'ovocita. LBCs raggiungere la lunghezza massima con i cicli di primo piano in ovociti che sono poco meno di full size. Gli ovociti maturi più spesso contengono cromosomi corte con loop contratte. - Effettuare le seguenti operazioni in basso ingrandimento di un microscopio da dissezione (diametro del campo di circa il 10 - 20 mm).
- Afferrare l'ovocita con entrambe le coppie di pinze in prossimità del polo animale (emisfero scuro) e fare una smtutto lacrima. Guardate nel tuorlo estruso per il nucleo dell'ovocita trasparente, detta anche la vescicola germinale o GV.
- In alternativa, colpire un grande buco in prossimità del polo animale con un paio di pinze e delicatamente spremere il GV insieme al tuorlo (Figura 2).
- Delicatamente rotolare GV lontano dalla massa del tuorlo. Generalmente ci sarà una piccola quantità di tuorlo strettamente aderente alla GV.
5. La rimozione della membrana nucleare
- Per X. laevis e X. tropicalis, trasferire il GV dal terreno di isolamento al mezzo di diffusione entro 60 s di isolamento, anche se c'è ancora un po tuorlo aderente.
NOTA: GVs di queste due specie "indurire" entro circa 60 s se lasciato nel terreno di isolamento e non si diffonderà in fasi successive. Pertanto, la velocità è di estrema importanza quando si esaminano i contenuti Xenopus GV.- Afferrare la membrana nucleare vicino alla parte superiore della GV con una coppiadi pinze gioielliere, facendo attenzione a non premere verso il basso. Afferrare la busta con una seconda coppia di pinze più vicino alla prima possibile. Tirare le due coppie di pinze distanti ei contenuti GV saranno "pop" fuori libera della busta, che aderisce saldamente ad una o entrambe le pinze.
- Raccogliete il contenuto GV in una pipetta di vetro o un regolabile 20 microlitri micropipetta. Se si utilizza una pipetta regolabile, impostare la pipetta 10 microlitri e tagliare l'estremità della punta di plastica con una lama di rasoio. Disegnare in 5 ml di liquido prima di prendere in mano il GV nei rimanenti 5 ml.
- Trasferire il contenuto nucleari ancora gelificate al centro di un pozzetto precedentemente riempito con diffusione soluzione. La soluzione diffusione deve avere una superficie convessa in modo che una bolla non è intrappolato quando viene aggiunto il coprioggetto.
- Aggiungere un coprioggetto (18 mm) e posizionare il vetrino in una camera umida. Il gel nucleare lentamente disperdere nei prossimi 10 - 60 min, in modo che il cromosomas e organelli nucleari vengono a trovarsi sulla superficie del vetrino.
NOTA: GVS del salamandre A. mexicanum e N. viridescens non "induriscono" indebitamente nel terreno di isolamento. Perciò si può procedere più piacevole con la rimozione della membrana nucleare di una lattina con Xenopus.
- Rimuovere la membrana nucleare da un GV salamandra come descritto nel paragrafo 5.1.1, ma farlo nel terreno di isolamento.
- Raccogliete il contenuto GV leggermente gelificata con una pipetta e trasferire in una capsula di Petri contenente soluzione di diffusione.
- lavare rapidamente il puntale nella soluzione di diffusione, raccogliere il gel nucleari, e metterlo al centro di un pozzetto precedentemente riempito di diffusione soluzione. Aggiungere un coprioggetto 18 mm e posizionare l'intero vetrino in una camera umida. La linfa nucleare lentamente disperdono nei prossimi 10 - 60 min e cromosomi e organelli nucleari arriverà a giacere sulla superficie del vetro. </ Ol>
6. L'osservazione preliminare di LBCs e Organelli
- Guarda le LBCs e organelli nucleari di contrasto di fase (convenzionale microscopio verticale) a basso ingrandimento dopo la dispersione dei contenuti nucleari nella camera di diffusione. Perché la camera è di circa 1 mm di profondità e il contenuto nucleari sono in fondo, utilizzare un obiettivo a basso ingrandimento con una distanza di lavoro (5X - 10X).
NOTA: La ragione principale per l'esame della preparazione in questo momento è quello di determinare se vale la pena portare attraverso i passi successivi. In una buona preparazione dei cromosomi sono ininterrotta e si sono stabiliti al fondo della camera. Procedere alla fase di centrifugazione entro un'ora di fare la preparazione, in modo da assicurare l'attaccamento ottimale dei cicli lampbrush cromosomiche alla diapositiva.
7. La centrifugazione dei Contenuti nucleari
- Posizionare un pezzo di carta da filtro sul vetrino e premere verso il bassoper rimuovere il liquido in eccesso dalla camera.
- Mettere circa 1 mm 3 di vaselina su ciascun lato del vetrino. Sciogliere la gelatina di petrolio con una bacchetta di metallo riscaldato a circa 70 - 80 ° C per sigillare il coprioggetto sulla piazza plastica sottostante.
- Collocare i vetrini nei ripiani scorrevoli per la centrifugazione, facendo in modo che i vettori di fronte sono bilanciati. Centrifugare le diapositive a circa 4.800 xg per 30 minuti - 1 ora. a 4 ° C. Utilizzare la funzione di avvio lento sulla centrifuga.
8. Fissaggio del contenuto nucleari
- Per la maggior parte delle procedure successive, fissare i contenuti nucleari con paraformaldeide.
- Mettere un rack scorrevole in un vetrino da microscopio piatto standard di colorazione e quindi posizionare le diapositive individualmente nel rack. Aggiungere abbastanza fissativo per coprire i vetrini (di 2 - 4% paraformaldeide in OR2 o PBS).
- Con un paio di pinze smussate, spingere il vetrino lateralmente, raccoglierlo e gettarlo nella spazzatura vetro appropriata.Lasciare le diapositive nel fissativo per almeno 15 - 30 min. Per ibridazione in situ e le macchie più anticorpi, lunghi periodi di fissaggio (H o d) sono ammesse.
- Per rimuovere il quadrato di plastica, posto scorre uno alla volta in ghiaccio freddo OR2 o PBS in un piatto di colorazione. Inserire una lama tagliente come un rasoio sul bordo della piazza plastica e fare leva sciolto.
NOTA: Idealmente la plastica verrà fuori in modo pulito, lasciando tutta la cera di paraffina sulla diapositiva. La cera uno scopo utile: dato che circonda la piccola zona centrale dove il contenuto nucleari sono attaccati alla diapositiva, agisce come una diga che permette di lavorare con piccoli volumi (5 - 10 microlitri) di reagenti per immunostaining, ecc. Le diapositive possono essere tenuta indefinitamente in OR2 freddo o PBS.
9. Immunocolorazione di LBCs e Organelli nucleari
- Rimuovere una preparazione GV fisso da stoccaggio in OR2 o PBS. Pulire il liquido in eccesso e posto su supporti in una camera umida. A Chamb comodaer è un piatto mm 90 x 15 petri contenente un cerchio 90 mm di carta da filtro umida.
NOTA: A questo punto il contenuto nucleari sono saldamente attaccato alla diapositiva in una zona circolare di 5 millimetri privo di paraffina. Poiché la cera è idrorepellente, si può cambiare soluzioni aggiungendo e rimuovendo piccoli volumi di liquido al limite dell'area centrale con una pipetta 20 microlitri. La precauzione principale è quello di evitare di toccare la zona di libero-cera con la punta della pipetta. - Effettuare immunostaining con piccoli volumi (10 - 20 mL) di reagenti. Poiché i cromosomi e organelli nucleari sono molto piccole e in immediato contatto con reagenti aggiunti, protocolli di colorazione può essere breve. volte colorazione degli anticorpi primari e secondari possono essere il più breve 1 ora o meno. Non includere detergenti in qualsiasi fase, poiché ciò provoca danni alla preparazione. Se lo si desidera, macchiare la preparazione con DAPI (1 mg / ml) per 10 - 20 min per accentuare assi dei LBCs.
- Montare in glicerolo o un supporto commercialeing mezzo adatto per immunofluorescenza. Per evitare di intrappolare una bolla d'aria durante la fase di montaggio, procedere come segue.
- Estrarre 15 ml di liquido di montaggio nella punta di una pipetta 20 microlitri. Rimuovere quanto più liquido possibile dalla zona immediatamente circostante la diffusione nucleare "wicking" via con un pezzo di carta da filtro (taglio a forma di un triangolo molto sottile da un cerchio di 90 mm 1 # carta filtro).
- Pipettare maggior parte del mezzo di montaggio sulla preparazione, facendo attenzione a non toccare la superficie della diffusione nucleare. Posizionare ultimi 1 ml circa di mezzo di montaggio al centro di un coprioggetto 22 millimetri (spessore # 1.5). Capovolgere il vetrino nel corso della preparazione e rilasciare con cautela in posizione.
- Per supporti temporanei, fino a qualche giorno, utilizzare 1 mg / mL fenilendiammina in 50% glicerolo. Per i montaggi permanenti, in particolare per studi SuperResolution, utilizzare un supporto a bassa fluorescenza che indurisce ad un indice di rifrazione di circa 1,46.
10. ibridazione in situ fluorescente (FISH) di LBCs e Organelli nucleare
- Poiché protocolli FISH solito richiedono un passo a temperatura elevata, rimuovere la paraffina dalla preparazione. raschiare delicatamente con una lama di rasoio, anche se la procedura è noioso e può portare a danni accidentali del preparato. È utile contrassegnare l'area della preparazione sul retro del vetrino con una punta di diamante.
- In alternativa, sciogliere la cera di paraffina con xilene. Impostare una serie di vaschette Coplin o piatti colorazione contenenti: 30%, 50%, 70%, 95% e 100% di etanolo; 3 contenitori di xilene; altre 2 contenitori di etanolo al 100% e uno acetone.
- Collocare i vetrini nel supporto scorrevole e li disidratano nella serie etanolo, lasciando diapositive 3-5 minuti in ciascuna concentrazione (tempi più brevi se agitato).
- Sciogliere la cera di paraffina passando le diapositive attraverso i 3 contenitori di xilene, circa 5 minuti ciascuno, se agitato. Rimuovi ilxilene passando attraverso due 100 ethanols%, ed infine rimuovere l'etanolo con acetone. Prendere le diapositive da acetone e l'inclinazione ad asciugare.
- Effettuare ibridazione in situ utilizzando qualsiasi protocollo standard. 15,16
11. L'isolamento di un GV sott'olio
- Pick up un ovocita dalla soluzione OR2 con le pinze del gioielliere, anche per quanto poco tessuto circostante possibile. Posizionare l'ovocita su un piccolo pezzo di # 1 carta da filtro. la soluzione in eccesso OR2 trasferirà alla carta da filtro, lasciando l'ovocita quasi privo di liquido. Raccogliete l'ovocita "a secco" e posizionarlo sotto la superficie di olio minerale leggero peso (olio di paraffina) in una piccola capsula di Petri (35 x 10 mm).
- Con un ago di tungsteno multa o una tine della pinza, colpire un piccolo foro nel ovocita vicino al polo animale scuro. Sollevare il ovocita con un paio di pinze (evitando le punte) e premere delicatamente. Il GV sarà estrudere con un più piccolo o lquantità arger di tuorlo sulla sua superficie (figura 3).
- Rimuovere il più tuorlo possibile da spazzare delicatamente la GV con il lato della pinza. Nella maggior parte dei casi sarà difficile rimuovere tutto il tuorlo. Tuttavia, per gli scopi più una piccola quantità di tuorlo non è un problema.
- Per osservare il contenuto GV, appiattire la GV in misura maggiore o minore.
- Rimuovere il quadrato di plastica da un pozzetto e utilizzare la cera di paraffina rimanente come ricettacolo poco profonda per l'olio di paraffina. 10 Sollevare il GV con olio di paraffina in una pipetta 20 microlitri e trasferimento al centro dell'area di paraffina. Aggiungere un coprioggetto ed osservare il contenuto del GV parzialmente appiattita. Questa tecnica non danneggia le LBCs.
- In alternativa, appiattire la GV a circa 10 micron di spessore per l'osservazione degli organelli nucleari.
- Tagliare le finali 1 mm di una punta di plastica pipetta con una lametta affilata. Succhiare il GV nelpunta insieme con esattamente 5 ml di olio minerale. Estrudere il GV e tutto l'olio sul centro di un vetrino di vetro di 22 mm.
- Abbassare una diapositiva 3 "x 1" vetro di serie lentamente fino a quando non raggiunge la goccia di olio. Il calo e coprioggetto saranno abolite per capillarità e l'olio si diffonderà ai bordi del vetrino. Quando il calo è diffuso completamente, l'olio sarà di circa 10 micron di spessore. Le LBCs saranno danneggiati e grandi nucleoli verranno compressi leggermente, ma la maggior parte degli organelli nucleari piccoli appariranno più o meno come esistono in GV intatto (figura 3).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Per esaminare giganti cromosoma a spazzola si comincia isolando ovociti da una rana o di salamandra. La figura 1 mostra un gruppo di oociti maturi in una soluzione salina tamponata dopo la rimozione dal ovaio della rana, Xenopus. Tali ovociti rimangono in buone condizioni per giorni a temperatura ambiente. Il nucleo (o vescicola germinale) sono eliminati da un ovocita con una pinza di gioielli, sia in soluzione salina (Figura 2) o in olio (figura 3). I contenuti nucleari di un nucleo di petrolio-isolato possono essere esaminati da schiacciamento delicatamente il nucleo e l'osservazione per contrasto di fase o microscopia differenziale contrasto interferenziale (DIC). Per esaminare il contenuto di un nucleo che è stato isolato in una soluzione salina, si deve prima rimuovere la membrana nucleare con una pinza di gioielli e consentire il contenuto di stabilirsi su un vetrino da microscopio. La preparazione viene poi centrifugato per attaccare tsi cromosomi saldamente alla slitta, dopo di che i cromosomi possono essere colorati con un anticorpo (Figura 4) o sottoposti a ibridazione in situ. I cromosoma a spazzola di salamandre sono molto maggiori di quelle delle rane (Figura 5). In entrambi i casi singole unità di trascrizione (geni) possono essere visti come anelli di cromatina sporgenti lateralmente dall'asse cromosoma.
Figura 1: ovociti maturi dal X. tropicalis rana. L'ovaio di una rana femminile maturo contiene migliaia di ovociti in diversi stadi di maturazione. La più piccola sono le dimensioni delle cellule somatiche e hanno già raggiunto profase della prima divisione meiotica. Come l'ovocita cresce, si accumula a poco a poco tuorlo, che dà la cellula un aspetto bianco opaco. Il più grande tappetoovociti ure, mostrato qui, acquisiscono un berretto scuro a causa di accumulo di pigmento melanina. I maggiori oociti di X. tropicalis sono di circa 0,8 mm di diametro, quelli di X. laevis circa 1,4 mm, mentre quelli della axolotl sono un enorme 2,2 mm. Fatta eccezione per dimensioni, tutti e tre sono simili in aspetto generale. Barra di scala = 1 mm.
Figura 2: rimozione del GV da un ovocita di X. tropicalis. Sinistra. Un piccolo foro è stato fatto con una pinza del gioielliere nel polo animale più scuro di un ovocita e GV è stato gentilmente estruso. In questo esempio, il GV era quasi privo di tuorlo come è venuto fuori l'ovocita. tuorlo aderente può essere rimosso da succhiare GV dentro e fuori di una pipetta con una punta di diametro leggermente maggiore del diametro del GV stesso. Destra. Three GVs di X. tropicalis. Questi GVs stati lasciati alcuni minuti in un (soluzione GV isolamento portata a pH 5,8) leggermente acido medio, che provoca l'involucro nucleare a gonfiarsi lontano dal contenuto nucleari gelificati. GVs trattati in questo modo non si diffonderanno per l'esame citologico. Tuttavia, tali GVs sono ideali per l'analisi molecolare: la busta può essere rimosso con una pinza gioiellerie, fornendo un campione di contenuti nucleari completamente liberi di contaminazione citoplasmatica. 17,18 Barra di scala = 0,5 mm. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 3: GV di X. tropicalis Isolato in olio. Sinistra. Dopo una piccola puntura è stata presentata nell'ambito ovocita vicino al Po animale scurole, GV cominciò a estrudere. In questo caso il GV è uscito con quasi nessun tuorlo aderente. In mezzo. Il GV è ora completamente libero dal citoplasma dell'ovocita. Tali GVs continuano a trascrivere l'RNA per ore. Destra. Dopo il GV è leggermente schiacciato in olio sotto un vetrino, organelli nucleari possono essere visualizzati da DIC, come mostrato qui, o per contrasto di fase. L'intera GV è molto più grande della piccola area mostrata qui. HLB = corpo istone locus con tre macchie sulla sua superficie. Barra di scala = 0,5 mm per primi due pannelli, 10 micron per il terzo. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 4: Lampbrush cromosomi (LBCs) dal Axolotl A. mexicanum. Sinistra. Destra. La stessa preparazione visto da illuminazione campo scuro. Si può ora vedere le numerose nucleoli amplificati non colorati. Barra di scala = 250 micron. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 5: Un LBC singolo dal Axolotl A. mexicanum e le tropicalis Rana X., allo stesso ingrandimento. Queste immagini illustrano la differenza di dimensioni tra estrema LBCs di una salamandra e una rana (nel riquadro). Le dimensioni difference correla con il contenuto di DNA totale dei genomi (circa 30 sterline per A. mexicanum vs 1,7 Gbp per X. tropicalis). anse laterali individuali (unità di trascrizione) sono anche molto più a lungo nella salamandra che nella rana. Barra di scala = 100 micron. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Le prime osservazioni di LBCs "vivente" GVS-isolato mano di rane e salamandre sono state fatte quasi 80 anni fa dal biologo americano William Duryee, 19 prima dell'introduzione del contrasto di fase e microscopia DIC, prima di immunostaining fluorescenti, e prima di FISH. I vantaggi di LBCs per indagare i dettagli della struttura cromosomica e trascrizione a livello singolo gene sviluppo necessario di tecniche per fissare la LBCs di vetrini, di risolverli in modo realistico, e di applicare tecniche molecolari senza distruggere la loro morfologia di base. Quasi ogni tecnica per realizzare questi obiettivi richiede un po 'di adattamento alle specie oggetto di indagine e qualche compromesso tra conservazione realistica e caratterizzazione molecolare. Per esempio, alla GVS e LBCs di anfibi dalla coda sono insolitamente facile lavorare con a causa della loro enormi dimensioni e la facilità con cui i contenuti GV disperdono nell'ambiente interessato. Uino recentemente, tuttavia, ben poco si sapeva circa i loro genomica, rendendo difficile correlare la ricchezza di caratteristiche citologiche con dettagli molecolari. Viceversa, LBCs di Xenopus sono abbastanza piccole rispetto a quelle di anfibi coda (figura 5), ma i genomi di entrambi tropicalis X. e X. laevis sono stati sequenziati e sono ragionevolmente ben annotato.
Per coloro che utilizzano prima GVs anfibi, la sfida principale sarà quella di isolare il GV e rimuovere la membrana nucleare senza danneggiare le LBCs. Fino ad oggi, nessuno ha scoperto un modo per rimuovere la busta se non per mano con le pinze del gioielliere. Sarebbe un grande passo avanti tecnico se un modo sono stati trovati per "sciogliere" o "digerire" la busta, ma lasciare i cromosomi e altri organelli nucleari danneggiati. Tale tecnica sarebbe ugualmente utile per studi molecolari. Nelle nostre indagini sulla RNA nucleare e citoplasmatica abbiamo trovato essenzialerimuovere la busta nucleare prima analisi di RNA nucleare (Figura 2). 17,18 Se la busta non viene rimosso, la piccola quantità di RNA nucleare è sommersi contaminando RNA citoplasmatico che aderiscono all'esterno della busta.
Un altro miglioramento importante sarebbe la scoperta di un modo per collegare LBCs più strettamente ad un vetrino da microscopio. Centrifugazione della preparazione è fondamentale, ma anche la centrifugazione prolungato (1 ora a 4.500 xg) non assicura attaccamento. Si può dire solitamente quando LBCs sono ben attaccati da loro esame con contrasto di fase sotto media ingrandimento. Ben attaccate cromosomi non mostrano il moto browniano a tutti. Se una moto browniano delle anse è rilevabile, successivi protocolli di immunoistochimica o pesce si portano a danni o perdita di materiale.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Paraformaldehyde (reagent grade, crystalline) | Sigma-Aldrich | P6148-500G | Despite warnings in many protocols, a concentrated solution can be stored indefinitely at RT |
| Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate | Sigma-Aldrich | A5040-100G | Sometimes referred to as MS-222 |
| Ethicon RB-1 1/2 circle taper point 3-0 sutures | VWR | 95057-000 | |
| Paraplast (paraffin wax) | Sigma-Aldrich | P3558-1KG | |
| p-Phenylenediamine | Sigma-Aldrich | P6001 | |
| Gelatin | Grocery Store | Commercial Knox gelatin works fine | |
| ProLong Gold antifade mountant | ThermoFisher Scientific | P10144 | |
| Gold Seal cover glass 22 x 22 mm #1 1/2 (0.16 - 0.19 mm thick) | Electron Microscopy Sciences | 63786-01 | These coverslips are the recommended thickness for superresolution microscopy |
| Dumont forceps #5 | Electron Microscopy Sciences | 72700-D | http://www.emsdiasum.com/microscopy/products/tweezers/dumont_positive_action.aspx |
| Paraffin oil (light) | EMD Chemicals | PX0047-1 | For isolating GVs in oil |
| Adhesive in situ PCR and hybridization chambers (25 µL) | BioRad | Frame-Seal Slide Chambers #SLF0201 | http://www.bio-rad.com/en-us/sku/slf0201-frame-seal-slide-chambers |
| Silicone isolators | Grace-Biolabs | select from catalog link | http://www.gracebio.com/life-science-products/microfluidics/silicone-isolators.html |
| Coplin jars and staining dishes | Electron Microscopy Sciences | select from catalog link | http://www.emsdiasum.com/microscopy/products/histology/staining.aspx |
References
- Purkinje, J. E. Symbolae ad ovi avium historiam ante incubationem. , Leopold Vossi. (1830).
- Rückert, J. E. Zur Entwickelungsgeschichte des Ovarialeies bei Selachiern. Anat. Anz. 7, 107-158 (1892).
- Callan, H. G. Lampbrush Chromosomes. 36, Springer-Verlag. (1986).
- Gall, J. G., Callan, H. G., Wu, Z., Murphy, C. Lampbrush chromosomes. Xenopus laevis: Practical Uses in Cell and Molecular Biology. Kay, B. K., Peng, H. B. Vol. 36 Methods in Cell Biology , Academic Press. 149-166 (1991).
- Gall, J. G., Wu, Z. Examining the contents of isolated Xenopus germinal vesicles. Methods. 51, 45-51 (2010).
- Penrad-Mobayed, M., Kanhoush, R., Perrin, C. Tips and tricks for preparing lampbrush chromosome spreads from Xenopus tropicalis oocytes. Methods. 51, 37-44 (2010).
- Morgan, G. T. Working with oocyte nuclei: cytological preparations of active chromatin and nuclear bodies from amphibian germinal vesicles. Methods Mol. Biol. 463, 55-66 (2008).
- Paine, P. L., Johnson, M. E., Lau, Y. T., Tluczek, L. J., Miller, D. S. The oocyte nucleus isolated in oil retains in vivo structure and functions. Biotechniques. 13, 238-246 (1992).
- Handwerger, K. E., Cordero, J. A., Gall, J. G. Cajal bodies, nucleoli, and speckles in the Xenopus oocyte nucleus have a low-density, sponge-like structure. Mol Biol Cell. 16, 202-211 (2005).
- Patel, S., Novikova, N., Beenders, B., Austin, C., Bellini, M. Live images of RNA polymerase II transcription units. Chromosome Res. 16, 223-232 (2008).
- Gall, J. G.
- Löschberger, A., et al. Super-resolution imaging visualizes the eightfold symmetry of gp210 proteins around the nuclear pore complex and resolves the central channel with nanometer resolution. J Cell Sci. 125, 570-575 (2012).
- Gottfert, F., et al. Coaligned dual-channel STED nanoscopy and molecular diffusion analysis at 20 nm resolution. Biophys J. 105, L01-L03 (2013).
- Wallace, R. A., Jared, D. W., Dumont, J. N., Sega, M. W. Protein incorporation by isolated amphibian oocytes: III. Optimum incubation conditions. J. Exp. Zool. 184, 321-333 (1973).
- Bridger, J. Fluorescence in situhybridization to DNA. Cells: A Laboratory Manual. Spector, D. L., Goldman, R. D., Leinwand, L. A. 3, Cold Spring Harbor Press. 111.111-111.136 (1998).
- Singer, R. H. In situ hybridization to RNA. Cells: A Laboratory Manual. Spector, D. L., Goldman, R. D., Leinwand, L. A. 3, Cold Spring Harbor Press. 111-116 (1998).
- Gardner, E. J., Nizami, Z. F., Talbot, C. C. Jr, Gall, J. G. Stable intronic sequence RNA (sisRNA), a new class of noncoding RNA from the oocyte nucleus of Xenopus tropicalis. Genes Dev. 26, 2550-2559 (2012).
- Talhouarne, G. J., Gall, J. G. Lariat intronic RNAs in the cytoplasm of Xenopus tropicalis oocytes. RNA. 20, 1476-1487 (2014).
- Duryee, W. R. Isolation of nuclei and non-mitotic chromosome pairs from frog eggs. Arch. Exp. Zellforsch. 19, 171-176 (1937).
