Summary
Biz kurbağa ve semender ve oosit yaşayan dev transkripsiyonel olarak aktif lampbrush kromozomları izole etmek için basit teknikleri sunuyoruz. Biz faz kontrast ya da diferansiyel girişim kontrast ve nasıl situ hibridizasyon veya immunofluorescent boyama floresan için bunları düzeltmek için tarafından "canlı" bu kromozom gözlemlemek açıklanmıştır.
Abstract
Biz kurbağa ve semender ve oosit ya da unlaid yumurta, bulunan dev transkripsiyonel olarak aktif lampbrush kromozom (LBCs) çalışmak için yöntemler açıklanmaktadır. Bağımsız LBCs uzunluğu en fazla 1 mm olabilir ve çapı 0.5 mm, dev bir çekirdekte kendisini bulunur. kromozomların büyük boyutlu ışık optik mikroskop ile aktif genlerin eşsiz gözlemleri izin, ama aynı zamanda özel teknikler, çekirdeğin izole nükleer zarfı kaldırarak ve bir mikroskop lamı üzerine kromozom yaymak için gereklidir. Ayrıca, germinal vesicle (GV) olarak adlandırılan oosit çekirdeği, çekirdek aktin kısmi jelleşme izin verir ve LBCs hassas yapısını koruyan bir ortamda izole edilir. Bu adım kuyumcuya forseps kullanarak bir mikroskop altında elle yapılır. Sonraki nükleer zarf kuyumcu forseps ile tekrar el kaldırılır. çekirdek içindeki hızlı bir şekilde dağılma, bir ortama transfer ediliraktin jel RBDÖ ve hasarsız LBCs bir mikroskop lamı üzerine yerleşmek için izin verir. ince ayrıntılar Brown hareketi tarafından gizlenmiş olmasına rağmen bu noktada LBCs ve diğer nükleer organeller, faz kontrast veya diferansiyel girişim kontrast mikroskobu ile görülebilir. yüksek çözünürlüklü mikroskobik gözlem veya moleküler analiz için, tüm hazırlık slayt sıkıca hassas LBCs takmak için santrifüj edilir. Paraformaldehid kısa tespit sonra immunofluorescent boyama ya da in situ hibridizasyon takip edilir. LBCs bir transkripsiyonel olarak aktif durumda olan ve onların büyük boy konfokal ya da süper çözünürlük mikroskopi kullanılarak bireysel gen düzeyinde moleküler analiz izin verir.
Introduction
Çoğu omurgalıların, keseliler ve plasentalı memelilerin önemli hariç, büyük yolky yumurta üretmek. onların bazen muazzam boyutlarına rağmen, bu yumurtalar dişi yumurtalıkta ise hala nihai bir boyut ulaşmak tek hücrelerdir. Yumurtalık yumurta oosit denir ve her biri tipik sadece germinal vezikül veya GV gibi erken 19. yüzyıldan beri bilinen tek ve dev bir çekirdeğe içerir. Ortak laboratuvar kurbağalar, Xenopus laevis ve Xenopus tropicalis 1 Oositler, 1.2 mm ve 0.8 mm sırasıyla (Şekil 1) bir maksimal çapı ulaşır. Çapı 0.4 mm (Şekil 2, 3) - Bu iki kurbağa olgun oosit gelen GV 0.3 vardır. Salamanders genellikle daha büyük oosit ve GVS var. Meksika Axolotl, Ambystoma mexicanum Tamamen olgun oosit, çapı en fazla 2 mm ve GV 0.5 mm'dir. Bu durumda, bu çekirdekler çıplak göz ve kutu kolaylıkla görebilirTipik somatik hücre çekirdekleri ile imkansız birçok yönden manipüle edilebilir.
Eşit olağanüstü GV, 19. yüzyılın sonunda zaten tanınan bir gerçeği içinde kromozomların dev boyutudur. Ambystoma ve diğer semender Bireysel kromozom uzunluğu en fazla 1 mm (Şekil 4, 5) olabilir. 100 um veya daha fazla uzunluğa sahip, en organizmaların normal somatik kromozom cüce, ancak Xenopus olanlar, daha küçük önemli bulunmaktadır. Eşleştirilmiş yanal döngüler yüzlerce (Şekil 5) - oosit kromozom önemli bir özelliği onların en karakteristik morfolojik özelliklerinden biri neden olağanüstü transkripsiyonel aktivite vardır. Her döngü aktif RNA sentez, bir ya da bir kaç transkripsiyon birimi içerir. döngüler oosit onların yüzeysel sonra adı "lampbrush" kromozomun yol açan bir bulanık bir görünüm, kromozom vermekgaz lambası bacaları temizlemek için önceki zamanlarda kullanılan fırçalara benzerliği. 2
Bu çalışmanın odak LBCs ve nükleer organelleri (nükleol, histon eğrisi organları ve benekleri) incelemek için izole GVs kullanımı üzerindedir. İki oldukça farklı teknikler tarif edilecektir. İlk olarak, daha yaygın teknikte, GVs kısa yapışık sarısı uzaklaştırılması için yıkanır, takı forseps kullanılarak bir tuzlu su çözeltisi içinde izole edilmiştir ve çekirdek zarı takı forseps ile tekrar çıkartılır. LBCs ve nükleer organelleri içeren jelatinli içeriği, bir cam mikroskop lamı veya lamel üzerine yerleşmek için izin verilir. Bu gibi terkipler, faz kontrastı ya da DIC mikroskop ile doğrudan incelenebilir. Seçenek olarak ise, preparatlar slayt veya lamel LBCs ve organeller takmak için santrifüj olabilir. Bu gibi preparasyonlar, başta, bağışıklık ve flüoresan olarak, nükleik asitlerin ve proteinlerin ayrıntılı moleküler analiz için işlenebilirin situ hibridizasyon (FISH) t. 3-7
İkinci bir teknik, mineral yağ içinde GV izole edilmesini gerektirmektedir. 8 Yağ izole GVs saatlerce transkripsiyonal olarak aktif kalır ve bir çekirdek içindeki mümkün olduğu kadar gerçekçi olmasını isteyen çalışmalar için potansiyel olarak yararlıdır. Nükleer "sap" kırılma indeksi LBCs ve diğer nükleer organellerin (Şekil 3) birbirine çok yakın olduğu için 9,10, mikroskobik teknikler yağ izole GVs ile bir sorun olabilir.
Son olarak, çünkü boyutu ve manipülasyon kolaylığı, GVs çekirdek zarfına ilgili çalışmalar için ideal bir malzemedir. Nükleer gözenek kompleksi ilk amfibi GV zarf 11 ve daha yeni superresolution gözlemlere elektron mikroskobik çalışmalar açıklanan aynı malzemeyi kullandık. 12,13
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Genel kurbağalar ve semenderler hakkında bilgi yanı sıra hayvanların kaynakları, aşağıdaki web sitelerinden bulunabilir: Xenbase (http://www.xenbase.org) ve Sal-site (http://www.ambystoma.org). Bu protokol Bilim Carnegie Kurumu Embriyoloji Anabilim Dalı hayvan bakım kuralları takip eder.
1. Çözümler
- Karıştırılarak 1 M NaHCO 3 deiyonize ya kloru giderilmiş H2O L 10, 1 M CaCl2 ve 10 ml 10 ml ekleyin: 10 L "kurbağa suyu" emin olun.
- 1 L% 20 paraformaldehid Üyeler: 4 mM Na 2 1 L CO 3 yapın. Kimyasal bir kaput çözünmesi yaklaşık 80 o C toz paraformaldehid ve ısı 200 g ekleyin. filtre kağıdı ile serin ve filtre edin. Dikkat: paraformaldehit toksik ve dikkatle ele alınması gerekir. Alternatif olarak, ticari paraformaldehit çözümü satın.
- 1 L amfibi anestezik çözüm olun: etil 3-aminoben 1.5 g ekleyin1 L kurbağa suya zoate metansülfonat. Oda sıcaklığında saklayınız.
- Yap 1 L oosit kültür ortamı OR2 14: 82.5 mM NaCI, 2.5 mM KCI, 1 mM CaCl2, 1 mM MgCl2, 1 mM Na 2 HPO 4, 5 mM HEPES (500 mM stok, pH 8.3). Nihai pH yaklaşık pH 7.8 olacaktır. bakteri gelişimini önlemek için 100 mg ampisilin ve 100 mg streptomisin ekleyin.
- 1 L GV yalıtım çözeltisi yapmak: 83 mM KCI, 17 mM NaCI, 6.5 mM Na-2 HPO 4, 3.5 mM KH 2 PO 4, 1 mM MgCl2, 1 mM ditiotreitol (DTT). pH 7.0 ayarlayın.
- 100 mL GV dispersiyon çözeltisi yapmak: 20.7 mM KCI, 4.3 mM NaCI, 1.6 mM Na-2 HPO 4, 0.9 mM KH 2 PO 4, 1 mM MgCl2, 1 mM ditiotreitol (DTT),% 0.1 paraformaldehit. pH 7.0 ayarlayın. Nükleer jel daha hızlı dağılmasını kolaylaştırmak için, 10-50 uM CaCl2 ilave edin.
- 500 mL subbing çözüm olun. 2 ticari jelatinin Şişme 0.5 g10 dakika - 5 0 mL H2O. 500 mL kaynar H 2 O ekleyin ve dikkatlice jelatin çözmek için girdap. Serin ve ekleme 50 mg crk (SO 4) 2 · 12 H 2 O 4 o C'de emme ve mağaza ile Filtre
- orta montaj 10 ml olun. 5 ml PBS içerisinde 10 mg fenilendiamin çözülür (135 mM NaCI, 2.5 mM KCI, 4.3 mM Na 2 HPO 4, 1.5 mM KH 2 PO 4, pH 9'a ayarlanmıştır). 5 ml gliserol ekleyin. C o -80 250 ul alikotları saklayın
2. Malzemeler
- Altyazılı slaytlar için, yer 3 inç x 1 inç cam mikroskop ticari bir deterjan çözeltisi içinde kayar ve herhangi bir kirleri çıkarmak için onları ovmak. slayt rafa yerleştirilir ve daha sonra deiyonize su içinde musluk suyu ile durulayın. , Subbing çözeltide slaytlar daldırma bir açıyla drenaj ve 60 o C'de gece boyunca fırında
- Plastik kareler için, 1 mm kalınlığında poli (metil metakrilat) bir tabaka 25 mm'lik kareler kesilir. Matkap birHer bir karenin merkezinde 5 mm yuvarlak delik. Kum yüzleri ve meydanda yanı sıra deliğin çevresi kenarları hem.
Not: bir sonraki paragrafta tarif edildiği gibi, plastik kareler ve de slaytlar yapımı için bir başka seçenek olarak, in situ, PCR ve hibridizasyon odaları (25 uL) ticari bir yapıştırıcı kullanır. Bu iyice henüz test edilmemiş olmasına rağmen bir olasılıkla da, hücre kültürü için yeniden kullanılabilir silikon izolatörleri kullanabilirsiniz. - Sıcak bir plaka üzerinde 50 ml bir cam beher içinde - (57 o C 56) parafın balmumu 30 g - de slaytlar için 20 eritebilir. Bir 20 uL pipet ile, altyazılı slayt merkezinin her iki tarafında parafin biri 5 uL damla yayıldı. parafin içine plastik bir kare basın ve sıcak plaka üzerine slayt yerleştirin. parafin eriyecek ve plastik meydanda altında yayılır gerekir.
- Sıcak plaka slayt çıkarın ve soğumaya bırakın. sürgünün her iki ucunda küçük bir destek yer, çok kayar tabl temas etmezsoğutma işlemi sırasında ETOP. parafin çok hızlı soğur, o uzakta merkezi delikten çekebilir. 10 veya daha fazla kuyu slaytlar hazırlayın: Her GV hazırlığı yeni bir kuyu slayt kullanır.
- santrifüj için slayt taşıyıcıları için, özel olarak kullanılan rotor için taşıyıcılar inşa kullanın. iyi plastik plakalar - Çeşitli üreticilerin 96 için taşıyıcılarla santrifüjler sağlar. Bu firmalar mikroskop slaytlar tutmak için oldukça kolay adapte edilebilir.
Oosit 3. İzolasyon
- Tamamen hayvan karşılamak için yeterli anestezi çözelti içinde Yetişkin bir dişi kurbağa (Xenopus laevis veya Xenopus tropicalis) ya da semenderleri (Ambystoma mexicanum) yerleştirin. hayvan hareketlerini kesildiğinde, o uygun bir kaba yontma buz bir yatakta karın-up yerleştirin.
- cerrahi makas 2 yapmak ile - alt karın bölgesinde 3 cm'lik bir kesi orta hat lateral. (Th kesi tarafında yumurtalık bulmak için yavaşça kenara iç organları Taşıere iki Yumurtalıklar, karnın her iki tarafında bir) bulunmaktadır. Planlanan deneyler için yeterli oosit ile yumurtalığın bir kısmını kesip. oosit binlerce her yumurtalıkta olduğu için, yumurtalık, nispeten küçük bir parça (1-3 cm), genellikle yeterli olacaktır.
- bir ya da daha, oda sıcaklığında büyük bir petri (100 mm) OR2 tuz yumurtalığın birkaç parça yerleştirin. zarar oositin çıkarılması durumunda Oositler, birkaç gün boyunca iyi durumda saklanabilir ve OR2 çözeltisi günlük olarak değiştirildi.
- cerrahi ipek ile kesi dikin ve kurtarma için tek bir cam kase hayvan dönün. bu bilinç (yaklaşık 15 dk) kavuşur kadar hayvan karşılamak için yeterli "kurbağa suyu" ekleyin. Hayvan istemli hareketlerin gösterir sonra, su ile kase doldurun. tatlı su kullanılmalıdır rağmen amfibi ameliyat sonrası enfekte neredeyse asla, kısırlık, gerekli değildir. Arzu edildiği takdirde, neomisin dikiş uygulanabilir. Yara genellikle fe sonra tamamen iyileşirw günler ve aynı hayvan yaklaşık 2 ay sonra tekrar kullanılabilir.
Bir torbacığı (GV) 4. Yalıtım
- OR2 solüsyonu içeren küçük bir petri (35 x 10 mm) - (20 büyük oosit 10) yumurtalık bir kısmını yerleştirin.
- yumurtalık duvara oosit bağlayan doku ince sapı gözyaşı 5. kuyumcu forseps iki çift kullanarak yumurtalıktan bir oosit çıkarın. GV izolasyon ortamı içeren başka bir küçük petri oosit yerleştirin.
NOT: LBCs devlet oosit büyüklüğü (vade) bağlıdır. LBCs tam boyutunda biraz daha az olan oosit belirgin döngüler ile maksimum uzunluğa ulaştıracak. en olgun oosit genellikle sözleşmeli döngüler ile kısa kromozom içerir. - bir diseksiyon mikroskobu (- 20 mm alan çapı yaklaşık 10) düşük büyütme altında aşağıdaki adımları uygulayın.
- hayvan kutup (koyu yarıküre) yakın forseps iki çift ile oosit kavramak ve bir sm yapmakTüm gözyaşı. şeffaf oosit çekirdeğinde için çekilmiş sarısı bak, ayrıca germinal vezikül veya GV denir.
- Alternatif olarak, forseps bir çift ile hayvan kutbuna yakın büyük bir delik kurcalamak ve yavaşça sarısı (Şekil 2) ile birlikte GV sıkmak.
- Nazikçe sarısı kütlesinden GV yuvarlayın. Genellikle GV sıkıca yapışık sarısı küçük bir miktar olacaktır.
Nükleer Zarf 5. Kaldırma
- X. laevis ve X tropicalis için, hala biraz yapışkan sarı olsa bile, izolasyon 60 saniye içinde yayılma ortamına izolasyon ortamından GV aktarın.
Not: İzolasyon ortamı içinde ayrıldı ve daha sonraki kademelerde yayılmamış eğer GV, bu iki türün yaklaşık 60 saniye içinde "sertleşmeye". Xenopus GV içeriğini inceleyerek nedenle hız büyük önem taşımaktadır.- bir çift ile GV üst kısmına yakın nükleer zarf kavramakkuyumcu forseps, özen aşağı basmamaya. mümkün olduğunca ilk olarak yakın forseps ikinci bir çift ile zarfı kavrayın. Birbirlerinden uzakta ve GV içerikleri bir veya her iki forseps sıkıca yapışır zarf, dışarı özgür "pop" yapacaklarını forseps iki çift çekin.
- bir cam pipet GV içeriklerini veya ayarlanabilir 20 uL mikropipet Pick up. ayarlanabilir bir pipet kullanarak ise, 10 ul pipet ayarlamak ve jilet plastik ucunun ucu kesilmiş. Kalan 5 uL GV çekme önce sıvı 5 ul çizin.
- Daha önce çözüm yayılan dolu bir kuyu slayt merkezine hala jölelenmişti nükleer içeriğini aktarmak. Lamel eklendiğinde bir baloncuk tuzak değildir, böylece yayılan çözeltisi dışbükey bir yüzeye sahip olmalıdır.
- Bir lamel (18 mm) ekleyin ve nemli bir odada slayt yerleştirin. Nükleer jel yavaş yavaş önümüzdeki 10 üzerinde dağılacaktır - 60 dakika böylece kromozomlar ve nükleer organelleri cam slayt yüzeyinde yalan geliyor.
NOT: semenderlerin A. mexicanum ve GV ve N. viridescens haksız yere izolasyon ortamında "sertleşmesine" yoktur. Bu nedenle bir Xenopus ile bir can daha nükleer zarfın kaldırılması ile daha yavaş devam edebilirsiniz.
- Bölüm 5.1.1 de tarif edildiği gibi bir semender GV nükleer zarfı kaldırma fakat izolasyon ortamında yaparlar.
- Bir pipet yardımıyla hafifçe jölelenmişti GV içeriğini Pick up ve yayılma çözeltisi içeren bir petri transfer.
- Çabuk, yayma çözeltide pipet yıkayın nükleer jel pick up ve daha önce çözüm yayılan dolu bir kuyu slayt ortasına yerleştirin. 18 mm'lik bir örtücü cam ekleyin ve nemli bir odada bütün slayt yerleştirin. Nükleer özsuyu yavaş yavaş önümüzdeki 10 üzerinde dağılacaktır - 60 dakika ve kromozomlar ve nükleer organelleri cam yüzeye yalan gelecektir. </ Ol>
LBCs ve Organellerin 6. Ön Gözlem
- yayma odasında nükleer içeriğinin dağıtılması sonrasında düşük büyütme faz kontrast (konvansiyonel dik mikroskop) tarafından LBCs ve nükleer organelleri görüntüleyin. (- 10X 5X) odası yaklaşık 1 mm derinliğinde ve nükleer içeriği altta olduğundan, uzun bir çalışma mesafesi ile düşük büyütmeli objektif kullanın.
NOT: Şu anda hazırlık incelenmesi için başlıca nedeni sonraki adımlarda taşıyan değer olup olmadığını tespit etmektir. İyi bir hazırlık içinde kromozomlar kırılmamış ve odasının tabanına yerleşmiştir. Bu slayt lampbrush kromozom döngüler optimal eki sağlayacak şekilde, hazırlık yapma bir saat içinde santrifüj adıma geçin.
Nükleer İçindekiler 7. Santrifüj
- lamel filtre bir parça kağıt yerleştirin ve bastırınbölmeden fazla sıvının çıkması için.
- Lamel her iki tarafında vazelin yaklaşık olarak 1 mm3 koyun. Altta yatan plastik kare üzerine lamel mühür 80 o C - 70 ısıtılmış bir metal çubuk ile vazelin eritin.
- Yeri santrifüj için slayt taşıyıcılarında slaytlar, yapım emin zıt taşıyıcılar dengelenmiştir. 1 saat - 30 dakika için yaklaşık 4800 xg'de slaytlar santrifüj. 4 o C Kullanımı santrifüj yavaş start özelliği de.
8. Nükleer İçeriği Tespit
- En sonraki prosedürler için, paraformaldehid ile nükleer içeriğini düzeltmek.
- Standart bir mikroskop lamı boyama çanak içine bir slayt rafa koymak ve daha sonra rafa ayrı ayrı slaytlar yerleştirin. (- OR2 veya PBS içinde% 4 paraformaldehid 2) slaytlar karşılamak için yeterli fiksatif ekleyin.
- Künt forseps bir çift ile yanal lamel itin pick up ve uygun cam çöpe atın.30 dakika - en az 15 için sabitleştirici slaytlar bırakın. In situ hibridizasyon ve en antikor lekeleri, tespitin daha uzun süreler (h veya d) izin verilir.
- plastik kare çıkarmak için, bir yerde bir boyama çanak buz içine bir seferde soğuk OR2 veya PBS bir tane slaytlar. plastik meydanın kenarında keskin bir jilet bıçağı yerleştirin ve Çıkarmak.
NOT: İdeal plastik, temiz dökülmek slayt tüm parafin bırakarak olacaktır. Balmumu yararlı bir amaca hizmet eder: nükleer içeriği slayt bağlı olan küçük orta alanı çevreleyen beri, bu küçük hacimleri ile çalışmaya olanak sağlayan bir baraj gibi davranır - vb immün, için ayıraç (5 10 uL). Slaytlar soğuk OR2 veya PBS içinde süresiz yapılabilir.
LBCs ve Nükleer Organellerin 9. immün
- OR2 veya PBS depolama sabit GV hazırlık çıkarın. nemli bir odaya destekler üzerinde aşırı sıvı ve yeri silin. Uygun bir odacıklıer nemli filtre kağıdı 90 mm daire içeren bir 90 x 15 mm petri olduğunu.
NOT: Bu noktada, çekirdek içindeki sıkı parafin mumu bilgilerini 5 mm dairesel bir alanda sürgüye bağlıdır. mum su itici olduğundan, bir ekleme ve 20 uL pipet ile orta alanda kenarına sıvı küçük miktarlarda kaldırarak çözüm değiştirebilirsiniz. büyük önlem pipet ile balmumu içermeyen alana dokunmamak için olduğunu. - reaktiflerin - (20 uL 10), küçük hacimleri ile immün yürütmek. kromozomlar ve nükleer organelleri çok küçük ve ilave edilen belirteçlerle veya hemen temas içinde olduğu için, boyama protokolleri kısa olabilir. Primer ve sekonder antikor boyama süreleri 1 saat ya da daha az gibi kısa olabilir. Bu hazırlık hasara neden olur gibi herhangi bir aşamada deterjan dahil etmeyin. LBCs eksenleri vurgulamak için 20 dakika - Arzu edildiği takdirde, 10 DAPI ile hazırlanması (1 ug / mL) boyanır.
- gliserol Mount veya ticari montajimmünofloresan orta uygun ing. Montaj aşaması sırasında hava kabarcığı yakalama önlemek için, aşağıdaki gibi devam edin.
- 20 mcL pipet ucu içine montaj orta 15 mcL çekin. (# 1 filtre kağıdı bir 90 mm daireden çok ince üçgen şeklinde kesilmiş) filtre kağıt parçası ile kapalı "esneklik" hemen nükleer yayılma çevresi itibaren çok sıvı mümkün olduğunca kaldırın.
- Nükleer yayılma alanını dokunmamaya dikkat ederek, hazırlık üzerine montaj orta çoğu pipetle. son 1 mcL yerleştirin veya 22 mm lamel (kalınlık # 1.5) merkezinde montaj orta böylece. hazırlık üzerine lamel ters çevirin ve yerine dikkatlice bırakın.
- Geçici bağlar için, bir kaç güne kadar,% 50 gliserol içinde 1 mg / ml fenilendiamin kullanımı. Kalıcı bağlar için, özellikle de superresolution çalışmaları için yaklaşık 1.46 bir kırınım indisi için sertleştirilen bir düşük floresan ortamını kullanmak.
Situ Hibridizasyon (FISH) LBCs ve Nükleer Organellerin 10. Floresan
- BALIK protokolleri genellikle yüksek bir sıcaklıkta bir adım gerektirdiğinden, preparattan parafin çıkarın. prosedür sıkıcı ve hazırlık kazara hasarlara yol açabilir, ancak dikkatli bir jilet ile kazımak. Bir elmas noktası ile arka yüze hazırlama alanı işaretlemek için yararlıdır.
- Seçenek olarak ise, ksilen, parafin mumu çözülür. Coplin kavanoz veya içeren boyama yemekleri bir dizi ayarlama:% 30,% 50,% 70,% 95, ve% 100 etanol; ksilen 3 kaplar; % 100 etanol ve bir aseton 2 daha fazla konteyner.
- (Ajite ise kısa süreler) 5 dakika, her konsantrasyonda - slayt taşıyıcı slaytlar yerleştirin ve 3 slaytlar bırakarak, etanol serisinde bunları kurutmak.
- ksilen 3 kapların içinden slaytlar geçirerek parafin çözülür, yaklaşık 5 dakika her ajite ise. Kaldırİki% 100 etanoller geçirilerek ksilen ve son olarak da aseton ile etanol çıkarıldı. aseton slaytları alın ve kuruması için onları eğin.
- Herhangi bir standart protokolü kullanılarak in situ melezleme yürütmek. 15,16
Petrol altında GV 11. İzolasyonu
- Mümkün olduğunca az çevreleyen dokuda da dahil olmak üzere, kuyumcu forseps ile OR2 çözümünden bir oosit pick up. # 1 filtre kağıdı küçük bir parça üzerinde oosit yerleştirin. Aşırı OR2 çözüm sıvının neredeyse serbest oosit bırakarak, filtre kağıdına aktarılır. "Kuru" oosit pick up ve küçük bir petri (35 x 10 mm) hafif mineral yağ (parafin yağı) yüzeyinin altına yerleştirin.
- ince bir tungsten iğne veya forseps bir tine ile, karanlık hayvan kutup yakın oosit küçük bir delik açmak. (Ipuçları kaçınarak) forseps bir çift ile oosit pick up ve yavaşça sıkın. GV daha küçük veya l ile birlikte a'ya olacakYüzeyinde sarısı Arger miktarı (Şekil 3).
- yavaşça forseps yüzü GV süpürülerek mümkün olduğu kadar çok yumurta sarısı çıkarın. Çoğu durumda sarısı kaldırmak için zor olur. Bununla birlikte, bir çok amaç için sarısı bir miktar bir sorun değildir.
- GV içeriğini gözlemlemek için, az ya da çok ölçüde GV dümdüz.
- iyi slayt plastik kare çıkarın ve parafin yağı için sığ bir kap olarak kalan parafin kullanın. 10 20 uL pipet parafin yağı ile birlikte GV Pick up ve parafin alanının merkezine transfer. lamel ekleyin ve kısmen düzleşmiş GV içeriğini inceleyin. Bu teknik LBCs zarar vermez.
- Alternatif olarak, nükleer organellerin gözlem için yaklaşık 10 mikron kalınlığına GV dümdüz.
- keskin bir jilet ile bir plastik pipet son 1 mm kesti. içine GV Suckmineral yağ tam 5 uL ile birlikte ucu. 22 mm cam lamel merkezi üzerine GV ve tüm yağ a'ya.
- Sadece petrol damla temas edene kadar yavaşça standart 3 "x 1" cam slayt indirin. damla ve lamel kılcallık yoluyla kalkacak ve petrol lamel kenarlarına yayılacak. damla tamamen yayıldı, petrol yaklaşık 10 mikron kalınlığında olacaktır. LBCs hasar görecek ve büyük nükleol hafifçe sıkıştırılır, ancak sağlam GV (Şekil 3) mevcut gibi küçük nükleer organellerin çoğu az ya da çok görünür.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Dev lampbrush kromozomlarını inceleyen bir kurbağa ya da semender oosit izole ederek başlar. Şekil 1, kurbağa, Xenopus överden çıkarıldıktan sonra tamponlu tuzlu su çözeltisi içinde, olgun oosit, bir grubu gösterir. Bu oositler, oda sıcaklığında gün iyi durumda kalır. Çekirdeği (ya da germinal vesicle) daha sonra ya bir tuz çözeltisi (Şekil 2) ya da yağ içinde, takı forsepsle bir oosit (Şekil 3) çıkarılır. yağ izole çekirdeğin nükleer içeriği nazikçe çekirdeğini Ezici ve faz kontrast ya da diferansiyel girişim kontrast (DIC) mikroskopi ile gözlemleyerek incelenebilir. Bir tuzlu su çözeltisi içinde izole edilmiş bir çekirdeğin içeriğini incelemek için, bir ilk kuyumcu forseps ile nükleer zarfı kaldırmak ve içeriği bir mikroskop lamı üzerine yerleşmek için izin vermelidir. Preparasyon daha sonra t bağlamak için santrifüjlenirKromozomdan bir antikor (Şekil 4) ile boyandı ya da in situ hibridizasyon işlemine tabi tutulabilir, sonra slayt, sıkıca kromozom. Semenderlerin lampbrush kromozomları kurbağa (Şekil 5) oranla daha büyüktür. Her iki durumda da, bireysel transkripsiyon birimi (genler) kromozom ekseninden yana doğru çıkıntı yapan kromatin döngüler olarak görülebilir.
Şekil 1: Kurbağa X. tropicalis Olgun oositler. olgun kadın kurbağa yumurtalık olgunlaşması farklı aşamalarında oosit binlerce içerir. En küçük somatik hücre boyutu ve zaten ilk mayoz bölünme profaza ulaşmıştır. oosit büyüdükçe, yavaş yavaş hücresini opak beyaz bir görünüm veren, sarısı birikir. en büyük matBurada gösterilen ure oosit, nedeniyle melanin pigmentinin birikimi koyu bir kap kazanır. X. tropicalis büyük oosit Axolotl kişilerce çok büyük bir 2.2 mm iken X'in O, yaklaşık 1.4 mm laevis, çapı yaklaşık 0.8 mm'dir. boyutu hariç, her üç genel görünümünü benzer. Ölçek çubuğu = 1 mm.
Şekil 2: X. tropicalis bir Oosit gelen GV uzaklaştırılması. Sol. Küçük bir delik, bir oositin koyu hayvan kutupta takı forseps ile yapılmış ve GV nazikçe ekstrüde edildi. o oositin çıktı olarak bu örnekte GV sarısı neredeyse ücretsiz. Yapışık sarısı GV kendisinin çapından sadece biraz daha büyük bir ucu çapı ile ve bir pipetin GV emerek kaldırılabilir. Sağ. TX. tropicalis GV hree. Bu GV çekirdek zarı uzaklıkta jelleşmiş çekirdek içeriklerinden şişmesine neden olan bir hafif asit ortamı (pH 5.8 ayarlanır GV yalıtım çözeltisi), bir kaç dakika kalmıştı. Bu şekilde tedavi GV sitolojik inceleme için yayılır olmayacaktır. Bununla birlikte, bu GVs moleküler analiz için idealdir: Zarf sitoplazmik kirlenme tamamen arınmış çekirdek içindeki bir numunenin sağlanması, mücevher kerpetenler ile temizlenebilir. 17,18 Ölçek çubuğu = 0,5 mm. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Şekil 3: Petrol İzole X. tropicalis GV. Sol. bir küçük delik karanlık hayvan po yakın oosit yapıldı sonrale, GV a'ya başladı. Bu durumda GV neredeyse hiç yapışık sarısı ile çıktı. Orta. GV şimdi oosit sitoplazması tamamen ücretsizdir. Böyle GV saatlerce RNA yazıya devam ediyor. Sağ. GV nazikçe bir lamel altında yağ içinde ezilmiş sonra, nükleer organelleri burada gösterildiği gibi, DIC tarafından görüntülenen veya faz kontrast ile yapılabilir. Tüm GV Burada gösterilen küçük bir alanda çok daha büyüktür. HLB yüzeyinde üç benekler ile histon odağı gövdesini =. Ölçek çubuğu ilk iki paneller için = 0,5 mm, üçüncü 10 mikron. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Şekil 4: Lampbrush Kromozomlar (LBCs) Axolotl A. mexicanum gelen. Sol. Sağ. Aynı hazırlık karanlık alan aydınlatma tarafından izlendi. Bir anda çok sayıda boyanmamış güçlendirilmiş nükleol görebilirsiniz. Ölçek çubuğu = 250 mikron. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Şekil 5: Aynı Büyütme de Axolotl A. mexicanum ve Kurbağa X. tropicalis A Tek LBC. Bu görüntüler bir semender LBCs ve bir kurbağa (ek) arasındaki aşırı büyüklük farkı göstermektedir. farklı bir şekilde boyutce (X. tropicalis 1.7 GBP vs A. mexicanum için yaklaşık 30 GBP) genomlar toplam DNA içeriği ile ilişkilidir. Bireysel yanal döngüler (transkripsiyon birimleri) kurbağa çok daha uzun semender da vardır. Ölçek çubuğu = 100 mikron. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Kurbağalar ve salamanders el-izole GVs gelen "yaşam" LBCs ilk gözlemler floresan immün önce ve FISH önce, Amerikan biyolog William Duryee, faz kontrast ve DIC mikroskopi giriş önce 19 tarafından yaklaşık 80 yıl önce yapılmıştır. gerçekçi bir şekilde bunları düzeltmek için, ve temel morfolojisi bozmadan moleküler teknikler uygulamak için, cam slaytlar LBCs takmak için teknikler bireysel gen düzeyinde gerekli gelişimini kromozom yapısı ve transkripsiyon detaylarını araştırmak için LBCs avantajları. Bu hedefleri gerçekleştirmek için neredeyse her teknik soruşturma altında türler ve gerçeğe yakın koruma ve moleküler karakterizasyonu arasında bazı uzlaşma için bazı adaptasyon gerektirir. Örneğin, GVs ve sondan amfibi LBCs nedeniyle büyük boyutu ve GV içeriği, uygun bir ortam içinde dispers kolaylığı nedeniyle çalışmak alışılmadık kolaydır. Until Ancak yakın zamanda, çok az zor moleküler detayları ile sitolojik özelliklerin zenginliği ilişkilendirmek için yapım, onların genomik hakkında biliniyordu. Tersine, Xenopus LBCs kuyruklu amfibiler (Şekil 5) kıyasla oldukça küçük, ama her ikisi de X tropicalis ve X. laevis genomları sıralı edilmiş ve oldukça iyi açıklamalı.
bu ilk kullanan amfibi GVs için büyük zorluk GV izole ve LBCs zarar vermeden nükleer zarf kaldırmak olacaktır. Bugüne kadar hiç kimse kuyumcu forseps ile elle dışında zarfı çıkarmak için bir yol keşfetti. bir yol "çözmek" veya zarf "sindirmek" ama hasarsız kromozomları ve diğer nükleer organelleri bırakmak bulundu eğer büyük bir teknik ilerleme olacaktır. Böyle bir teknik, moleküler çalışmalar için de yararlı olacaktır. Nükleer ve sitoplazmik RNA bizim araştırmalarda biz bu temel bulunduNükleer RNA (Şekil 2) analizinden önce nükleer zarfı kaldırın. Zarf kaldırılmazsa 17,18, nükleer RNA az miktarda zarfın dış yapışır sitoplazmik RNA kirletici tarafından bastırıldı.
Bir diğer önemli bir gelişme, bir mikroskop lamı daha sıkı LBCs takmak için bir şekilde bulunması olacaktır. hazırlık Santrifüj kritik olmakla birlikte, hatta uzun süreli santrifüj (1 saat xg 4500 at) eki garanti etmez. LBCs iyi orta büyütme altında faz kontrast ile incelenerek eklendiğinde Bir genellikle söyleyebilirim. Kromozomlar hiç Brown hareketi göstermek İyi bağlı. halkaların herhangi Brown hareketi tespit edilebilir, sonraki immün ya da balık protokoller detaylı hasar ya da malzeme kaybına neden olur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Paraformaldehyde (reagent grade, crystalline) | Sigma-Aldrich | P6148-500G | Despite warnings in many protocols, a concentrated solution can be stored indefinitely at RT |
| Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate | Sigma-Aldrich | A5040-100G | Sometimes referred to as MS-222 |
| Ethicon RB-1 1/2 circle taper point 3-0 sutures | VWR | 95057-000 | |
| Paraplast (paraffin wax) | Sigma-Aldrich | P3558-1KG | |
| p-Phenylenediamine | Sigma-Aldrich | P6001 | |
| Gelatin | Grocery Store | Commercial Knox gelatin works fine | |
| ProLong Gold antifade mountant | ThermoFisher Scientific | P10144 | |
| Gold Seal cover glass 22 x 22 mm #1 1/2 (0.16 - 0.19 mm thick) | Electron Microscopy Sciences | 63786-01 | These coverslips are the recommended thickness for superresolution microscopy |
| Dumont forceps #5 | Electron Microscopy Sciences | 72700-D | http://www.emsdiasum.com/microscopy/products/tweezers/dumont_positive_action.aspx |
| Paraffin oil (light) | EMD Chemicals | PX0047-1 | For isolating GVs in oil |
| Adhesive in situ PCR and hybridization chambers (25 µL) | BioRad | Frame-Seal Slide Chambers #SLF0201 | http://www.bio-rad.com/en-us/sku/slf0201-frame-seal-slide-chambers |
| Silicone isolators | Grace-Biolabs | select from catalog link | http://www.gracebio.com/life-science-products/microfluidics/silicone-isolators.html |
| Coplin jars and staining dishes | Electron Microscopy Sciences | select from catalog link | http://www.emsdiasum.com/microscopy/products/histology/staining.aspx |
References
- Purkinje, J. E. Symbolae ad ovi avium historiam ante incubationem. , Leopold Vossi. (1830).
- Rückert, J. E. Zur Entwickelungsgeschichte des Ovarialeies bei Selachiern. Anat. Anz. 7, 107-158 (1892).
- Callan, H. G. Lampbrush Chromosomes. 36, Springer-Verlag. (1986).
- Gall, J. G., Callan, H. G., Wu, Z., Murphy, C. Lampbrush chromosomes. Xenopus laevis: Practical Uses in Cell and Molecular Biology. Kay, B. K., Peng, H. B. Vol. 36 Methods in Cell Biology , Academic Press. 149-166 (1991).
- Gall, J. G., Wu, Z. Examining the contents of isolated Xenopus germinal vesicles. Methods. 51, 45-51 (2010).
- Penrad-Mobayed, M., Kanhoush, R., Perrin, C. Tips and tricks for preparing lampbrush chromosome spreads from Xenopus tropicalis oocytes. Methods. 51, 37-44 (2010).
- Morgan, G. T. Working with oocyte nuclei: cytological preparations of active chromatin and nuclear bodies from amphibian germinal vesicles. Methods Mol. Biol. 463, 55-66 (2008).
- Paine, P. L., Johnson, M. E., Lau, Y. T., Tluczek, L. J., Miller, D. S. The oocyte nucleus isolated in oil retains in vivo structure and functions. Biotechniques. 13, 238-246 (1992).
- Handwerger, K. E., Cordero, J. A., Gall, J. G. Cajal bodies, nucleoli, and speckles in the Xenopus oocyte nucleus have a low-density, sponge-like structure. Mol Biol Cell. 16, 202-211 (2005).
- Patel, S., Novikova, N., Beenders, B., Austin, C., Bellini, M. Live images of RNA polymerase II transcription units. Chromosome Res. 16, 223-232 (2008).
- Gall, J. G.
- Löschberger, A., et al. Super-resolution imaging visualizes the eightfold symmetry of gp210 proteins around the nuclear pore complex and resolves the central channel with nanometer resolution. J Cell Sci. 125, 570-575 (2012).
- Gottfert, F., et al. Coaligned dual-channel STED nanoscopy and molecular diffusion analysis at 20 nm resolution. Biophys J. 105, L01-L03 (2013).
- Wallace, R. A., Jared, D. W., Dumont, J. N., Sega, M. W. Protein incorporation by isolated amphibian oocytes: III. Optimum incubation conditions. J. Exp. Zool. 184, 321-333 (1973).
- Bridger, J. Fluorescence in situhybridization to DNA. Cells: A Laboratory Manual. Spector, D. L., Goldman, R. D., Leinwand, L. A. 3, Cold Spring Harbor Press. 111.111-111.136 (1998).
- Singer, R. H. In situ hybridization to RNA. Cells: A Laboratory Manual. Spector, D. L., Goldman, R. D., Leinwand, L. A. 3, Cold Spring Harbor Press. 111-116 (1998).
- Gardner, E. J., Nizami, Z. F., Talbot, C. C. Jr, Gall, J. G. Stable intronic sequence RNA (sisRNA), a new class of noncoding RNA from the oocyte nucleus of Xenopus tropicalis. Genes Dev. 26, 2550-2559 (2012).
- Talhouarne, G. J., Gall, J. G. Lariat intronic RNAs in the cytoplasm of Xenopus tropicalis oocytes. RNA. 20, 1476-1487 (2014).
- Duryee, W. R. Isolation of nuclei and non-mitotic chromosome pairs from frog eggs. Arch. Exp. Zellforsch. 19, 171-176 (1937).
