Entwicklung eines unter Schwerelosigkeits Vielzellige Dreidimensionale Organotypischen Modell des menschlichen Darmschleimhaut Grown

Summary

Zellen in einem dreidimensionalen (3-D) -Umgebung wachsenden stellen eine deutliche Verbesserung gegenüber der Zellkultivierung in 2-D – Umgebungen (beispielsweise Kolben oder Geschirr). Hier beschreiben wir die Entwicklung eines vielzelligen 3-D organotypischen Modell der menschlichen Schleimhaut Darm unter Schwerelosigkeit kultiviert, die von rotierenden Wandgefäß (RWV) Bioreaktoren.

Abstract

Da die Zellen in einem dreidimensionalen (3-D) Umwelt haben das Potenzial wachsen viele Lücken der Zellkultivierung zu überbrücken , in 2-D – Umgebungen (z. B. Flaschen oder Geschirr). In der Tat ist es allgemein anerkannt, dass in Flaschen oder Geschirr neigen gezüchtete Zellen zu dedifferenzieren und spezielle Funktionen der Gewebe verliert, aus dem sie abgeleitet wurden. Derzeit gibt es im Wesentlichen zwei Arten von 3-D-Kultursysteme, wo die Zellen in Gerüste geimpft werden die native extrazelluläre Matrix (ECM) nachahmt: Bioreaktoren (a) statische Modelle und (b) Modellen. Der erste Durchbruch war die statischen 3-D-Modelle. 3-D-Modelle Bioreaktoren wie der rotierenden Wandgefäß (RWV) Bioreaktoren sind eine neuere Entwicklung verwendet wird. Das ursprüngliche Konzept der RWV Bioreaktoren wurde am NASA Johnson Space Center in den frühen 1990er Jahren entwickelt und wird angenommen, dass die Grenzen der statischen Modelle wie die Entwicklung von hypoxischen, nekrotischen Kerne zu überwinden. Die RWV Bioreaktoren könnten umgehen thist Problem durch Bereitstellung fluid dynamics, die die effiziente Diffusion von Nährstoffen und Sauerstoff erlauben. Diese Bioreaktoren bestehen aus einem Rotator Basis, und drehen Sie zwei verschiedene Formate der Kulturgefäße zur Unterstützung dient , die durch ihre Belüftungsquellentyp unterscheiden: (1) langsames Drehen Lateral Vessels (STLVs) mit einer koaxialen Oxygenator in der Mitte, oder (2 ) Hohe Seitenverhältnis Vessels (HARVs) mit Sauerstoffversorgung über einen flachen, Silikonkautschuk Gasübertragungsmembran. Diese Gefäße ermöglichen eine effiziente Gastransfer während der Blasenbildung und damit Turbulenzen zu vermeiden. Diese Bedingungen führen zu einer laminaren Strömung und minimale Scherkraft, die Modelle der Schwerkraft (Schwerelosigkeit) reduziert im Inneren des Kulturgefäßes. Hier beschreiben wir die Entwicklung eines vielzelligen 3-D organotypischen Modell des menschlichen Darmschleimhaut besteht aus einer intestinalen Epithelzellen Zelllinie und primären humanen Lymphozyten, Endothelzellen und Fibroblasten gezüchtet unter Schwerelosigkeit durch den RWV Bioreaktor zur Verfügung gestellt. </ P>

Introduction

Der erste Durchbruch beim Aufbau eines 3-D – Modell wurde in den frühen der 1980er Jahre berichtet , als die Wissenschaftler verschiedene Arten des Gerüsts (z. B. Laminin, Kollagen Typ I, Kollagen IV und Fibronektin) und Cocktails von Wachstumsfaktoren zu untersuchen begann zu verbessern Zelle-zu-Zelle und ECM – Wechselwirkungen von "statischen" 3-D – Modelle ^1-7. Seitdem hat das Hauptproblem bei diesen Modellen Einschränkungen waren bei der Übertragung von Nährstoffen und Sauerstoff in dem Medium und Gewebekonstrukten ^8. Im Gegensatz zu den Zellen in der in vivo Umgebung , die von umgebenden Netzen von Blutgefäßen einen stetigen Fluss von Nährstoffen und Sauerstoff erhält, behindert die statische Natur dieser Modelle , um die effektive Verteilung von ihnen zu den Zellen. Zum Beispiel Zellaggregate in in – vitro – statische Modelle erzeugt , die ein paar Millimeter groß überschreiten wird unweigerlich hypoxischen, nekrotischen Kerne ⁹ entwickeln. Die RWV Bioreaktoren könnte dieses Problem zu umgehendurch fluid dynamics , vorausgesetzt die effiziente Diffusion von Nährstoffen und Sauerstoff ^10-12 ermöglichen. Doch bis heute, die Arbeit mit RWV Bioreaktoren wurden auf die Aufnahme von ein oder zwei Zelltypen ^13-17 begrenzt. Außerdem kann anstelle eines räumlichen Orientierung ähnlich zu nativem Gewebe bildeten die Zellen Zellaggregate. Der Hauptgrund für diese Einschränkung ist das Fehlen eines Gerüst Lage, Zellen in einer integrierten Weise zu integrieren. Die Gerüste in den RWV Bioreaktoren bisher verwendet werden , bestehen, mit wenigen Ausnahmen ^16-18, vor allem von synthetischen Mikrokügelchen, rohrförmigen Zylinder oder kleine Blätter ^13-15,19-23. Diese sind steife Materialien, deren Zusammensetzung und Flexibilität nicht manipuliert werden können, und an die Zellen an ihre Oberfläche gebunden. Somit ist es unwahrscheinlich , dass diese Modelle ein System , in dem bieten wird zu bewerten, in einer integrierten Weise, die verschiedenen Zellkomponenten wie Stromazellen (z. B. Fibroblasten, Immun- und Endothelzellen) , dass should im Gerüst verteilt werden, um eng menschlichem Gewebe nachahmen.

Hier beschreiben wir die Entwicklung eines mehrzelligen 3-D organotypischen Modell der menschlichen Darmschleimhaut , bestehend aus einer intestinalen epithelialen Zelllinie und primären humanen Lymphozyten, Endothelzellen und Fibroblasten ^24. Diese Zellen wurden unter Schwerelosigkeit zur Verfügung stellen von der RWV Bioreaktor ^13,25-30. Im 3-D – Modell besitzt die ECM viele verschiedene Eigenschaften, wie beispielsweise eine Osmolalität ähnlich dem Kulturmedium (z. B. vernachlässigbaren Diffusionsbeschränkungen während der Kultur) und die Fähigkeit , Zellen und anderen relevanten extrazelluläre Matrixproteine, sowie die einzuarbeiten entsprechende Steifigkeit in Bioreaktoren ²⁴ verwendet werden. Biologische Systeme sind sehr komplex, und in den letzten Jahren hat mit der Umgebung eher eine Verschiebung des Fokus von Schleimhaut Forschung in Richtung auf die Untersuchung von Zell-Wechselwirkungen war, als sie in isolatio Studiumn. Insbesondere wird die Bedeutung der Zell-Zell – Wechselwirkungen bei der Beeinflussung intestinale Zellüberlebens und der Differenzierung gut ^31-34 dokumentiert. Insbesondere weist die Verbindung zwischen Epithelzellen und ihre Nische einen profunden Einfluss auf die Epithelzelle Expansion und Differenzierung ^35. Tatsächlich ist es allgemein anerkannt, dass nicht nur die Zelle-zu-Zelle, sondern auch Zell-ECM-Wechselwirkungen sind für die Wartung und die Differenzierung von Epithelzellen in 3-D Kulturmodellen. Frühere Studien haben gezeigt, dass gut ECM – Proteine ​​wie Kollagen zeigte ich ^24,36,37, Laminin ³⁸ und Fibronektin ³⁹ instrumental sind in intestinalen Epithelzellen beeinflussen räumliche Orientierung ähnlich der nativen Schleimhaut zu erwerben. So kann die Entwicklung neuer Technologien, wie unsere 3-D – Modell ^24, dass imitieren die phänotypische Vielfalt des Darms ist erforderlich, wenn die Forscher die komplexe zelluläre und strukturelle Architektur neu zu erstellen beabsichtigenund die Funktion des Darms Mikroumgebung. Diese Modelle stellen ein wichtiges Instrument bei der Entwicklung und Evaluierung von neuen oralen Medikamenten und Impfstoff-Kandidaten.

Protocol

Ethik Aussage: Alle Blutproben wurden von Freiwilligen gesammelt , die in der Protokollnummer HP-00040025-1 teilgenommen. Die University of Maryland Institutional Review Board genehmigt dieses Protokoll und ermächtigt, die Sammlung von Blutproben von gesunden Freiwilligen für die Studien in diesem Manuskript enthalten. Der Zweck dieser Studie an Freiwilligen wurde erklärt, und alle Freiwilligen gab informiert unterzeichnete Zustimmung vor Ende der Blutentnahme. Hinweis: Siehe Tabelle 1 für mittl…

Representative Results

Bisher haben wir einen mehrzelligen 3-D organotypischen Modell des menschlichen Darmschleimhaut bestehend aus einer Darmepithel – Zelllinie und primären humanen Lymphozyten, Endothelzellen und Fibroblasten unter Schwerelosigkeit 24 (1) kultiviert entwickelt. Fibroblasten und Endothelzellen wurden in einer Kollagen – Matrix mit zusätzlichen I gut Basalmembranproteine ​​45 (dh., Laminin, Kollagen IV, Fibronectin und Heparinsulfat …

Discussion

In diesem Manuskript beschreiben wir die Entwicklung eines biotechnologisch – Modell der menschlichen Schleimhaut Darm von Multiples Zelle besteht Typen , einschließlich primären humanen Lymphozyten, Fibroblasten und Endothelzellen, sowie Darmepithel – Zelllinien ^24. In diesem 3-D – Modell werden die Zellen in einem Kollagen-reiche extrazellulären Matrix unter Schwerelosigkeit ²⁴ kultiviert.

Wie bereits beschrieben, sind die wichtigsten Merkmale dieses Modells: <stro…

Materials

Quad Rotator/Independent Rotating Wall Vessel (RWV) bioreactor	Synthecon	RCCs-4DQ	For up to 4 vessels. Models with more or less vessels are also available.
Disposable 50 ml-vessel	Synthecon	D-405	Box with 4 vessels
HCT-8 epithelial cells	ATCC	CCL-244
CCD-18Co Fibroblasts	ATCC	CRL-1459
Human Umbilical Vein Endothelial Cells	ATCC	CRL-1730	HUVEC
Fibroblast Growth Factor-Basic	Sigma	F0291	bFGF
Stem Cell Factor	Sigma	S7901	SCF
Hepatocyte Growth Factor	Sigma	H1404	HGF
Endothelin 3	Sigma	E9137
Laminin	Sigma	L2020	Isolated from mouse Engelbreth-Holm-Swarm tumor
Vascular Endothelial Growth Factor	Sigma	V7259	VEGF
Leukemia Inhibitory Factor	Santa Cruz	sc-4377	(LIF
Adenine	Sigma	A2786
Insulin	Sigma	I-6634
3,3',5-triiodo-L-thyronine	Sigma	T-6397	T3
Cholera Toxin	Sigma	C-8052
Fibronectin	BD	354008	Isolated from human plasma
apo-Transferrin	Sigma	T-1147
Heparin	Sigma	H3149
Heparan sulfate  proteoglycan	Sigma	H4777	Isolated from basement membrane of mouse  Engelbreth-Holm-Swarm tumor
Collagen IV	Sigma	C5533	Isolated from human placenta
Heat-inactivated fetal bovine serum	Invitrogen	10437-028
D-MEM, powder	Invitrogen	12800-017
10% formalin–PBS	Fisher Scientific	SF100-4
Bovine type I collagen	Invitrogen	A1064401
Trypsin-EDTA	Fisher Scientific	MT25-052-CI
Sodium pyruvate	Invitrogen	11360-070
Gentamicin	Invitrogen	15750-060
Penicillin/streptomincin	Invitrogen	15140-122
L-Glutamine	Invitrogen	25030-081
Hepes	Invitrogen	15630-080
Ham's F-12	Invitrogen	11765-054
Basal Medium Eagle	Invitrogen	21010-046	BME
RPMI-1640	Invitrogen	11875-093
Endothelial Basal Medium	Lonza	CC-3156	EBM-2
Endothelial cell growth supplement	Millipore	02-102	ECGS