인간의 장 점막의 다세포 3 차원의 Organotypic 모델의 개발은 미세 중력 하에서 성장
Summary
3 차원 (3-D) 환경에서 성장하는 세포는 2-D 환경 (예 : 플라스크 또는 종) 세포 배양에 비해 현저한 개선을 나타낸다. 여기에서 우리는 회전 벽 혈관 (RWV) 생물 반응기에서 제공하는 미세 중력에서 배양 인간의 장 점막의 다세포 3 차원의 Organotypic 모델의 개발을 설명합니다.
Abstract
3 차원 (3-D) 환경에서 성장하는 세포는 다수의 2 차원 환경에서 세포 배양 간격 (예., 플라스크 또는 요리)을 해소 할 가능성이 있기 때문이다. 사실, 널리 접시 또는 플라스크에서 배양 세포 분화 디 그들이 유래 된 조직에서의 특화된 기능을 상실하는 경향이 인정된다. (a) 정적 모델 생물을 이용하여 (b) 모델 : 현재 원시 세포 외 기질 (ECM)을 흉내 낸 세포를 지지체로 시딩 3-D 배양 시스템의 두 종류가 주로 존재한다. 제 획기적인 정적 3-D 모델이었다. 이러한 회전 벽 혈관 등의 생물을 이용하여 3-D 모델 (RWV) 생물 반응기는 더 최근의 개발이다. RWV 생물 반응기의 원래 개념은 1990 년대 초에 NASA의 존슨 우주 센터에서 개발 및 저산소, 괴사 코어의 개발로 정적 모델의 한계를 극복 할 것으로 생각된다. RWV의 생물 반응기는 일을 피할 수 있습니다영양분과 산소의 효율적인 확산을 허용 유체 역학을 제공하여 문제가된다. 이 생물 반응 장치 지원 및 폭기 소스 유형에 따라 다릅니다 문화 선박의 두 가지 형식을 회전시키는 역할을 회 전자의 기본 구성 : 공동 축 중앙에 형산, 또는 (1) 느린 켜기 측면 용기 (STLVs) (2 평평한 실리콘 고무 가스 이송 멤브레인을 통해 산소와) 높은 화면 비율 용기 (HARVs). 거품 형성과 그에 따른 혼란을 피하면서이 선박은 효율적인 가스 전송을 할 수 있습니다. 이러한 조건은 모델 배양 용기 중의 중력 (무중력)를 감소 층류 최소 전단력 초래한다. 여기서 우리는 RWV 바이오 리액터에 의해 제공된 소장 상피 세포주 및 일차 인간 림프구 무중력 하에서 배양 된 내피 세포 및 섬유 아세포 이루어지는 인간의 장 점막의 다세포 3 차원의 Organotypic 모델의 개발을 기술한다. </ P>
Introduction
과학자들은 다른 골격 유형 (예., 라미닌, 콜라겐 타입 I 콜라겐 IV 및 피브로넥틴) 및 개선하는 성장 인자의 칵테일을 조사하기 시작했을 때, 3-D 모델을 구축하는 제 침투는 1980 년대 초에보고 세포 간 및 "정적"3-D 모델 1-7의 ECM 상호 작용. 그 이후로,이 모델의 주요 문제는 매체 및 조직 구조 (8) 내에서 영양소의 전송 및 산소 제한하고있다. 혈관의 네트워크 주변에서 일정한 영양분 및 산소의 흐름을 수용하는 생체 환경에서 세포와 대조적으로,이 모델의 정적 특성은 세포로의 효과적인 분산을 방해한다. 예를 들어, 크기가 몇 mm를 초과 체외 정적 모델에서 생성 된 세포 집합체는 변함없이 저산소, 괴사 코어 (9)을 개발할 것입니다. RWV 생물 반응기는이 문제를 피할 수 있습니다영양분과 산소 10-12의 효율적인 확산을 허용 유체 역학을 제공하여. 그러나, 지금까지 RWV 생물 반응기를 사용하여 작업이 하나 또는 두 종류의 세포 13-17의 포함에 한정되었다. 또한, 대신에 기본 조직과 동일한 공간 배향, 이러한 세포는 세포 응집체를 형성했다. 이러한 제한에 대한 가장 큰 이유는 통합 된 방식으로 세포를 통합 할 수있는 발판의 부족이었다. 현재까지 RWV의 생물 반응기에 사용되는 지지체는 주로 합성 마이크로 비즈, 관 실린더 또는 작은 시트 13-15,19-23의, 몇 가지 예외를 제외하고 16 ~ 18으로 구성되어 있습니다. 이러한 조성 및 유연성 조작 할 수없고, 어떤 셀이 그 표면에 부착 된 강성 물질이다. 따라서, 이러한 모델은 통합 된 방식으로 평가하기 위해서는 시스템을 제공 할 가능성은, 다양한 세포와 같은 간질 세포와 같은 구성 요소 (예., 섬유 아세포, 내피 세포 및 면역) 즉이야hould 밀접하게 인간의 조직을 모방하는 발판 내에 분산 될 수있다.
여기서 우리는 장 상피 세포주 및 일차 인간 림프구, 내피 세포로 구성된 인간 장 점막의 다세포 3 차원의 Organotypic 모델의 개발을 기술하고, 섬유 아세포 (24). 이 세포는 미세 중력 하에서 RWV 생물 반응기 13,25-30에 의해 제공 배양 하였다. 우리의 3-D 모델에서 ECM 많은 별개 이러한 배지 유사한 삼투압 (예., 배양 중에 무시할 확산 감금) 세포 및 다른 중요한 세포 외 기질 단백질을 포함하는 능력과 같은 특성뿐만 아니라, 같은 보유 적절한 강성 생물 반응기 (24)에 사용될 수있다. 생물학적 시스템은 매우 복잡하고, 지난 몇 년간, isolatio 그들을 공부보다는 주변 환경과 세포의 상호 작용의 시험 향해 점막 연구의 초점의 변화가 있었다엔. 특히, 장 세포 생존 및 분화에 영향을 미치는 세포 – 세포 상호 작용의 중요성을 잘 31-34를 설명되어 있습니다. 구체적으로는, 상피 세포 및 그들의 틈새 사이의 통신은 상피 세포의 확장 및 분화 (35)에 큰 영향을 미친다. 실제로, 널리 사용되는 전용 세포 간뿐만 아니라, 세포 간 상호 작용 ECM 3-D 배양 모델에서 상피 세포의 유지와 분화에 중요하다. 이전의 연구는 콜라겐 I 24,36,37, 라미닌 (38) 및 피브로넥틴 (39)는 원래 점막과 유사한 공간 방향을 취득 장내 상피 세포에 영향을 미치는 수단이되기 때문에 그 직감 ECM 단백질을 증명하고있다. 연구자들은 복잡한 세포 및 구조 아키텍처를 다시하려는 경우 따라서, 새로운 기술의 개발은 우리의 3-D 모델 (24)처럼, 그 창자의 표현형의 다양성이 요구되는 모방 할 수그리고 장내 미세 환경의 기능. 이러한 모델은 새로운 경구 용 약물과 백신 후보들의 평가 및 개발에 중요한 수단을 나타낸다.
Protocol
Representative Results
Discussion
이 논문에서는 일차 인간 림프구, 섬유 모세포, 및 내피 세포뿐만 아니라 소장 상피 세포주를 포함한 24 배수 종류의 세포로 구성된 인간 장 점막의 생체 공학 모델의 개발을 기술한다. 이 3-D 모델에서 세포는 미세 중력 상태 (24)에서 콜라겐이 풍부한 세포 외 기질 내에서 배양된다.
전술 한 바와 같이,이 모델의 주요 기능은 다음과 같다 : (i) 상피 …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported, in part, by NIAID, NIH, DHHS federal research grants R01 AI036525 and U19 AI082655 (CCHI) to MBS and by NIH grant DK048373 to AF. The content is solely the responsibility of the authors and does not necessarily represent the official views of the National Institute of Allergy And Infectious Diseases or the National Institutes of Health.
Materials
| Quad Rotator/Independent Rotating Wall Vessel (RWV) bioreactor | Synthecon | RCCs-4DQ | For up to 4 vessels. Models with more or less vessels are also available. |
| Disposable 50 ml-vessel | Synthecon | D-405 | Box with 4 vessels |
| HCT-8 epithelial cells | ATCC | CCL-244 | |
| CCD-18Co Fibroblasts | ATCC | CRL-1459 | |
| Human Umbilical Vein Endothelial Cells | ATCC | CRL-1730 | HUVEC |
| Fibroblast Growth Factor-Basic | Sigma | F0291 | bFGF |
| Stem Cell Factor | Sigma | S7901 | SCF |
| Hepatocyte Growth Factor | Sigma | H1404 | HGF |
| Endothelin 3 | Sigma | E9137 | |
| Laminin | Sigma | L2020 | Isolated from mouse Engelbreth-Holm-Swarm tumor |
| Vascular Endothelial Growth Factor | Sigma | V7259 | VEGF |
| Leukemia Inhibitory Factor | Santa Cruz | sc-4377 | (LIF |
| Adenine | Sigma | A2786 | |
| Insulin | Sigma | I-6634 | |
| 3,3',5-triiodo-L-thyronine | Sigma | T-6397 | T3 |
| Cholera Toxin | Sigma | C-8052 | |
| Fibronectin | BD | 354008 | Isolated from human plasma |
| apo-Transferrin | Sigma | T-1147 | |
| Heparin | Sigma | H3149 | |
| Heparan sulfate proteoglycan | Sigma | H4777 | Isolated from basement membrane of mouse Engelbreth-Holm-Swarm tumor |
| Collagen IV | Sigma | C5533 | Isolated from human placenta |
| Heat-inactivated fetal bovine serum | Invitrogen | 10437-028 | |
| D-MEM, powder | Invitrogen | 12800-017 | |
| 10% formalin–PBS | Fisher Scientific | SF100-4 | |
| Bovine type I collagen | Invitrogen | A1064401 | |
| Trypsin-EDTA | Fisher Scientific | MT25-052-CI | |
| Sodium pyruvate | Invitrogen | 11360-070 | |
| Gentamicin | Invitrogen | 15750-060 | |
| Penicillin/streptomincin | Invitrogen | 15140-122 | |
| L-Glutamine | Invitrogen | 25030-081 | |
| Hepes | Invitrogen | 15630-080 | |
| Ham's F-12 | Invitrogen | 11765-054 | |
| Basal Medium Eagle | Invitrogen | 21010-046 | BME |
| RPMI-1640 | Invitrogen | 11875-093 | |
| Endothelial Basal Medium | Lonza | CC-3156 | EBM-2 |
| Endothelial cell growth supplement | Millipore | 02-102 | ECGS |
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