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Bioengineering

Sviluppo di un multicellulare tridimensionale Organotipica Modello della mucosa intestinale umana coltivate in microgravità

Published: July 25, 2016
doi:
10.3791/54148
, ,
1Center for Vaccine Development, Department of Pediatrics,University of Maryland School of Medicine, 2Mucosal Immunology and Biology Research Center,Massachusetts General Hospital for Children

Summary

Cellule che crescono in un ambiente tridimensionale (3-D) rappresentano un netto miglioramento rispetto coltura cellulare in ambienti 2-D (ad esempio, flaconi o piatti). Qui si descrive lo sviluppo di un modello 3-D organotipica multicellulare della mucosa intestinale umana coltivate in microgravità fornito ruotando parete dei vasi (RWV) bioreattori.

Abstract

Poiché le cellule che crescono in un ambiente tridimensionale (3-D) hanno il potenziale per colmare molte lacune di coltivazione di cellule in ambienti 2-D (ad es., Flaconi o piatti). In realtà, è ampiamente riconosciuto che le cellule coltivate in fiaschi o piatti tendono a de-differenziarsi e perdere funzioni specializzate dei tessuti da cui sono stati derivati. Attualmente, ci sono principalmente due tipi di sistemi di coltura 3-D dove le cellule vengono seminate in ponteggi che mimano la matrice nativa extracellulare (ECM): modelli (b) utilizzando bioreattori (a) modelli statici e. La prima svolta è stato il modelli statici 3-D. modelli 3-D utilizzando bioreattori come la rotazione-parete del vaso (RWV) bioreattori sono uno sviluppo più recente. Il concetto originale dei bioreattori RWV è stato sviluppato al Johnson Space Center della NASA nei primi anni 1990 e si crede di superare i limiti dei modelli statici, come lo sviluppo di ipossia, nuclei necrotiche. I bioreattori RWV potrebbero aggirare °è problema fornendo fluidodinamica che permettono la diffusione efficiente di nutrienti e ossigeno. Questi bioreattori sono costituiti da una base dei rotatori che serve a sostenere e ruotare due diversi formati di recipienti di coltura che si differenziano per il loro tipo di fonte di aerazione: (1) di tornitura lenti Vessels laterale (STLVs) con un ossigenatore coassiale al centro, o (2 ) Le navi ad alta Aspect Ratio (HARVs) con l'ossigenazione tramite un appartamento, membrana di trasferimento di gas in gomma siliconica. Questi vasi consentono il trasferimento del gas efficiente, evitando la formazione di bolle e la conseguente turbolenza. Queste condizioni determinano flusso laminare e forza di taglio minimo che i modelli di gravità ridotta (microgravità) all'interno del recipiente di coltura. Qui si descrive lo sviluppo di un modello 3-D organotipica multicellulare della mucosa intestinale umana composta di una linea intestinale cellule epiteliali e linfociti umani primari, cellule endoteliali e fibroblasti coltivati ​​in microgravità fornito dal bioreattore RWV. </ P>

Introduction

Il primo passo avanti nella costruzione di un modello 3-D è stata riportata nei primi anni del 1980, quando gli scienziati hanno iniziato a studiare i diversi tipi di ponteggio (ad es., Laminina, collagene di tipo I, collagene IV, e fibronectina) e cocktail di fattori di crescita per migliorare cellula-cellula e le interazioni ECM di modelli 3-D "statiche" 1-7. Da allora, il problema principale con questi modelli ha limitazioni nel trasferimento dei nutrienti e ossigeno all'interno del mezzo e del tessuto costrutti 8. In contrasto con le cellule per l'ambiente in vivo che riceve un flusso costante di nutrienti e ossigeno dalle reti di vasi sanguigni circostanti, la staticità di questi modelli ostacola la distribuzione effettiva di loro alle cellule. Ad esempio, aggregati di cellule generate in modelli statici in vitro che superano un paio di millimetri invariabilmente sviluppare ipossia, core necrotico 9. I bioreattori RWV potrebbero aggirare questo problemafornendo fluidodinamica che permettono la diffusione efficiente di nutrienti e ossigeno 10-12. Tuttavia, ad oggi, il lavoro utilizzando bioreattori RWV è stato limitato alla iscrizione di uno o due tipi di cellule 13-17. Inoltre, invece di un orientamento spaziale simile a tessuti nativi, quelle cellule formano aggregati cellulari. Il motivo principale di queste limitazioni è stata la mancanza di un ponteggio in grado di incorporare le cellule in modo integrato. I ponteggi utilizzati nei bioreattori RWV fino ad oggi sono costituiti, con poche eccezioni 16-18, principalmente di microsfere sintetiche, cilindri tubolari o piccoli fogli 13-15,19-23. Questi sono materiali rigidi cui composizione e flessibilità non possono essere manipolati, e che le cellule sono attaccate alla loro superficie. Pertanto, è improbabile che questi modelli fornirà un sistema in cui valutare, in modo integrato, i vari componenti cellulari come cellule stromali (ad es., Fibroblasti, cellule immunitarie e endoteliali) che should essere disperso all'interno del patibolo per imitare da vicino il tessuto umano.

Qui si descrive lo sviluppo di un modello 3-D organotipica multicellulare della mucosa intestinale umana composta di una linea intestinale cellule epiteliali e linfociti umani primari, cellule endoteliali e fibroblasti 24. Queste cellule sono state coltivate in microgravità fornire da parte del RWV bioreattore 13,25-30. Nel nostro modello 3-D, il ECM possiede molte proprietà distinte, come un'osmolalità simile al mezzo di coltura (per es., Trascurabili limitazioni diffusionali durante cultura) e la capacità di incorporare cellule e altre proteine ​​della matrice extracellulare pertinenti, nonché la adeguata rigidità da utilizzare in bioreattori 24. I sistemi biologici sono molto complessi, e nel corso degli ultimi anni, c'è stato un cambiamento nel centro di ricerca della mucosa verso l'esame delle interazioni cellulari con l'ambiente circostante, piuttosto che studiare in isolation. In particolare, l'importanza delle interazioni cellula-cellula nell'influenzare sopravvivenza cellulare intestinale e differenziazione è ben documentato 31-34. In particolare, la comunicazione tra le cellule epiteliali e la loro nicchia ha una profonda influenza sulla espansione delle cellule epiteliali e la differenziazione 35. Infatti, è ampiamente riconosciuto che non solo cellula-cellula, ma anche cellula-ECM interazioni sono fondamentali per il mantenimento e la differenziazione delle cellule epiteliali in modelli di coltura 3-D. Studi precedenti hanno dimostrato che le proteine ​​nell'intestino ECM come il collagene I 24,36,37, laminina 38 e fibronectina 39 sono strumentali per influenzare le cellule epiteliali intestinali di acquisire orientamento spaziale simile alla mucosa nativo. Pertanto, lo sviluppo di nuove tecnologie, come il nostro modello 3-D 24, che può imitare è necessaria la diversità fenotipica dell'intestino se i ricercatori intendono ricreare la complessa architettura cellulare e strutturalee funzione del microambiente intestinale. Questi modelli rappresentano uno strumento importante per lo sviluppo e la valutazione di nuovi farmaci per via orale e vaccini candidati.

Protocol

Dichiarazione etica: Tutti i campioni di sangue sono stati prelevati da volontari che hanno partecipato in numero di protocollo HP-00.040.025-1. L'Università del Maryland Institutional Review Board ha approvato questo protocollo e ha autorizzato la raccolta di campioni di sangue di volontari sani per gli studi inclusi in questo manoscritto. Lo scopo di questo studio è stato spiegato ai volontari, e tutti i volontari ha dato informato, firmato il consenso prima del prelievo di sangue. Nota: Vedere la Ta…

Representative Results

Precedentemente abbiamo progettato un modello 3-D organotipica multicellulare della mucosa intestinale umana comprendente una linea intestinale cellule epiteliali e linfociti umani primari, cellule endoteliali e fibroblasti coltivati ​​in condizioni di microgravità 24 (Figura 1). Fibroblasti e cellule endoteliali sono stati incorporati in una matrice di collagene I arricchito con proteine ​​di membrana aggiuntiva intestino seminterrato 45</…

Discussion

In questo manoscritto, descriviamo lo sviluppo di un modello bioengineered della mucosa intestinale umana composto di tipi cellulari multipli inclusi linfociti primari umani, fibroblasti e cellule endoteliali, così come le linee di cellule epiteliali intestinali 24. In questo modello 3-D, le cellule sono coltivate all'interno di una matrice extracellulare ricca di collagene in condizioni di microgravità 24.

Come descritto in precedenza, le caratteristiche principa…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

This work was supported, in part, by NIAID, NIH, DHHS federal research grants R01 AI036525 and U19 AI082655 (CCHI) to MBS and by NIH grant DK048373 to AF. The content is solely the responsibility of the authors and does not necessarily represent the official views of the National Institute of Allergy And Infectious Diseases or the National Institutes of Health.

Materials

Quad Rotator/Independent Rotating Wall Vessel (RWV) bioreactor  Synthecon RCCs-4DQ For up to 4 vessels. Models with more or less vessels are also available.
Disposable 50 ml-vessel Synthecon D-405 Box with 4 vessels
HCT-8 epithelial cells  ATCC CCL-244
CCD-18Co Fibroblasts  ATCC CRL-1459
Human Umbilical Vein Endothelial Cells ATCC CRL-1730 HUVEC
Fibroblast Growth Factor-Basic  Sigma F0291 bFGF
Stem Cell Factor  Sigma S7901 SCF
Hepatocyte Growth Factor  Sigma H1404 HGF
Endothelin 3 Sigma E9137
Laminin Sigma L2020 Isolated from mouse Engelbreth-Holm-Swarm tumor
Vascular Endothelial Growth Factor  Sigma V7259 VEGF
Leukemia Inhibitory Factor  Santa Cruz sc-4377 (LIF
Adenine Sigma A2786
Insulin Sigma I-6634
3,3',5-triiodo-L-thyronine  Sigma T-6397 T3
Cholera Toxin Sigma C-8052
Fibronectin BD 354008 Isolated from human plasma
apo-Transferrin Sigma T-1147
Heparin Sigma H3149
Heparan sulfate  proteoglycan Sigma H4777 Isolated from basement membrane of mouse  Engelbreth-Holm-Swarm tumor
Collagen IV Sigma C5533 Isolated from human placenta
Heat-inactivated fetal bovine serum  Invitrogen 10437-028
D-MEM, powder Invitrogen 12800-017
10% formalin–PBS  Fisher Scientific SF100-4
Bovine type I collagen  Invitrogen A1064401
Trypsin-EDTA  Fisher Scientific MT25-052-CI
Sodium pyruvate Invitrogen 11360-070
Gentamicin  Invitrogen 15750-060
Penicillin/streptomincin  Invitrogen 15140-122
L-Glutamine Invitrogen 25030-081
Hepes Invitrogen 15630-080
Ham's F-12 Invitrogen 11765-054
Basal Medium Eagle Invitrogen 21010-046 BME
RPMI-1640 Invitrogen 11875-093
Endothelial Basal Medium Lonza CC-3156 EBM-2
Endothelial cell growth supplement Millipore 02-102 ECGS
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Salerno-Goncalves, R., Fasano, A., Sztein, M. B. Development of a Multicellular Three-dimensional Organotypic Model of the Human Intestinal Mucosa Grown Under Microgravity. J. Vis. Exp. (113), e54148, doi:10.3791/54148 (2016).
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