JoVE Journal > Biology
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
Automatic Translation
Biology

En cellefri assay under anvendelse af<em> Xenopus laevis</em> Embryo Uddrag at studere Mekanismer for Nuclear Size forordning

Published: August 08, 2016
doi:
10.3791/54173
,
1Department of Molecular Biology,University of Wyoming

Summary

Mechanisms of cellular and intra-cellular scaling remain elusive. The use of Xenopus embryo extracts has become increasingly common to elucidate mechanisms of organelle size regulation. This method describes embryo extract preparation and a novel nuclear scaling assay through which mechanisms of nuclear size regulation can be identified.

Abstract

Et grundlæggende spørgsmål i cellebiologi er, hvordan celle- og organel størrelser er reguleret. Det har længe været erkendt, at størrelsen af ​​kernen generelt skalerer med størrelsen af ​​cellen, navnlig under embryogenese når dramatiske reduktioner i både celle og nukleart størrelser forekommer. Mekanismer for regulering nukleare størrelse er stort set ukendt, og kan være relevante for kræft, hvor ændrede nukleare størrelse er en vigtig diagnostisk og prognostisk parameter. In vivo tilgange til at identificere regulatorer nukleare størrelse kompliceres af de væsentlige og komplekse karakter af nuklear funktion. In vitro fremgangsmåde beskrevet her for at studere nuklear størrelse drager fordel af de normale reduktioner i nuklear størrelse, der opstår under Xenopus laevis udvikling. Først kerner samles i X. laevis æggeekstrakt. Derefter er disse kerner isoleret og resuspenderet i cytoplasma fra sent embryoer. Efter en 30 – 90 min inkubationsperiode nuklear overfladearealfalder med 20 – 60%, hvilket giver en nyttig analyse for at identificere cytoplasmatiske komponenter i sene stadier embryoner, der bidrager til udviklingsmæssige nukleare størrelse skalering. En stor fordel ved denne fremgangsmåde er den relative lethed, hvormed de æg og embryoner ekstrakter kan biokemisk manipuleres, hvilket tillader identifikation af hidtil ukendte proteiner og aktiviteter, der regulerer nuklear størrelse. Som en in vitro fremgangsmåde, validering af resultater i et in vivo system er vigtig, og mikroinjektion af X. laevis embryoner er yderst velegnede til disse undersøgelser.

Introduction

Størrelserne af cellulære organeller typisk skaleres med størrelsen af cellen, og dette er blevet måske bedst dokumenteret for skalering af nuklear størrelse med cellestørrelse 1-10. Dette gælder især under embryogenese og celledifferentiering, når dramatiske reduktioner i både celle og nuklear størrelse ses ofte 11,12. Endvidere ændres nuklear størrelse er en vigtig parameter i cancer diagnose og prognose 13-17. Mekanismer, der bidrager til regulering nukleare størrelse er stort set ukendt, dels på grund af kompleksiteten og væsentlige karakter af nukleare struktur og funktion. Den her beskrevne metode blev udviklet som et in vitro-assay for nuklear størrelse skalering som er modtagelig for biokemisk manipulation og belysning af mekanismer for regulering nukleare størrelse.

Xenopus laevis æg ekstrakt er et veletableret system til at rekapitulere og studere komplekse cellulære processer i en in vitro </em> Kontekst. Disse ekstrakter har afsløret nye grundlæggende oplysninger om flere cellulære processer, herunder montering og funktion af mitosespindelen, endoplasmatisk reticulum, og nucleus 18-22. En vigtig fordel til ekstraktet er, at X. laevis æg ekstrakter repræsenterer en næsten ufortyndet cytoplasma hvis sammensætning kan nemt ændres, for eksempel ved tilsætning af rekombinante proteiner eller immunodepletion. Endvidere er man i stand til at manipulere væsentlige processer ved at anvende behandlinger, der ellers ville være dødelig i en in vivo kontekst. Ændringer af æg ekstrakt procedure giver mulighed for isolering af ekstrakter fra X. laevis embryoner snarere end æg, og disse embryo ekstrakter er lige modtagelige for biokemisk manipulation 23. Under X. laevis udvikling, encellede befrugtet embryo (~ 1 mm diameter) gennemgår en serie af tolv hurtige celledelinger (punkt 1 – 8) til at generere flere tusinde 50 μm diameter og mindre celler, og nåede et udviklingsstadiet betegnet midblastula overgang (MBT) eller trin 24 til 26 august. MBT er karakteriseret ved indtræden af ​​zygotisk transkription, cellemigrering, asynkrone celledelinger, erhvervelse af gap faser, og etablering af nukleare steady-state størrelser snarere end kontinuerlig nukleare ekspansion som i før-MBT embryo. Fra scenen 4 til gastrulation (iscenesætter 10,5-12), nedsætter mængden af individuelle kerner med mere end 10-fold 11.

Her er målet at finde mekanismer, der er ansvarlige for disse reduktioner i nukleare størrelse under udviklingsmæssige progression. Den fremgangsmåde er først at samle kerner i X. laevis æg ekstrakt og at isolere de kerner fra ægget cytoplasma / ekstrakt. Disse kerner derefter resuspenderes i cytoplasma fra slutningen gastrula embryoer. Efter en inkubationsperiode, kernerne fra æggeekstrakt bliver mindre i sent stadium embryo ekstrakt. Vi ræsonnerede, at denne would være et nyttigt assay til at identificere cytoplasmatiske komponenter i sene stadier embryoner, der bidrager til udviklingsmæssige nukleare størrelse skalering. Anvendelse af dette assay, kombineret med in vivo validering, demonstrerede vi, at proteinkinase C (PKC) bidrager til udviklingsmæssige reduktioner i nuklear størrelse i X. laevis 23.

Protocol

Alle Xenopus procedurer og undersøgelser blev gennemført i overensstemmelse med NRC Guide til Pleje og anvendelse af forsøgsdyr 8. udgave. Protokoller blev godkendt af University of Wyoming Institutional Animal Care og brug Udvalg (Assurance # A-3216-01). 1. Fremstilling af X. laevis Egg Uddrag (tilpasset fra 27,28) Prime kvindelige X. laevis frøer mindst tre dage og højst to uger før ægudtagning med en enkelt 100 IE injektion af drægtig hoppe serum gonadotr…

Representative Results

Montering af Kerner i Egg Uddrag De første skridt i denne protokol er at forberede X. laevis æg ekstrakt (protokol 1), og demembranated sperm kerner (protokol 2). Disse reagenser anvendes derefter til at samle kerner de novo (protokol 3). Figur 1 viser nogle repræsentative data. Tilsætning af calcium driver meiotisk anholdt æg ekstrakt i interfase og cycloheximid holder …

Discussion

Here is presented a novel method to study mechanisms of nuclear size regulation during X. laevis development. Developmental progression is associated with dramatic changes in cell physiology, metabolism, division rates, and migration, as well as alterations in the sizes of cells and intracellular structures. These varied processes are complex and essential, so it is difficult to study just one of these aspects of development in an in vivo setting. The X. laevis embryo extract and nuclear shrink…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Members of the Levy and Gatlin labs as well as colleagues in the Department of Molecular Biology offered helpful advice and discussions. Rebecca Heald provided support in the early stages of developing this protocol. This work was supported by the NIH/NIGMS (R15GM106318) and the American Cancer Society (RSG-15-035-01-DDC).

Materials

Alexa Fluor 568 Donkey anti-mouse IgG Molecular Probes A10037
ATP disodium salt Sigma Aldrich A2383
Benzocaine Sigma Aldrich E1501
Bovine Serum Albumin Sigma Aldrich A3059
CaCl2 Sigma Aldrich C3306
Centrifuge Beckman J2-21M
Centrifuge rotor Beckman JS 13.1
chymostatin Sigma Aldrich C7268
creatine phosphate disodium Calbiochem 2380
cycloheximide Sigma Aldrich C6255
cytochalasin D Sigma Aldrich C8273
disposable wipes (kimwipes) Sigma Aldrich Z188956
L-cysteine Sigma Aldrich W326306
EGTA Sigma Aldrich E4378
Formaldehyde Sigma Aldrich F8775
Glass crystallizing dish (150×75 mm) VWR 89090-662
Glycerol Macron 5094-16
HEPES Sigma Aldrich H4034
Hoechst – bisBenzimide H 33342 trihydrochloride Sigma Aldrich B2261
HCG – Human Chorionic Gonadotropin  Prospec hor-250-c
L15 Media Sigma Aldrich L4386
leupeptin Sigma Aldrich L2884
Lysolecithin Sigma Aldrich L1381
mAb414 Abcam ab24609
MgCl2 EMD MX0045-2
MgSO4 Sigma Aldrich M9397
Maltose Sigma Aldrich M5885
NP40 BDH 56009
Paraformaldehyde Electron Microscopy Sciences 15710
Penicillin + Streptomycin Sigma Aldrich Pp0781
pepstatin Sigma Aldrich P5318
PIPES Sigma Aldrich P6757
Plastic paraffin film (parafilm) Sigma Aldrich P7793
KCl Sigma Aldrich P9541
KH2PO4 Mallinckrodt 70100
KOH Baker 5 3140
PMSG – Pregnant Mare Serum Gonadotropin Prospec hor-272-a
NaCl Sigma Aldrich S3014
NaHCO3 Fisher BP328
NaHPO4 EMD SX0720-1
NaOH EMD SX0590
Pestle Thomas Scientific 3411D56
Round bottom glass tubes, 15 ml Corex 8441
Secondary antibody (Alexa Fluor 568 donkey anti-mouse IgG) ThermoFisher A10037
sucrose Calbiochem 8550
thermal cycler Bio-Rad T100
Ultracentrifuge Beckman L8-80M
Ultracentrifuge rotor Beckman SW 50.1
Vectashield (anti-fade mounting medium) Vector H-1000
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Conklin, E. Cell size and nuclear size. J. Exp. Embryol. 12, 1-98 (1912).
  2. Wilson, E. B. . The Cell in Development and Heredity. , 727-733 (1925).
  3. Levy, D. L., Heald, R. Nuclear size is regulated by importin alpha and Ntf2 in Xenopus. Cell. 143 (2), 288-298 (2010).
  4. Chan, Y. H., Marshall, W. F. Scaling properties of cell and organelle size. Organogenesis. 6 (2), 88-96 (2010).
  5. Walters, A. D., Bommakanti, A., Cohen-Fix, O. Shaping the nucleus: Factors and forces. J Cell Biochem. 113 (9), 2813-2821 (2012).
  6. Webster, M., Witkin, K. L., Cohen-Fix, O. Sizing up the nucleus: nuclear shape, size and nuclear-envelope assembly. J Cell Sci. 122 (Pt 10), 1477-1486 (2009).
  7. Edens, L. J., White, K. H., Jevtic, P., Li, X., Levy, D. L. Nuclear size regulation: from single cells to development and disease. Trends Cell Biol. 23 (4), 151-159 (2013).
  8. Jevtic, P., Edens, L. J., Vukovic, L. D., Levy, D. L. Sizing and shaping the nucleus: mechanisms and significance. Curr Opin Cell Biol. 28, 16-27 (2014).
  9. Levy, D. L., Heald, R. Mechanisms of intracellular scaling. Annu Rev Cell Dev Biol. 28, 113-135 (2012).
  10. Vukovic, L. D., Jevtic, P., Edens, L. J., Levy, D. L. New insights into the mechanisms and functions of nuclear size regulation. Int Rev Cell Mol Biol. 322, 1-59 (2016).
  11. Jevtic, P., Levy, D. L. Nuclear size scaling during Xenopus early development contributes to midblastula transition timing. Curr Biol. 25 (1), 45-52 (2015).
  12. Hara, Y., Iwabuchi, M., Ohsumi, K., Kimura, A. Intranuclear DNA density affects chromosome condensation in metazoans. Mol Biol Cell. 24 (15), 2442-2453 (2013).
  13. Zink, D., Fischer, A. H., Nickerson, J. A. Nuclear structure in cancer cells. Nat Rev Cancer. 4 (9), 677-687 (2004).
  14. Jevtic, P., Levy, D. L. Mechanisms of nuclear size regulation in model systems and cancer. Adv Exp Med Biol. 773, 537-569 (2014).
  15. Chow, K. H., Factor, R. E., Ullman, K. S. The nuclear envelope environment and its cancer connections. Nat Rev Cancer. 12 (3), 196-209 (2012).
  16. Blom, J. H., Ten Kate, F. J., Schroeder, F. H., van der Heul, R. O. Morphometrically estimated variation in nuclear size. A useful tool in grading prostatic cancer. Urol Res. 18 (2), 93-99 (1990).
  17. Dey, P. Cancer nucleus: morphology and beyond. Diagn Cytopathol. 38 (5), 382-390 (2010).
  18. Cross, M. K., Powers, M. A. Learning about cancer from frogs: analysis of mitotic spindles in Xenopus egg extracts. Dis Model Mech. 2 (11-12), 541-547 (2009).
  19. Voeltz, G. K., Prinz, W. A., Shibata, Y., Rist, J. M., Rapoport, T. A. A class of membrane proteins shaping the tubular endoplasmic reticulum. Cell. 124 (3), 573-586 (2006).
  20. Chan, R. C., Forbes, D. I. In vitro study of nuclear assembly and nuclear import using Xenopus egg extracts. Methods Mol Biol. 322, 289-300 (2006).
  21. Edens, L. J., Levy, D. L., Kloc, M., Kubiak, J. Z. . Xenopus Development. , 325-345 (2014).
  22. Levy, D. L., Heald, R. Biological Scaling Problems and Solutions in Amphibians. Cold Spring Harb Perspect Biol. 8 (1), a019166 (2016).
  23. Edens, L. J., Levy, D. L. cPKC regulates interphase nuclear size during Xenopus development. J Cell Biol. 206 (4), 473-483 (2014).
  24. Nieuwkoop, P. D., Faber, J. . Normal Table of Xenopus laevis (Daudin). , (1967).
  25. Newport, J., Kirschner, M. A major developmental transition in early Xenopus embryos: II. Control of the onset of transcription. Cell. 30 (3), 687-696 (1982).
  26. Newport, J., Kirschner, M. A major developmental transition in early Xenopus embryos: I. characterization and timing of cellular changes at the midblastula stage. Cell. 30 (3), 675-686 (1982).
  27. Maresca, T. J., Heald, R. Methods for studying spindle assembly and chromosome condensation in Xenopus egg extracts. Methods Mol Biol. 322, 459-474 (2006).
  28. Hannak, E., Heald, R. Investigating mitotic spindle assembly and function in vitro using Xenopus laevis egg extracts. Nat Protoc. 1 (5), 2305-2314 (2006).
  29. Murray, A. W. Cell cycle extracts. Methods Cell Biol. 36, 581-605 (1991).
  30. Khan, M. A., et al. Quantitative alterations in nuclear structure predict prostate carcinoma distant metastasis and death in men with biochemical recurrence after radical prostatectomy. Cancer. 98 (12), 2583-2591 (2003).
  31. Tan, P. H., Goh, B. B., Chiang, G., Bay, B. H. Correlation of nuclear morphometry with pathologic parameters in ductal carcinoma in situ of the breast. Mod Pathol. 14 (10), 937-941 (2001).
  32. Zeimet, A. G., et al. DNA ploidy, nuclear size, proliferation index and DNA-hypomethylation in ovarian cancer. Gynecol Oncol. 121 (1), 24-31 (2011).
  33. Theerthagiri, G., Eisenhardt, N., Schwarz, H., Antonin, W. The nucleoporin Nup188 controls passage of membrane proteins across the nuclear pore complex. J Cell Biol. 189 (7), 1129-1142 (2010).
  34. Wuhr, M., et al. Evidence for an upper limit to mitotic spindle length. Curr Biol. 18 (16), 1256-1261 (2008).
  35. Loughlin, R., Wilbur, J. D., McNally, F. J., Nedelec, F. J., Heald, R. Katanin contributes to interspecies spindle length scaling in Xenopus. Cell. 147 (6), 1397-1407 (2011).
  36. Wilbur, J. D., Heald, R. Mitotic spindle scaling during Xenopus development by kif2a and importin. eLife. 2, e00290 (2013).
  37. Kieserman, E. K., Heald, R. Mitotic chromosome size scaling in Xenopus. Cell Cycle. 10 (22), 3863-3870 (2011).
  38. Maresca, T. J., Freedman, B. S., Heald, R. Histone H1 is essential for mitotic chromosome architecture and segregation in Xenopus laevis egg extracts. J Cell Biol. 169 (6), 859-869 (2005).
  39. MacCallum, D. E., Losada, A., Kobayashi, R., Hirano, T. ISWI remodeling complexes in Xenopus egg extracts: identification as major chromosomal components that are regulated by INCENP-aurora B. Mol Biol Cell. 13 (1), 25-39 (2002).
  40. Goehring, N. W., Hyman, A. A. Organelle growth control through limiting pools of cytoplasmic components. Curr Biol. 22 (9), R330-R339 (2012).
  41. Du Toit, A. Development: Honey, I shrunk the nucleus. Nat Rev Mol Cell Biol. 15 (10), 633 (2014).
  42. Buchner, K. The role of protein kinase C in the regulation of cell growth and in signalling to the cell nucleus. J Cancer Res Clin Oncol. 126 (1), 1-11 (2000).
  43. Mochly-Rosen, D., Das, K., Grimes, K. V. Protein kinase C, an elusive therapeutic target. Nat Rev Drug Discov. 11 (12), 937-957 (2012).

Tags

Xenopus LaevisCell-free AssayNuclear Size RegulationEmbryo ExtractsSperm DemembranationEgg FertilizationDejellyingEmbryo Staging
check_url/54173?article_type=t

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Edens, L. J., Levy, D. L. A Cell-Free Assay Using Xenopus laevis Embryo Extracts to Study Mechanisms of Nuclear Size Regulation. J. Vis. Exp. (114), e54173, doi:10.3791/54173 (2016).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image