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Biology

用いた無細胞アッセイ<em>アフリカツメガエル</em>胚は、核サイズの規制のメカニズムを研究するために抽出します

Published: August 08, 2016
doi:
10.3791/54173
,
1Department of Molecular Biology,University of Wyoming

Summary

Mechanisms of cellular and intra-cellular scaling remain elusive. The use of Xenopus embryo extracts has become increasingly common to elucidate mechanisms of organelle size regulation. This method describes embryo extract preparation and a novel nuclear scaling assay through which mechanisms of nuclear size regulation can be identified.

Abstract

細胞生物学の根本的な疑問は、細胞や細胞小器官のサイズが規制されている方法です。長い細胞や核のサイズの両方の劇的な削減が発生したときに、核の大きさは、一般的に胚形成の間、特に、セルの大きさに比例することが認められています。核のサイズ調節のメカニズムは不明な点が多いと変更された核の大きさがキー診断および予後のパラメータである癌に関連する可能性がある。 インビボ核サイズ調節因子が核機能の本質的かつ複雑な性質によって複雑されている識別に近づきます。核のサイズ制御を研究するためにここに記載のin vitroアプローチは、 アフリカツメガエルの開発中に発生する核の大きさが通常の減少を利用しています。まず、核はXに組み立てられます卵抽出物をアフリカツメガエル 。そして、これらの核は、後期胚から単離され、細胞質中に再懸濁します。 90分のインキュベーション期間、核の表面積 – 30後発達核のサイズスケーリングに貢献後期胚に存在する細胞質成分を識別するために有用なアッセイを提供し、60％ – 20によって減少します。このアプローチの主な利点は、卵や胚抽出物は、生化学的に核の大きさを調節する新規タンパク質や活動の同定を可能にする、操作することが可能な相対的な施設です。任意のインビトロのアプローチと同様に、in vivo系での結果の検証が重要であり、Xのマイクロインジェクションツメガエル胚は、これらの研究のために特に適しています。

Introduction

細胞小器官の大きさは、典型的には、細胞の大きさに比例し、これはおそらく最高のセルサイズ1-10との核の大きさのスケーリングのために文書化されています。これは、細胞と核の大きさの両方の劇的な減少は、多くの場合、11,12を観察している胚形成および細胞分化、中に特に当てはまります。また、変更された核の大きさは、癌の診断および予後13-17で重要なパラメータです。核のサイズの調節に寄与メカニズムは複雑さに起因する部分と核構造と機能の本質的な性質で、不明な点が多いです。ここで説明する方法は、生化学的操作および核のサイズ調節のメカニズムの解明に適している核のサイズスケーリングのためのin vitroアッセイとして開発されました。

アフリカツメガエルの卵抽出物は、in vitroでの複雑な細胞過程を再現し、研究するために十分に確立されたシステムであり、 </em>コンテキスト。これらの抽出物は、アセンブリおよび紡錘体、小胞体の機能、および核18-22を含むいくつかの細胞プロセスに関する新たな基本的な情報を明らかにしました。抽出システムへの重要な利点の1つは、Xです。ツメガエル卵抽出物は、その組成が容易に組換えタンパク質または免疫除去の添加によって、例えば、変更することができ、ほぼ未希釈の細胞質を表します。また、一方がさもなければインビボの状況において致死的であるかもしれない治療を使用することによって本質的なプロセスを操作することができます。卵抽出物手順の変更は、Xからの抽出物の単離を可能にツメガエル胚ではなく、卵、およびこれらの胚抽出物は、生化学的な操作23にも同様に適しています。 X.中に数千50μを生成する-開発をアフリカツメガエル 、単細胞受精胚（〜1ミリメートルの直径）は12急速な細胞分裂（8ステージ1）のシリーズを受けますメートルの直径と発達段階に到達したより小さな細胞は、中期胞胚変移（MBT）またはステージ8 24-26と呼ばれます。 MBTは接合体、転写、細胞遊走、非同期細胞分裂、ギャップ相の取得、および核定常状態のサイズではなく、事前MBT胚のように継続的な原子力拡大の設立の発症によって特徴付けられます。ステージ4から原腸形成（段階10.5から12）に、個々の核の体積が10倍以上11により減少します。

ここでは、目標は、発達の進行の間の核の大きさで、これらの削減のための責任のメカニズムを識別することです。アプローチは、最初のXで核を組み立てることです卵抽出物をアフリカツメガエル卵細胞質/抽出物から、それらの核を単離すること。これらの核は、その後、後期原腸段階の胚から細胞質中に再懸濁されています。インキュベーション期間後、卵抽出物からの核は後期胚抽出物中より小さくなります。我々は、このwoulと推論しました発達核のサイズスケーリングに貢献後期胚に存在する細胞質成分を同定するために有用なアッセイをd。 インビボでの検証と結合し、このアッセイを用いて、我々は、プロテインキナーゼC（PKC）は、Xの核の大きさの発達削減に寄与することが実証され23を アフリカツメガエル 。

Protocol

すべてのアフリカツメガエルの手順と研究は実験動物第8版の管理と使用に関するNRCガイドに準拠して実施しました。プロトコルは、ワイオミング州制度動物実験委員会（保証＃のA-3216から01まで）の大学によって承認されました。 X.の調製（27,28から適応） ツメガエルの卵抽出物プライム女性のX.ツメガエルは、妊馬血清ゴナドトロピン（PMSG）?…

Representative Results

卵抽出物中の核の組立 このプロトコルの最初のステップは、Xを準備していますツメガエルの卵抽出物（プロトコル1）および脱膜化精子核（プロトコル2）。これらの試薬 ​​は、その後、核デノボ （プロトコル3）を構築するために使用されている。1は、いくつかの</s…

Discussion

Here is presented a novel method to study mechanisms of nuclear size regulation during X. laevis development. Developmental progression is associated with dramatic changes in cell physiology, metabolism, division rates, and migration, as well as alterations in the sizes of cells and intracellular structures. These varied processes are complex and essential, so it is difficult to study just one of these aspects of development in an in vivo setting. The X. laevis embryo extract and nuclear shrink…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Members of the Levy and Gatlin labs as well as colleagues in the Department of Molecular Biology offered helpful advice and discussions. Rebecca Heald provided support in the early stages of developing this protocol. This work was supported by the NIH/NIGMS (R15GM106318) and the American Cancer Society (RSG-15-035-01-DDC).

Materials

Alexa Fluor 568 Donkey anti-mouse IgG Molecular Probes A10037
ATP disodium salt Sigma Aldrich A2383
Benzocaine Sigma Aldrich E1501
Bovine Serum Albumin Sigma Aldrich A3059
CaCl2 Sigma Aldrich C3306
Centrifuge Beckman J2-21M
Centrifuge rotor Beckman JS 13.1
chymostatin Sigma Aldrich C7268
creatine phosphate disodium Calbiochem 2380
cycloheximide Sigma Aldrich C6255
cytochalasin D Sigma Aldrich C8273
disposable wipes (kimwipes) Sigma Aldrich Z188956
L-cysteine Sigma Aldrich W326306
EGTA Sigma Aldrich E4378
Formaldehyde Sigma Aldrich F8775
Glass crystallizing dish (150×75 mm) VWR 89090-662
Glycerol Macron 5094-16
HEPES Sigma Aldrich H4034
Hoechst – bisBenzimide H 33342 trihydrochloride Sigma Aldrich B2261
HCG – Human Chorionic Gonadotropin  Prospec hor-250-c
L15 Media Sigma Aldrich L4386
leupeptin Sigma Aldrich L2884
Lysolecithin Sigma Aldrich L1381
mAb414 Abcam ab24609
MgCl2 EMD MX0045-2
MgSO4 Sigma Aldrich M9397
Maltose Sigma Aldrich M5885
NP40 BDH 56009
Paraformaldehyde Electron Microscopy Sciences 15710
Penicillin + Streptomycin Sigma Aldrich Pp0781
pepstatin Sigma Aldrich P5318
PIPES Sigma Aldrich P6757
Plastic paraffin film (parafilm) Sigma Aldrich P7793
KCl Sigma Aldrich P9541
KH2PO4 Mallinckrodt 70100
KOH Baker 5 3140
PMSG – Pregnant Mare Serum Gonadotropin Prospec hor-272-a
NaCl Sigma Aldrich S3014
NaHCO3 Fisher BP328
NaHPO4 EMD SX0720-1
NaOH EMD SX0590
Pestle Thomas Scientific 3411D56
Round bottom glass tubes, 15 ml Corex 8441
Secondary antibody (Alexa Fluor 568 donkey anti-mouse IgG) ThermoFisher A10037
sucrose Calbiochem 8550
thermal cycler Bio-Rad T100
Ultracentrifuge Beckman L8-80M
Ultracentrifuge rotor Beckman SW 50.1
Vectashield (anti-fade mounting medium) Vector H-1000
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References

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Edens, L. J., Levy, D. L. A Cell-Free Assay Using Xenopus laevis Embryo Extracts to Study Mechanisms of Nuclear Size Regulation. J. Vis. Exp. (114), e54173, doi:10.3791/54173 (2016).
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