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Biology

사용하여 셀 - 무료 분석<em> Xenopus의의 laevis의</em> 배아 핵 크기 규제의 메커니즘을 연구하기 위해 추출

Published: August 08, 2016
doi:
10.3791/54173
,
1Department of Molecular Biology,University of Wyoming

Summary

Mechanisms of cellular and intra-cellular scaling remain elusive. The use of Xenopus embryo extracts has become increasingly common to elucidate mechanisms of organelle size regulation. This method describes embryo extract preparation and a novel nuclear scaling assay through which mechanisms of nuclear size regulation can be identified.

Abstract

세포 생물학의 근본적인 문제는 세포와 세포 기관 크기는 조절하는 방법이다. 긴 두 셀에서 극적인 감소 핵 크기가 발생할 때 핵의 크기는 일반적으로 특히 배아 발생 동안, 셀의 크기로 스케일링하는 것이 인정되었다. 핵 크기 조절의 메커니즘은 크게 알려지지 및 변경된 핵 크기가 중요한 진단 및 예후 매개 변수입니다 암과 관련이있을 수 있습니다. 생체 내 핵 함수의 필수적인 복잡한 자연 복잡 핵 크기 조절기를 식별에 접근한다. 핵 크기 조절을 연구하기 위해 여기에 설명 된 체외 방법은 Xenopus의의 laevis의 개발 과정에서 발생하는 핵의 크기가 정상 감소 활용합니다. 우선 핵 X. 조립했다 계란 추출물 laevis의. 그런 다음,이 핵을 분리 후기 배아에서 세포질에 재현 탁하고 있습니다. 90 분 잠복기, 핵 표면적 – 30 후발달 핵 크기 스케일링 기여 후기 배아 세포질에 존재하는 구성 요소를 식별하는 데 유용한 분석법을 제공하고, 60 % – 20에 의해 감소​​한다. 이 방식의 가장 큰 장점은 계란 배아 추출물 생화학 핵 크기를 조절하는 신규 한 단백질 활동을 식별 할 수 있도록 조작 할 수있는 상대 설비이다. 체외 접근 방식에 어떤과 마찬가지로, 생체 시스템의 결과의 검증은 중요하고, X의 미세 주입 laevis의 배아는 이러한 연구에 특히 적합하다.

Introduction

세포 소기관의 크기는 통상적으로 전지의 크기 스케일링, 이는 아마도 최상의 셀 크기 1-10 핵 크기의 스케일링을 위해 설명되었다. 이것은 세포 및 핵의 크기 모두에서 극적인 감소는 종종 11, 12을 관찰 배아 및 세포 분화, 중 특히 그러하다. 또한, 변경 핵 크기는 암 진단 및 예후 13-17에서 중요한 파라미터이다. 핵의 크기 조절에 기여하는 메커니즘은 복잡 핵 구조와 기능의 본질에 부분적 대부분 알려져 있지 않다. 여기에 기재된 방법은 조작 및 생화학 핵 크기 조절 메커니즘의 해명에 의무가 핵 크기 스케일링을위한 시험 관내 분석으로 개발되었다.

Xenopus의 laevis의 달걀 추출물은 시험 관내에서 복잡한 세포 과정을 요점을 되풀이하고 공부 잘 설립 시스템 </em> 컨텍스트. 이 추출물은 조립 및 유사 분열 스핀들, 소포체의 기능 및 핵 18-22 포함한 여러 세포 프로세스에 대한 새로운 기본 정보를 공개했다. 추출 시스템에 하나의 중요한 장점은 X.이다 laevis의 달걀 추출물 조성 쉽게 재조합 단백질 또는 immunodepletion의 추가를 통해 예를 들어, 변경할 수 있습니다 거의 희석 세포질을 나타냅니다. 또 하나는 달리 생체 내 상황에서 치명적일 수있는 치료법을 이용하여 필수 과정을 조작 할 수있다. 계란 추출물 절차의 수정은 X. 추출물의 분리를 허용 laevis의 배아가 아닌 계란,이 배아 추출물 생화학 적 조작 (23)에 동일하게 의무가 있습니다. X. 중 개발 laevis의 단일 셀 수정 된 배아 (~ 1mm 직경) (1 단계 – 8) 열두 빠른 세포 분열의 시리즈를 거쳐 생성하는 수천 50 μm의 직경 및 발달 단계에 도달하는 작은 셀은 midblastula 전이 (MBT) 나 스테이지 (8) 24-26 불린다. MBT가 접합체 전사, 세포 이동, 비동기 세포 분열 갭 위상 취득 및 핵 정상 크기보다는 사전 MBT 배아 같이 계속 핵 확장 확립의 발병을 특징으로한다. 개별 핵의 부피는 10 개 이상의 배 (11)에 의해 감소 – 낭 배기에 4 단계에서 (12 10.5 스테이지).

여기서, 목표는 개발 진행 중에 핵 크기의 이러한 감소에 대한 책임 메커니즘을 식별하는 것이다. 접근법은 제 X.에서 핵을 조립하는 계란 추출물을 laevis의와 난자 세포질 / 추출물에서 그 핵을 분리 할 수 있습니다. 이 핵은 다음 말 낭배 단계의 배아에서 세포질에 재현 탁하고 있습니다. 잠복기 후, 계란 추출물의 핵 후기 배아 추출물 작아진다. 우리는이 woul 것을 권유발달 핵 크기의 확장에 기여 후기 배아에 존재하는 세포질 구성 요소를 식별하기위한 유용한 분석이 될 거라고. 생체 검증과 함께이 분석을 사용하여, 우리는 단백질 키나제 C (PKC)는 X에서 핵의 크기 발달 감소에 기여하고 있음을 입증 23 laevis의.

Protocol

모든 Xenopus의 절차와 연구는 실험 동물 8 판의 관리 및 사용에 대한 NRC 가이드를 준수 실시 하였다. 프로토콜은 와이오밍 기관 동물 관리 및 사용위원회 (보증 번호의 A-3216-01)의 대학에 의해 승인되었다. X의 1. 준비 (27, 28에서 적응) laevis의 달걀 추출 프라임 여성 X. laevis의는 3 일 최소 임신 암말 혈청 성선 자극 호르몬 (PMSG)의 단일 100 IU 주입 계란 컬?…

Representative Results

계란 추출물의 핵의 조립 이 프로토콜의 첫 번째 단계는 X를 준비한다 laevis의 달걀 추출물 (프로토콜 1) demembranated 정자 핵 (프로토콜 2). 이 시약은 핵 드 노보 (프로토콜 3)를 조립하는 데 사용됩니다. (1) 일부 대표 데이터를 보여줍니다. 칼슘 첨가 계면에 meiotically 체?…

Discussion

Here is presented a novel method to study mechanisms of nuclear size regulation during X. laevis development. Developmental progression is associated with dramatic changes in cell physiology, metabolism, division rates, and migration, as well as alterations in the sizes of cells and intracellular structures. These varied processes are complex and essential, so it is difficult to study just one of these aspects of development in an in vivo setting. The X. laevis embryo extract and nuclear shrink…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Members of the Levy and Gatlin labs as well as colleagues in the Department of Molecular Biology offered helpful advice and discussions. Rebecca Heald provided support in the early stages of developing this protocol. This work was supported by the NIH/NIGMS (R15GM106318) and the American Cancer Society (RSG-15-035-01-DDC).

Materials

Alexa Fluor 568 Donkey anti-mouse IgG Molecular Probes A10037
ATP disodium salt Sigma Aldrich A2383
Benzocaine Sigma Aldrich E1501
Bovine Serum Albumin Sigma Aldrich A3059
CaCl2 Sigma Aldrich C3306
Centrifuge Beckman J2-21M
Centrifuge rotor Beckman JS 13.1
chymostatin Sigma Aldrich C7268
creatine phosphate disodium Calbiochem 2380
cycloheximide Sigma Aldrich C6255
cytochalasin D Sigma Aldrich C8273
disposable wipes (kimwipes) Sigma Aldrich Z188956
L-cysteine Sigma Aldrich W326306
EGTA Sigma Aldrich E4378
Formaldehyde Sigma Aldrich F8775
Glass crystallizing dish (150×75 mm) VWR 89090-662
Glycerol Macron 5094-16
HEPES Sigma Aldrich H4034
Hoechst – bisBenzimide H 33342 trihydrochloride Sigma Aldrich B2261
HCG – Human Chorionic Gonadotropin  Prospec hor-250-c
L15 Media Sigma Aldrich L4386
leupeptin Sigma Aldrich L2884
Lysolecithin Sigma Aldrich L1381
mAb414 Abcam ab24609
MgCl2 EMD MX0045-2
MgSO4 Sigma Aldrich M9397
Maltose Sigma Aldrich M5885
NP40 BDH 56009
Paraformaldehyde Electron Microscopy Sciences 15710
Penicillin + Streptomycin Sigma Aldrich Pp0781
pepstatin Sigma Aldrich P5318
PIPES Sigma Aldrich P6757
Plastic paraffin film (parafilm) Sigma Aldrich P7793
KCl Sigma Aldrich P9541
KH2PO4 Mallinckrodt 70100
KOH Baker 5 3140
PMSG – Pregnant Mare Serum Gonadotropin Prospec hor-272-a
NaCl Sigma Aldrich S3014
NaHCO3 Fisher BP328
NaHPO4 EMD SX0720-1
NaOH EMD SX0590
Pestle Thomas Scientific 3411D56
Round bottom glass tubes, 15 ml Corex 8441
Secondary antibody (Alexa Fluor 568 donkey anti-mouse IgG) ThermoFisher A10037
sucrose Calbiochem 8550
thermal cycler Bio-Rad T100
Ultracentrifuge Beckman L8-80M
Ultracentrifuge rotor Beckman SW 50.1
Vectashield (anti-fade mounting medium) Vector H-1000
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References

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Edens, L. J., Levy, D. L. A Cell-Free Assay Using Xenopus laevis Embryo Extracts to Study Mechanisms of Nuclear Size Regulation. J. Vis. Exp. (114), e54173, doi:10.3791/54173 (2016).
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