Un ensayo libre de células Utilizando<em> Xenopus laevis</em> Embrión Extrae para estudiar los mecanismos de regulación del tamaño nuclear
Summary
Mechanisms of cellular and intra-cellular scaling remain elusive. The use of Xenopus embryo extracts has become increasingly common to elucidate mechanisms of organelle size regulation. This method describes embryo extract preparation and a novel nuclear scaling assay through which mechanisms of nuclear size regulation can be identified.
Abstract
Una pregunta fundamental en biología celular es cómo se regulan los tamaños de células y orgánulos. Durante mucho tiempo se ha reconocido que el tamaño del núcleo escalas generalmente con el tamaño de la celda, en particular durante la embriogénesis cuando se producen reducciones dramáticas en tanto celular y tamaños nucleares. Mecanismos de regulación del tamaño nuclear son en gran parte desconocida y puede ser relevante para el cáncer, donde el tamaño nuclear alterada es un parámetro clave de diagnóstico y pronóstico. En vivo para la identificación de los reguladores nucleares de tamaño se complica por la naturaleza esencial y compleja de la función nuclear. El enfoque in vitro descrito aquí para estudiar el control del tamaño nuclear se aprovecha de las reducciones normales en tamaño nuclear que se producen durante el desarrollo de Xenopus laevis. En primer lugar, los núcleos se ensamblan en X. laevis extracto de huevo. A continuación, estos núcleos se aíslan y se resuspendieron en el citoplasma de embriones de etapa tardía. Después de un 30 – 90 min período de incubación, la superficie nucleardisminuye en 20 a 60%, proporcionando un ensayo útil para identificar los componentes citoplasmáticos presentes en embriones de etapa tardía que contribuyen al desarrollo de escala tamaño nuclear. Una ventaja importante de este enfoque es la facilidad relativa con la que los extractos de huevo y embrión puede ser bioquímicamente manipulados, lo que permite la identificación de nuevas proteínas y actividades que regulan el tamaño nuclear. Como con cualquier enfoque en vitro, la validación de los resultados en un sistema in vivo es importante, y la microinyección de X. laevis embriones es particularmente apropiado para estos estudios.
Introduction
Los tamaños de los orgánulos celulares típicamente escala con el tamaño de la célula, y esto ha sido quizás mejor documentado para el escalado de tamaño nuclear con tamaño de celda 1-10. Esto es particularmente cierto durante la embriogénesis y la diferenciación celular, cuando reducciones dramáticas en tanto celular y tamaño nuclear se observan a menudo 11,12. Además, alterado tamaño nuclear es un parámetro clave en el diagnóstico de cáncer y el pronóstico 13-17. Mecanismos que contribuyen a la regulación del tamaño nuclear son en gran parte desconocidos, en parte debido a la complejidad y la naturaleza esencial de la estructura y la función nuclear. El método aquí descrito se desarrolló como un ensayo in vitro para la escala del tamaño nuclear que es susceptible a la manipulación bioquímica y la elucidación de los mecanismos de regulación del tamaño nuclear.
Xenopus laevis extracto de huevo es un sistema bien establecido para recapitular y estudiar procesos celulares complejos en un in vitro </em> Contexto. Estos extractos han revelado nueva información fundamental acerca de varios procesos celulares, incluyendo el montaje y la función del huso mitótico, retículo endoplasmático, y el núcleo 18-22. Una ventaja clave del sistema es que el extracto de X. extractos de huevo laevis representan un citoplasma casi sin diluir cuya composición puede ser alterado fácilmente, por ejemplo mediante la adición de proteínas o immunodepletion recombinantes. Además, uno es capaz de manipular los procesos esenciales mediante el empleo de tratamientos que de otro modo podrían ser letales en un contexto in vivo. Las modificaciones del procedimiento de extracto de huevo permiten para el aislamiento de extractos de X. laevis embriones en lugar de huevos, y estos extractos de embriones son igualmente susceptibles de manipulación bioquímica 23. Durante X. laevis desarrollo, el embrión fertilizado de una sola célula (~ 1 mm de diámetro) se somete a una serie de doce divisiones celulares rápidas (etapas 1-8) para generar varios miles de 50 μm de diámetro y células más pequeñas, llegando a una etapa de desarrollo denominan la transición midblastula (MBT) o 24-26 de la etapa 8. El MBT se caracteriza por el inicio de la transcripción cigóticos, la migración celular, divisiones celulares asíncronos, la adquisición de fases Gap, y el establecimiento de tamaños de estado estable nucleares en lugar de la expansión nuclear continua como en el embrión de pre-MBT. Desde la etapa 4 a la gastrulación (etapas 10,5-12), el volumen de los núcleos individuales se reduce en más de 10 veces 11.
Aquí, el objetivo es identificar los mecanismos responsables de estas reducciones en el tamaño nuclear durante la progresión del desarrollo. El enfoque es montar primero núcleos en X. laevis huevo y el extracto de aislar esos núcleos desde el citoplasma del huevo / extracto. Estos núcleos se resuspendieron a continuación en el citoplasma de embriones en estadio de gástrula tardía. Después de un período de incubación, los núcleos de extracto de huevo se hacen más pequeños a finales de extracto de la etapa embrionaria. Pensamos que este would ser un ensayo útil para la identificación de los componentes citoplasmáticos presentes en los embriones en etapas avanzadas que contribuyen al desarrollo de escala del tamaño nuclear. Utilizando este ensayo, junto con la validación in vivo, hemos demostrado que la proteína quinasa C (PKC) contribuye a la reducción del desarrollo en el tamaño nuclear en X. laevis 23.
Protocol
Representative Results
Discussion
Here is presented a novel method to study mechanisms of nuclear size regulation during X. laevis development. Developmental progression is associated with dramatic changes in cell physiology, metabolism, division rates, and migration, as well as alterations in the sizes of cells and intracellular structures. These varied processes are complex and essential, so it is difficult to study just one of these aspects of development in an in vivo setting. The X. laevis embryo extract and nuclear shrink…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Members of the Levy and Gatlin labs as well as colleagues in the Department of Molecular Biology offered helpful advice and discussions. Rebecca Heald provided support in the early stages of developing this protocol. This work was supported by the NIH/NIGMS (R15GM106318) and the American Cancer Society (RSG-15-035-01-DDC).
Materials
| Alexa Fluor 568 Donkey anti-mouse IgG | Molecular Probes | A10037 | |
| ATP disodium salt | Sigma Aldrich | A2383 | |
| Benzocaine | Sigma Aldrich | E1501 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma Aldrich | A3059 | |
| CaCl2 | Sigma Aldrich | C3306 | |
| Centrifuge | Beckman | J2-21M | |
| Centrifuge rotor | Beckman | JS 13.1 | |
| chymostatin | Sigma Aldrich | C7268 | |
| creatine phosphate disodium | Calbiochem | 2380 | |
| cycloheximide | Sigma Aldrich | C6255 | |
| cytochalasin D | Sigma Aldrich | C8273 | |
| disposable wipes (kimwipes) | Sigma Aldrich | Z188956 | |
| L-cysteine | Sigma Aldrich | W326306 | |
| EGTA | Sigma Aldrich | E4378 | |
| Formaldehyde | Sigma Aldrich | F8775 | |
| Glass crystallizing dish (150×75 mm) | VWR | 89090-662 | |
| Glycerol | Macron | 5094-16 | |
| HEPES | Sigma Aldrich | H4034 | |
| Hoechst – bisBenzimide H 33342 trihydrochloride | Sigma Aldrich | B2261 | |
| HCG – Human Chorionic Gonadotropin | Prospec | hor-250-c | |
| L15 Media | Sigma Aldrich | L4386 | |
| leupeptin | Sigma Aldrich | L2884 | |
| Lysolecithin | Sigma Aldrich | L1381 | |
| mAb414 | Abcam | ab24609 | |
| MgCl2 | EMD | MX0045-2 | |
| MgSO4 | Sigma Aldrich | M9397 | |
| Maltose | Sigma Aldrich | M5885 | |
| NP40 | BDH | 56009 | |
| Paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 15710 | |
| Penicillin + Streptomycin | Sigma Aldrich | Pp0781 | |
| pepstatin | Sigma Aldrich | P5318 | |
| PIPES | Sigma Aldrich | P6757 | |
| Plastic paraffin film (parafilm) | Sigma Aldrich | P7793 | |
| KCl | Sigma Aldrich | P9541 | |
| KH2PO4 | Mallinckrodt | 70100 | |
| KOH | Baker | 5 3140 | |
| PMSG – Pregnant Mare Serum Gonadotropin | Prospec | hor-272-a | |
| NaCl | Sigma Aldrich | S3014 | |
| NaHCO3 | Fisher | BP328 | |
| NaHPO4 | EMD | SX0720-1 | |
| NaOH | EMD | SX0590 | |
| Pestle | Thomas Scientific | 3411D56 | |
| Round bottom glass tubes, 15 ml | Corex | 8441 | |
| Secondary antibody (Alexa Fluor 568 donkey anti-mouse IgG) | ThermoFisher | A10037 | |
| sucrose | Calbiochem | 8550 | |
| thermal cycler | Bio-Rad | T100 | |
| Ultracentrifuge | Beckman | L8-80M | |
| Ultracentrifuge rotor | Beckman | SW 50.1 | |
| Vectashield (anti-fade mounting medium) | Vector | H-1000 |
References
- Conklin, E. Cell size and nuclear size. J. Exp. Embryol. 12, 1-98 (1912).
- Wilson, E. B. . The Cell in Development and Heredity. , 727-733 (1925).
- Levy, D. L., Heald, R. Nuclear size is regulated by importin alpha and Ntf2 in Xenopus. Cell. 143 (2), 288-298 (2010).
- Chan, Y. H., Marshall, W. F. Scaling properties of cell and organelle size. Organogenesis. 6 (2), 88-96 (2010).
- Walters, A. D., Bommakanti, A., Cohen-Fix, O. Shaping the nucleus: Factors and forces. J Cell Biochem. 113 (9), 2813-2821 (2012).
- Webster, M., Witkin, K. L., Cohen-Fix, O. Sizing up the nucleus: nuclear shape, size and nuclear-envelope assembly. J Cell Sci. 122 (Pt 10), 1477-1486 (2009).
- Edens, L. J., White, K. H., Jevtic, P., Li, X., Levy, D. L. Nuclear size regulation: from single cells to development and disease. Trends Cell Biol. 23 (4), 151-159 (2013).
- Jevtic, P., Edens, L. J., Vukovic, L. D., Levy, D. L. Sizing and shaping the nucleus: mechanisms and significance. Curr Opin Cell Biol. 28, 16-27 (2014).
- Levy, D. L., Heald, R. Mechanisms of intracellular scaling. Annu Rev Cell Dev Biol. 28, 113-135 (2012).
- Vukovic, L. D., Jevtic, P., Edens, L. J., Levy, D. L. New insights into the mechanisms and functions of nuclear size regulation. Int Rev Cell Mol Biol. 322, 1-59 (2016).
- Jevtic, P., Levy, D. L. Nuclear size scaling during Xenopus early development contributes to midblastula transition timing. Curr Biol. 25 (1), 45-52 (2015).
- Hara, Y., Iwabuchi, M., Ohsumi, K., Kimura, A. Intranuclear DNA density affects chromosome condensation in metazoans. Mol Biol Cell. 24 (15), 2442-2453 (2013).
- Zink, D., Fischer, A. H., Nickerson, J. A. Nuclear structure in cancer cells. Nat Rev Cancer. 4 (9), 677-687 (2004).
- Jevtic, P., Levy, D. L. Mechanisms of nuclear size regulation in model systems and cancer. Adv Exp Med Biol. 773, 537-569 (2014).
- Chow, K. H., Factor, R. E., Ullman, K. S. The nuclear envelope environment and its cancer connections. Nat Rev Cancer. 12 (3), 196-209 (2012).
- Blom, J. H., Ten Kate, F. J., Schroeder, F. H., van der Heul, R. O. Morphometrically estimated variation in nuclear size. A useful tool in grading prostatic cancer. Urol Res. 18 (2), 93-99 (1990).
- Dey, P. Cancer nucleus: morphology and beyond. Diagn Cytopathol. 38 (5), 382-390 (2010).
- Cross, M. K., Powers, M. A. Learning about cancer from frogs: analysis of mitotic spindles in Xenopus egg extracts. Dis Model Mech. 2 (11-12), 541-547 (2009).
- Voeltz, G. K., Prinz, W. A., Shibata, Y., Rist, J. M., Rapoport, T. A. A class of membrane proteins shaping the tubular endoplasmic reticulum. Cell. 124 (3), 573-586 (2006).
- Chan, R. C., Forbes, D. I. In vitro study of nuclear assembly and nuclear import using Xenopus egg extracts. Methods Mol Biol. 322, 289-300 (2006).
- Edens, L. J., Levy, D. L., Kloc, M., Kubiak, J. Z. . Xenopus Development. , 325-345 (2014).
- Levy, D. L., Heald, R. Biological Scaling Problems and Solutions in Amphibians. Cold Spring Harb Perspect Biol. 8 (1), a019166 (2016).
- Edens, L. J., Levy, D. L. cPKC regulates interphase nuclear size during Xenopus development. J Cell Biol. 206 (4), 473-483 (2014).
- Nieuwkoop, P. D., Faber, J. . Normal Table of Xenopus laevis (Daudin). , (1967).
- Newport, J., Kirschner, M. A major developmental transition in early Xenopus embryos: II. Control of the onset of transcription. Cell. 30 (3), 687-696 (1982).
- Newport, J., Kirschner, M. A major developmental transition in early Xenopus embryos: I. characterization and timing of cellular changes at the midblastula stage. Cell. 30 (3), 675-686 (1982).
- Maresca, T. J., Heald, R. Methods for studying spindle assembly and chromosome condensation in Xenopus egg extracts. Methods Mol Biol. 322, 459-474 (2006).
- Hannak, E., Heald, R. Investigating mitotic spindle assembly and function in vitro using Xenopus laevis egg extracts. Nat Protoc. 1 (5), 2305-2314 (2006).
- Murray, A. W. Cell cycle extracts. Methods Cell Biol. 36, 581-605 (1991).
- Khan, M. A., et al. Quantitative alterations in nuclear structure predict prostate carcinoma distant metastasis and death in men with biochemical recurrence after radical prostatectomy. Cancer. 98 (12), 2583-2591 (2003).
- Tan, P. H., Goh, B. B., Chiang, G., Bay, B. H. Correlation of nuclear morphometry with pathologic parameters in ductal carcinoma in situ of the breast. Mod Pathol. 14 (10), 937-941 (2001).
- Zeimet, A. G., et al. DNA ploidy, nuclear size, proliferation index and DNA-hypomethylation in ovarian cancer. Gynecol Oncol. 121 (1), 24-31 (2011).
- Theerthagiri, G., Eisenhardt, N., Schwarz, H., Antonin, W. The nucleoporin Nup188 controls passage of membrane proteins across the nuclear pore complex. J Cell Biol. 189 (7), 1129-1142 (2010).
- Wuhr, M., et al. Evidence for an upper limit to mitotic spindle length. Curr Biol. 18 (16), 1256-1261 (2008).
- Loughlin, R., Wilbur, J. D., McNally, F. J., Nedelec, F. J., Heald, R. Katanin contributes to interspecies spindle length scaling in Xenopus. Cell. 147 (6), 1397-1407 (2011).
- Wilbur, J. D., Heald, R. Mitotic spindle scaling during Xenopus development by kif2a and importin. eLife. 2, e00290 (2013).
- Kieserman, E. K., Heald, R. Mitotic chromosome size scaling in Xenopus. Cell Cycle. 10 (22), 3863-3870 (2011).
- Maresca, T. J., Freedman, B. S., Heald, R. Histone H1 is essential for mitotic chromosome architecture and segregation in Xenopus laevis egg extracts. J Cell Biol. 169 (6), 859-869 (2005).
- MacCallum, D. E., Losada, A., Kobayashi, R., Hirano, T. ISWI remodeling complexes in Xenopus egg extracts: identification as major chromosomal components that are regulated by INCENP-aurora B. Mol Biol Cell. 13 (1), 25-39 (2002).
- Goehring, N. W., Hyman, A. A. Organelle growth control through limiting pools of cytoplasmic components. Curr Biol. 22 (9), R330-R339 (2012).
- Du Toit, A. Development: Honey, I shrunk the nucleus. Nat Rev Mol Cell Biol. 15 (10), 633 (2014).
- Buchner, K. The role of protein kinase C in the regulation of cell growth and in signalling to the cell nucleus. J Cancer Res Clin Oncol. 126 (1), 1-11 (2000).
- Mochly-Rosen, D., Das, K., Grimes, K. V. Protein kinase C, an elusive therapeutic target. Nat Rev Drug Discov. 11 (12), 937-957 (2012).
