En cellfri analys med användning av<em> Xenopus laevis</em> Embryo extrakt för att studera mekanismer Kärn storlek förordning
Summary
Mechanisms of cellular and intra-cellular scaling remain elusive. The use of Xenopus embryo extracts has become increasingly common to elucidate mechanisms of organelle size regulation. This method describes embryo extract preparation and a novel nuclear scaling assay through which mechanisms of nuclear size regulation can be identified.
Abstract
En grundläggande fråga i cellbiologi är hur cell- och organell storlekar regleras. Det har länge varit känt att storleken på kärnan skalar i allmänhet med storleken på cellen, särskilt under embryogenes när dramatiska minskningar i både cell och nukleära storlekar uppstår. Mekanismer för storlek reglering kärn är till stor del okända och kan vara relevanta för cancer där förändrad kärn storlek är en viktig diagnostisk och prognostisk parameter. In vivo metoder för att identifiera kärnstorleksregulatorer kompliceras av det väsentliga och komplexa natur kärnfunktion. Tillvägagångssättet in vitro som beskrivs här för att studera kärnstorlekskontroll utnyttjar de normala sänkningar av kärnstorlek som inträffar under Xenopus laevis utveckling. Först kärnor monterade i X. laevis ägg extrakt. Därefter är dessa kärnor isolerade och återsuspenderades i cytoplasman från embryon sent skede. Efter en 30-90 min inkubation period, kärn ytareaminskar med 20-60%, vilket ger en användbar analys för att identifiera cytoplasmatiska komponenter som finns i sent stadium embryon som bidrar till utvecklingskärn storlek skalning. En stor fördel med denna metod är den relativa lätthet med vilken de ägg och embryoextrakt kan biokemiskt manipuleras, vilket möjliggör identifiering av nya proteiner och aktiviteter som reglerar kärn storlek. Som med alla in vitro-metod, är validering av resultat i ett in vivo-system viktig, och mikroinjektion av X. laevis embryon är särskilt lämpligt för dessa studier.
Introduction
Storlekarna på cellulära organeller skala typiskt med storleken på cellen, och detta har kanske bäst dokumenterade för skalning av nukleär storlek med cellstorlek 10/01. Detta gäller särskilt under embryogenes och celldifferentiering, när dramatiska minskningar i både cellen och kärn storlek observeras ofta 11,12. Dessutom är förändrad kärn storlek en viktig parameter i cancerdiagnos och prognos 13-17. Mekanismer som bidrar till storlek reglering kärn är till stor del okända, delvis på grund av komplexiteten och väsentliga karaktären hos kärnstruktur och funktion. Den här beskrivna metoden utvecklades som en in vitro analys för nukleär storlek skalning som är mottaglig för biokemisk manipulation och klarläggande av mekanismerna för storleksreglering nukleär.
Xenopus laevis ägg extrakt är ett väl etablerat system för att sammanfatta och studera komplexa cellulära processer i ett in vitro </em> Sammanhang. Dessa extrakt har avslöjat nya grundläggande information om flera cellulära processer, inklusive montering och funktion av den mitotiska spindeln, endoplasmatiska retiklet, och kärnan 18-22. En viktig fördel med extraktet systemet är att X. laevis ägg extrakt representerar en nästan outspädd cytoplasma vars sammansättning kan lätt ändras, till exempel genom tillsats av rekombinanta proteiner eller immunotömning. Vidare är en möjlighet att manipulera väsentliga processerna genom att använda behandlingar som annars kan vara dödlig i ett in vivo sammanhang. Modifieringar av äggextrakt förfarande medger isolering av extrakt från X. laevis embryon snarare än ägg och dessa embryoextrakt är lika mottagliga för biokemisk manipulation 23. Under X. laevis utveckling, encelliga befruktade embryot (~ 1 mm diameter) genomgår en serie av tolv snabba divisioner cell (stegen 1-8) för att generera flera tusen 50 μm diameter och mindre celler och nådde ett utvecklingsstadium benämnd midblastula övergång (MBT) eller steg 24-26 augusti. MBT kännetecknas av uppkomsten av zygotiska transkription, cellmigration, asynkrona celldelningar, förvärv av gap faser, och etablering av kärn steady-state storlekar snarare än kontinuerlig kärn expansion i pre-MBT embryo. Från steg 4 till gastrulation (steg 10,5-12), volymen av enskilda kärnor minskar med mer än 10-faldigt 11.
Här är målet att identifiera mekanismer som ansvarar för dessa minskningar i kärn storlek under utvecklings progression. Tillvägagångssättet är att först samla kärnor i X. laevis ägg extrakt och att isolera dessa kärnor från ägg cytoplasman / extrakt. Dessa kärnor återsuspenderades sedan i cytoplasman från slutet gastrulastadium embryon. Efter en inkubationstid, kärnorna från ägg extrakt blir mindre i sent skede embryo extrakt. Resonerade vi att detta woulskulle vara en användbar analys för att identifiera cytoplasmatiska komponenter som förekommer i sent stadium embryon som bidrar till utvecklingskärn storlek skalning. Med hjälp av denna analys, i kombination med in vivo validering, visade vi att proteinkinas C (PKC) bidrar till utvecklings minskningar av kärnstorlek i X. laevis 23.
Protocol
Representative Results
Discussion
Here is presented a novel method to study mechanisms of nuclear size regulation during X. laevis development. Developmental progression is associated with dramatic changes in cell physiology, metabolism, division rates, and migration, as well as alterations in the sizes of cells and intracellular structures. These varied processes are complex and essential, so it is difficult to study just one of these aspects of development in an in vivo setting. The X. laevis embryo extract and nuclear shrink…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Members of the Levy and Gatlin labs as well as colleagues in the Department of Molecular Biology offered helpful advice and discussions. Rebecca Heald provided support in the early stages of developing this protocol. This work was supported by the NIH/NIGMS (R15GM106318) and the American Cancer Society (RSG-15-035-01-DDC).
Materials
| Alexa Fluor 568 Donkey anti-mouse IgG | Molecular Probes | A10037 | |
| ATP disodium salt | Sigma Aldrich | A2383 | |
| Benzocaine | Sigma Aldrich | E1501 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma Aldrich | A3059 | |
| CaCl2 | Sigma Aldrich | C3306 | |
| Centrifuge | Beckman | J2-21M | |
| Centrifuge rotor | Beckman | JS 13.1 | |
| chymostatin | Sigma Aldrich | C7268 | |
| creatine phosphate disodium | Calbiochem | 2380 | |
| cycloheximide | Sigma Aldrich | C6255 | |
| cytochalasin D | Sigma Aldrich | C8273 | |
| disposable wipes (kimwipes) | Sigma Aldrich | Z188956 | |
| L-cysteine | Sigma Aldrich | W326306 | |
| EGTA | Sigma Aldrich | E4378 | |
| Formaldehyde | Sigma Aldrich | F8775 | |
| Glass crystallizing dish (150×75 mm) | VWR | 89090-662 | |
| Glycerol | Macron | 5094-16 | |
| HEPES | Sigma Aldrich | H4034 | |
| Hoechst – bisBenzimide H 33342 trihydrochloride | Sigma Aldrich | B2261 | |
| HCG – Human Chorionic Gonadotropin | Prospec | hor-250-c | |
| L15 Media | Sigma Aldrich | L4386 | |
| leupeptin | Sigma Aldrich | L2884 | |
| Lysolecithin | Sigma Aldrich | L1381 | |
| mAb414 | Abcam | ab24609 | |
| MgCl2 | EMD | MX0045-2 | |
| MgSO4 | Sigma Aldrich | M9397 | |
| Maltose | Sigma Aldrich | M5885 | |
| NP40 | BDH | 56009 | |
| Paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 15710 | |
| Penicillin + Streptomycin | Sigma Aldrich | Pp0781 | |
| pepstatin | Sigma Aldrich | P5318 | |
| PIPES | Sigma Aldrich | P6757 | |
| Plastic paraffin film (parafilm) | Sigma Aldrich | P7793 | |
| KCl | Sigma Aldrich | P9541 | |
| KH2PO4 | Mallinckrodt | 70100 | |
| KOH | Baker | 5 3140 | |
| PMSG – Pregnant Mare Serum Gonadotropin | Prospec | hor-272-a | |
| NaCl | Sigma Aldrich | S3014 | |
| NaHCO3 | Fisher | BP328 | |
| NaHPO4 | EMD | SX0720-1 | |
| NaOH | EMD | SX0590 | |
| Pestle | Thomas Scientific | 3411D56 | |
| Round bottom glass tubes, 15 ml | Corex | 8441 | |
| Secondary antibody (Alexa Fluor 568 donkey anti-mouse IgG) | ThermoFisher | A10037 | |
| sucrose | Calbiochem | 8550 | |
| thermal cycler | Bio-Rad | T100 | |
| Ultracentrifuge | Beckman | L8-80M | |
| Ultracentrifuge rotor | Beckman | SW 50.1 | |
| Vectashield (anti-fade mounting medium) | Vector | H-1000 |
References
- Conklin, E. Cell size and nuclear size. J. Exp. Embryol. 12, 1-98 (1912).
- Wilson, E. B. . The Cell in Development and Heredity. , 727-733 (1925).
- Levy, D. L., Heald, R. Nuclear size is regulated by importin alpha and Ntf2 in Xenopus. Cell. 143 (2), 288-298 (2010).
- Chan, Y. H., Marshall, W. F. Scaling properties of cell and organelle size. Organogenesis. 6 (2), 88-96 (2010).
- Walters, A. D., Bommakanti, A., Cohen-Fix, O. Shaping the nucleus: Factors and forces. J Cell Biochem. 113 (9), 2813-2821 (2012).
- Webster, M., Witkin, K. L., Cohen-Fix, O. Sizing up the nucleus: nuclear shape, size and nuclear-envelope assembly. J Cell Sci. 122 (Pt 10), 1477-1486 (2009).
- Edens, L. J., White, K. H., Jevtic, P., Li, X., Levy, D. L. Nuclear size regulation: from single cells to development and disease. Trends Cell Biol. 23 (4), 151-159 (2013).
- Jevtic, P., Edens, L. J., Vukovic, L. D., Levy, D. L. Sizing and shaping the nucleus: mechanisms and significance. Curr Opin Cell Biol. 28, 16-27 (2014).
- Levy, D. L., Heald, R. Mechanisms of intracellular scaling. Annu Rev Cell Dev Biol. 28, 113-135 (2012).
- Vukovic, L. D., Jevtic, P., Edens, L. J., Levy, D. L. New insights into the mechanisms and functions of nuclear size regulation. Int Rev Cell Mol Biol. 322, 1-59 (2016).
- Jevtic, P., Levy, D. L. Nuclear size scaling during Xenopus early development contributes to midblastula transition timing. Curr Biol. 25 (1), 45-52 (2015).
- Hara, Y., Iwabuchi, M., Ohsumi, K., Kimura, A. Intranuclear DNA density affects chromosome condensation in metazoans. Mol Biol Cell. 24 (15), 2442-2453 (2013).
- Zink, D., Fischer, A. H., Nickerson, J. A. Nuclear structure in cancer cells. Nat Rev Cancer. 4 (9), 677-687 (2004).
- Jevtic, P., Levy, D. L. Mechanisms of nuclear size regulation in model systems and cancer. Adv Exp Med Biol. 773, 537-569 (2014).
- Chow, K. H., Factor, R. E., Ullman, K. S. The nuclear envelope environment and its cancer connections. Nat Rev Cancer. 12 (3), 196-209 (2012).
- Blom, J. H., Ten Kate, F. J., Schroeder, F. H., van der Heul, R. O. Morphometrically estimated variation in nuclear size. A useful tool in grading prostatic cancer. Urol Res. 18 (2), 93-99 (1990).
- Dey, P. Cancer nucleus: morphology and beyond. Diagn Cytopathol. 38 (5), 382-390 (2010).
- Cross, M. K., Powers, M. A. Learning about cancer from frogs: analysis of mitotic spindles in Xenopus egg extracts. Dis Model Mech. 2 (11-12), 541-547 (2009).
- Voeltz, G. K., Prinz, W. A., Shibata, Y., Rist, J. M., Rapoport, T. A. A class of membrane proteins shaping the tubular endoplasmic reticulum. Cell. 124 (3), 573-586 (2006).
- Chan, R. C., Forbes, D. I. In vitro study of nuclear assembly and nuclear import using Xenopus egg extracts. Methods Mol Biol. 322, 289-300 (2006).
- Edens, L. J., Levy, D. L., Kloc, M., Kubiak, J. Z. . Xenopus Development. , 325-345 (2014).
- Levy, D. L., Heald, R. Biological Scaling Problems and Solutions in Amphibians. Cold Spring Harb Perspect Biol. 8 (1), a019166 (2016).
- Edens, L. J., Levy, D. L. cPKC regulates interphase nuclear size during Xenopus development. J Cell Biol. 206 (4), 473-483 (2014).
- Nieuwkoop, P. D., Faber, J. . Normal Table of Xenopus laevis (Daudin). , (1967).
- Newport, J., Kirschner, M. A major developmental transition in early Xenopus embryos: II. Control of the onset of transcription. Cell. 30 (3), 687-696 (1982).
- Newport, J., Kirschner, M. A major developmental transition in early Xenopus embryos: I. characterization and timing of cellular changes at the midblastula stage. Cell. 30 (3), 675-686 (1982).
- Maresca, T. J., Heald, R. Methods for studying spindle assembly and chromosome condensation in Xenopus egg extracts. Methods Mol Biol. 322, 459-474 (2006).
- Hannak, E., Heald, R. Investigating mitotic spindle assembly and function in vitro using Xenopus laevis egg extracts. Nat Protoc. 1 (5), 2305-2314 (2006).
- Murray, A. W. Cell cycle extracts. Methods Cell Biol. 36, 581-605 (1991).
- Khan, M. A., et al. Quantitative alterations in nuclear structure predict prostate carcinoma distant metastasis and death in men with biochemical recurrence after radical prostatectomy. Cancer. 98 (12), 2583-2591 (2003).
- Tan, P. H., Goh, B. B., Chiang, G., Bay, B. H. Correlation of nuclear morphometry with pathologic parameters in ductal carcinoma in situ of the breast. Mod Pathol. 14 (10), 937-941 (2001).
- Zeimet, A. G., et al. DNA ploidy, nuclear size, proliferation index and DNA-hypomethylation in ovarian cancer. Gynecol Oncol. 121 (1), 24-31 (2011).
- Theerthagiri, G., Eisenhardt, N., Schwarz, H., Antonin, W. The nucleoporin Nup188 controls passage of membrane proteins across the nuclear pore complex. J Cell Biol. 189 (7), 1129-1142 (2010).
- Wuhr, M., et al. Evidence for an upper limit to mitotic spindle length. Curr Biol. 18 (16), 1256-1261 (2008).
- Loughlin, R., Wilbur, J. D., McNally, F. J., Nedelec, F. J., Heald, R. Katanin contributes to interspecies spindle length scaling in Xenopus. Cell. 147 (6), 1397-1407 (2011).
- Wilbur, J. D., Heald, R. Mitotic spindle scaling during Xenopus development by kif2a and importin. eLife. 2, e00290 (2013).
- Kieserman, E. K., Heald, R. Mitotic chromosome size scaling in Xenopus. Cell Cycle. 10 (22), 3863-3870 (2011).
- Maresca, T. J., Freedman, B. S., Heald, R. Histone H1 is essential for mitotic chromosome architecture and segregation in Xenopus laevis egg extracts. J Cell Biol. 169 (6), 859-869 (2005).
- MacCallum, D. E., Losada, A., Kobayashi, R., Hirano, T. ISWI remodeling complexes in Xenopus egg extracts: identification as major chromosomal components that are regulated by INCENP-aurora B. Mol Biol Cell. 13 (1), 25-39 (2002).
- Goehring, N. W., Hyman, A. A. Organelle growth control through limiting pools of cytoplasmic components. Curr Biol. 22 (9), R330-R339 (2012).
- Du Toit, A. Development: Honey, I shrunk the nucleus. Nat Rev Mol Cell Biol. 15 (10), 633 (2014).
- Buchner, K. The role of protein kinase C in the regulation of cell growth and in signalling to the cell nucleus. J Cancer Res Clin Oncol. 126 (1), 1-11 (2000).
- Mochly-Rosen, D., Das, K., Grimes, K. V. Protein kinase C, an elusive therapeutic target. Nat Rev Drug Discov. 11 (12), 937-957 (2012).
