JoVE Journal > Developmental Biology
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
Automatic Translation
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Developmental Biology

Het grootbrengen de fruitvlieg<em> Drosophila melanogaster</em> Onder Axenische en gnotobiotische voorwaarden

Published: July 30, 2016
doi:
10.3791/54219
, , , , , ,
1Department of Plant and Wildlife Sciences,Brigham Young University, 2Department of Entomology,Cornell University, 3Department of Molecular Biology and Genetics,Cornell University, 4Division of Infectious Diseases, Boston Children’s Hospital,Harvard Medical School, 5Biological Sciences,SUNY Oswego

Summary

Een methode voor het kweken van Drosophila melanogaster onder axenic en gnotobiotische voorwaarden wordt gepresenteerd. Fly embryo's worden dechorionated in natriumhypochloriet, aseptisch in steriele voeding en grootgebracht in gesloten containers. Inenten van voeding en embryo's met bacteriën leidt tot gnotobiotische verenigingen, en bacteriële aanwezigheid wordt bevestigd door plating whole-body Drosophila homogenaten.

Abstract

The influence of microbes on myriad animal traits and behaviors has been increasingly recognized in recent years. The fruit fly Drosophila melanogaster is a model for understanding microbial interactions with animal hosts, facilitated by approaches to rear large sample sizes of Drosophila under microorganism-free (axenic) conditions, or with defined microbial communities (gnotobiotic). This work outlines a method for collection of Drosophila embryos, hypochlorite dechorionation and sterilization, and transfer to sterile diet. Sterilized embryos are transferred to sterile diet in 50 ml centrifuge tubes, and developing larvae and adults remain free of any exogenous microbes until the vials are opened. Alternatively, flies with a defined microbiota can be reared by inoculating sterile diet and embryos with microbial species of interest. We describe the introduction of 4 bacterial species to establish a representative gnotobiotic microbiota in Drosophila. Finally, we describe approaches for confirming bacterial community composition, including testing if axenic Drosophila remain bacteria-free into adulthood.

Introduction

De meeste dieren zijn nauw verbonden met bacteriën ( 'microbiota') vanaf de geboorte tot de dood 1. Vergelijkingen van micro-organisme-vrij ( 'axenic') en micro-organisme geassocieerde ( 'conventionele') dieren hebben aangetoond microben invloed op diverse aspecten van de gezondheid van dieren, met inbegrip van metabole, nutritionele, bloedvaten, lever, respiratoire, immunologische, endocriene en neurologische functie 2. De fruitvlieg Drosophila melanogaster is een belangrijk model voor het begrijpen van vele van deze processen in de aanwezigheid van microben 3,4 en voor het bestuderen microbiota invloed diergezondheid 5,6. Geen bacteriesoorten aanwezig in ieder individu ( 'core'), maar Acetobacter en Lactobacillus soorten numeriek domineren de microbiota van zowel laboratorium gekweekte en in het wild gevangen D. melanogaster. Andere Acetobacteraceae (inclusief Komagataeibacter en Gluconobacter), Firmicutes (zoals Enterococcus en Leuconostoc), en Enterobacteriaceae zijn ofwel vaak aanwezig in Drosophila personen bij lage overvloed, of onregelmatig aanwezig bij hoge overvloed 7-12.

De microbiota van Drosophila en zoogdieren is wisselvallig binnen en tussen de generaties 14,19. Microbiota wisselvalligheid kan leiden tot fenotypische lawaai bij het meten van microbiota-afhankelijke eigenschappen. Bijvoorbeeld, de Acetobacteraceae invloed lipide (triglyceride) opslag in Drosophila 15-18. Als Acetobacteraceae meer overvloedig in vliegen van een flacon is dan in een andere 19, kan isogene vliegen verschillende fenotypes 20 hebben. Een oplossing voor het probleem van microbiota onbestendigheid bij muizen 14 is in de praktijk sinds de 1960's, door invoering van een bepaalde gemeenschap van 8 dominante microbiële soort muizen- pups elke nieuwe generatie (gewijzigde Schaedler flora),zodat elk pup wordt blootgesteld aan dezelfde belangrijke leden van de muis microbiota. Deze praktijk bedieningsorganen voor microbiota samenstelling zelfs wanneer de microbiota is niet het primaire doel van de studie 32 en stelt precedent de aanwezigheid van belangrijke microben in verschillende experimentele omstandigheden te waarborgen.

Om de invloed van microben op Drosophila voeding te bepalen, hebben een aantal protocollen voor het afleiden van axenic fly lijnen ontwikkeld, met inbegrip van chloorbleekloog dechorionation van embryo's (hetzij afgeleid de novo elke generatie of generationally onderhouden door overschrijving op steriele diëten) en behandeling met antibiotica 13. Er zijn voordelen aan verschillende benaderingen, zoals gemak en snelheid voor beide antibiotica behandeling en seriële overdracht versus meer controle verstorende variabelen de novo dechorionation (bijvoorbeeld ei dichtheid resterende contaminerende microben, off-target antibiotische effecten). Ongeacht de wijze vanvoorbereiding, de introductie van bepaalde microbiële soorten embryo axenische maakt cultuur van Drosophila met gedefinieerde ( 'gnotobiotische') communities. Alternatief nabootsen het gebruik van Schaedler flora die gemeenschap kunnen worden geïnoculeerd conventioneel eitjes (volgende stappen 6-7) om de aanwezigheid van eigenschap beïnvloeden microben Elke flacon en ter voorkoming van complicaties van microbiota onbestendigheid. Hier beschrijven we het protocol voor het verhogen van axenic en gnotobiotische Drosophila door de novo dechorionation van embryo's, en voor het bevestigen van de aanwezigheid van ingevoerd of vervuilende microbiële taxa.

Protocol

1. Cultuur Bacteriën (Start ~ 1 week voor Picking eieren) Bereid gemodificeerde MRS 20 (Mmrs) borden en bouillon buizen (tabel 1). Giet 20 ml Mmrs agar in elk 100 mm Petri plaat en laat het afkoelen / droog 's nachts, of 5 ml Mmrs bouillon in 18 mm reageerbuizen. Streak Acetobacter pomorum, A. tropicalis, Lactobacillus brevis, en L. plantarum op Mmrs agarplaten. Incubeer Acetobacter overnacht bij 30 ° C. Incubate Lact…

Representative Results

Succesvolle opfok van axenic vliegen wordt bevestigd door isolatie van geen CFU's uit het hele lichaam homogenisaties van D. melanogaster volwassenen (figuur 1). Als alternatief, als de vergulde homogenaat levert kolonies, de flesjes zijn vervuild en moet worden weggegooid. Voor gnotobiotische vliegen, elk van de vier bacteriële isolaten werden geïsoleerd uit pools van 5 volwassen mannen, waaruit verschillen in de totale levensvatbare CFU's geassocieer…

Discussion

De hier beschreven methode is een van de verschillende benaderingen voor het embryo dechorionation 8,11,18,25,26,27, samen met alternatieve houderijsystemen axenic vliegen, met inbegrip van seriële overdracht van axenic volwassenen 18,27 of een behandeling met antibiotica 13,18. Andere dechorionation methoden omvatten ethanol wast en verminderen 11,25,26 of uit te breiden 8 hypochloriet behandeling. Verschillende wasstappen kunnen helpen grootbrengen verschil…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Sommige details van dit protocol werden geoptimaliseerd met de hulp van Dr. Adam Dobson, die ook voorzien van nuttige opmerkingen over het manuscript. Dit werk werd ondersteund door de Stichting voor de National Institutes of Health (FNIH) subsidie ​​nummer R01GM095372 (JMC, A (CN) W, AJD, en AED). FNIH subsidie ​​nummer 1F32GM099374-01 (PDN), en Brigham Young University opstarten fondsen (JMC, MLK, MV). Publicatiekosten werden gesteund door de Brigham Young University College van Life Sciences en het ministerie van Plant and Wildlife Sciences.

Materials

Brewer's Yeast MP Biomedicals, LLC. 903312 http://www.mpbio.com/product.php?pid=02903312
Glucose Sigma Aldrich 158968-3KG http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/aldrich/158968?lang=en&region=US
Agar Fisher–Lab Scientific fly802010 https://www.fishersci.com/shop/products/drosophila-agar-8-100mesh-10kg/nc9349177
Welch's 100% Grape Juice Concentrate Walmart or other grocery store 9116196 http://www.walmart.com/ip/Welch-s-Frozen-100-Grape-Juice-Concentrate-11.5-oz/10804406
Cage: 32 oz. Translucent Round Deli Container Webstaurant Store 999L5032Y http://www.webstaurantstore.com/newspring-delitainer-sd5032y-32-oz-translucent-round-deli-container-24-pack/999L5032Y.html
Translucent Round Deli Container Lid Webstaurant Store 999YNL500 http://www.webstaurantstore.com/newspring-delitainer-ynl500-translucent-round-deli-container-lid-60-pack/999YNL500.html
Stock Bottles Genesee Scientific 32-130 https://geneseesci.com/shop-online/product-details/?product=32-130
Droso-Plugs Genesee Scientific 49-101 https://geneseesci.com/shop-online/product-details/?product=49-101
Nylon Mesh Genesee Scientific 57-102  https://geneseesci.com/shop-online/product-details/715/?product=57-102
Plastic Bushing Home Depot 100343125 http://www.homedepot.com/p/Halex-2-1-2-in-Rigid-Insulated-Plastic-Bushing-75225/100343125
Specimen Cup MedSupply Partners K01-207067 http://www.medsupplypartners.com/covidien-specimen-containers.html
Repeater M4 Eppendorf 4982000322 https://online-shop.eppendorf.us/US-en/Manual-Liquid-Handling-44563/Dispensers–Burettes-44566/Repeater-M4-PF-44619.html
50 ml Centrifuge Tubes Laboratory Product Sales TR2003 https://www.lpsinc.com/Catalog4.asp?catalog_nu=TR2003
Food Boxes USA Scientific 2316-5001 http://www.usascientific.com/search.aspx?find=2316-5001
Lysing Matrix D Bulk MP Biomedicals, LLC. 116540434 http://www.mpbio.com/search.php?q=6540-434&s=Search
Filter Pipette Tips, 300μl USA Scientific 1120-9810 http://www.usascientific.com/search.aspx?find=1120-9810
Petri Dishes Laboratory Product Sales M089303 https://www.lpsinc.com/Catalog4.asp?catalog_nu=M089303
Ethanol Decon Laboratories, INC. 2701 http://www.deconlabs.com/products.php?ID=88
Paintbrush Walmart 5133 http://www.walmart.com/ip/Chenille-Kraft-5133-Acrylic-Handled-Brush-Set-Assorted-Sizes-colors-8-Brushes-set/41446005
Forceps Fisher 08-882 https://www.fishersci.com/shop/products/fisherbrand-medium-pointed-forceps-3/p-128693
Household Bleach (6-8% Hypochlorite) Walmart 550646751 http://www.walmart.com/ip/Clorox-Concentrated-Regular-Bleach-121-fl-oz/21618295
Universal Peptone Genesee Scientific 20-260 https://geneseesci.com/shop-online/product-details/?product=20-260
Yeast Extract  Fisher Scientific BP1422-500 https://www.fishersci.com/shop/products/fisher-bioreagents-microbiology-media-additives-yeast-extract-3/bp1422500?matchedCatNo=BP1422500
Dipotassium Phosphate Sigma Aldrich P3786-1KG http://www.sigmaaldrich.com/catalog/search?term=P3786-1KG&interface=All&N=0&mode=match%20partialmax&lang=en&region=US&focus=product
Ammonium Citrate Sigma Aldrich 25102-500g http://www.sigmaaldrich.com/catalog/search?term=25102-500g&interface=All&N=0&mode=match%20partialmax&lang=en&region=US&focus=product
Sodium Acetate VWR 97061-994 https://us.vwr.com/store/catalog/product.jsp?catalog_number=97061-994
Magnesium Sulfate Fisher Scientific M63-500 https://www.fishersci.com/shop/products/magnesium-sulfate-heptahydrate-crystalline-certified-acs-fisher-chemical-3/m63500?matchedCatNo=M63500
Manganese Sulfate Sigma Aldrich 10034-96-5 http://www.sigmaaldrich.com/catalog/search?term=10034-96-5&interface=CAS%20No.&N=0&mode=match%20partialmax&lang=en&region=US&focus=product
MRS Powder Sigma Aldrich 69966-500G http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sial/69966?lang=en&region=US
96 Well Plate Reader BioTek (Epoch)  NA http://www.biotek.com/products/microplate_detection/epoch_microplate_spectrophotometer.html
1.7 ml Centrifuge Tubes USA Scientific 1615-5500 http://www.usascientific.com/search.aspx?find=1615-5500
Filter Pipette Tips, 1000μl USA Scientific 1122-1830 http://www.usascientific.com/search.aspx?find=1122-1830
96 Well Plates Greiner Bio-One 655101 https://shop.gbo.com/en/usa/articles/catalogue/article/0110_0040_0120_0010/13243/
Ceramic Beads MP Biomedicals, LLC. 6540-434 http://www.mpbio.com/product.php?pid=116540434
Tissue Homogenizer MP Biomedicals, LLC. 116004500 http://www.mpbio.com/product.php?pid=116004500
Class 1 BioSafety Cabinet Thermo Scientific  Model 1395 http://www.thermoscientific.com/en/product/1300-series-class-ii-type-a2-biological-safety-cabinet-packages.html
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. McFall-Ngai, M. J. Giving microbes their due–animal life in a microbially dominant world. J Exp Biol. 218, 1968-1973 (2015).
  2. Smith, K., McCoy, K. D., Macpherson, A. J. Use of axenic animals in studying the adaptation of mammals to their commensal intestinal microbiota. Semin Immunol. 19 (2), 59-69 (2007).
  3. Rieder, L. E., Larschan, E. N. Wisdom from the fly. Trends Genet. 30 (11), 479-481 (2014).
  4. Arias, A. M. Drosophila melanogaster and the development of biology in the 20th century. Methods Mol Biol. 420, 1-25 (2008).
  5. Lee, W. J., Brey, P. T. How microbiomes influence metazoan development: insights from history and Drosophila modeling of gut-microbe interactions. Annu Rev Cell Dev Biol. 29, 571-592 (2013).
  6. Erkosar, B., Leulier, F. Transient adult microbiota, gut homeostasis and longevity: novel insights from the Drosophila model. FEBS Lett. 588 (22), 4250-4257 (2014).
  7. Chandler, J. A., Lang, J. M., Bhatnagar, S., Eisen, J. A., Kopp, A. Bacterial communities of diverse Drosophila species: ecological context of a host-microbe model system. PLoS Genet. 7 (9), e1002272 (2011).
  8. Broderick, N. A., Buchon, N., Lemaitre, B. Microbiota-induced changes in drosophila melanogaster host gene expression and gut morphology. MBio. 5 (3), 01117 (2014).
  9. Wong, C. N., Ng, P., Douglas, A. E. Low-diversity bacterial community in the gut of the fruitfly Drosophila melanogaster. Environ Microbiol. 13 (7), 1889-1900 (2011).
  10. Staubach, F., Baines, J. F., Kunzel, S., Bik, E. M., Petrov, D. A. Host species and environmental effects on bacterial communities associated with Drosophila in the laboratory and in the natural environment. PLoS One. 8 (8), e70749 (2013).
  11. Brummel, T., Ching, A., Seroude, L., Simon, A. F., Benzer, S. Drosophila lifespan enhancement by exogenous bacteria. Proc Natl Acad Sci U S A. 101 (35), 12974-12979 (2004).
  12. Cox, C. R., Gilmore, M. S. Native microbial colonization of Drosophila melanogaster and its use as a model of Enterococcus faecalis pathogenesis. Infect Immun. 75 (4), 1565-1576 (2007).
  13. Ridley, E. V., Wong, A. C., Douglas, A. E. Microbe-dependent and nonspecific effects of procedures to eliminate the resident microbiota from Drosophila melanogaster. Appl Environ Microbiol. 79 (10), 3209-3214 (2013).
  14. Rogers, G. B., et al. Functional divergence in gastrointestinal microbiota in physically-separated genetically identical mice. Sci Rep. 4, 5437 (2014).
  15. Chaston, J. M., Newell, P. D., Douglas, A. E. Metagenome-wide association of microbial determinants of host phenotype in Drosophila melanogaster. MBio. 5 (5), 01631-01714 (2014).
  16. Huang, J. H., Douglas, A. E. Consumption of dietary sugar by gut bacteria determines Drosophila lipid content. Biology Letters. , (2015).
  17. Shin, S. C., et al. Drosophila microbiome modulates host developmental and metabolic homeostasis via insulin signaling. Science. 334 (6056), 670-674 (2011).
  18. Storelli, G., et al. Lactobacillus plantarum promotes Drosophila systemic growth by modulating hormonal signals through TOR-dependent nutrient sensing. Cell Metab. 14 (3), 403-414 (2011).
  19. Wong, A. C., Chaston, J. M., Douglas, A. E. The inconstant gut microbiota of Drosophila species revealed by 16S rRNA gene analysis. ISME J. 7 (10), 1922-1932 (2013).
  20. Newell, P. D., Douglas, A. E. Interspecies interactions determine the impact of the gut microbiota on nutrient allocation in Drosophila melanogaster. Appl Environ Microbiol. 80 (2), 788-796 (2014).
  21. Broderick, N. A., Lemaitre, B. Gut-associated microbes of Drosophila melanogaster. Gut Microbes. 3 (4), 307-321 (2012).
  22. Ren, C., Webster, P., Finkel, S. E., Tower, J. Increased internal and external bacterial load during Drosophila aging without life-span trade-off. Cell Metab. 6 (2), 144-152 (2007).
  23. Wong, A. C., et al. The Host as the Driver of the Microbiota in the Gut and External Environment of Drosophila melanogaster. Appl Environ Microbiol. 81 (18), 6232-6240 (2015).
  24. Dobson, A. J., et al. Host genetic determinants of microbiota-dependent nutrition revealed by genome-wide analysis of Drosophila melanogaster. Nat Commun. 6, 6312 (2015).
  25. Bakula, M. The persistence of a microbial flora during postembryogenesis of Drosophila melanogaster. J Invertebr Pathol. 14 (3), 365-374 (1969).
  26. Ryu, J. H., et al. Innate immune homeostasis by the homeobox gene caudal and commensal-gut mutualism in Drosophila. Science. 319 (5864), 777-782 (2008).
  27. Blum, J. E., Fischer, C. N., Miles, J., Handelsman, J. Frequent replenishment sustains the beneficial microbiome of Drosophila melanogaster. MBio. 4 (6), 00860 (2013).
  28. Bitner-Mathe, B. C., Klaczko, L. B. Plasticity of Drosophila melanogaster wing morphology: effects of sex, temperature and density. Genetica. 105 (2), 203-210 (1999).
  29. Edward, D. A., Chapman, T. Sex-specific effects of developmental environment on reproductive trait expression in Drosophila melanogaster. Ecol Evol. 2 (7), 1362-1370 (2012).
  30. Ridley, E. V., Wong, A. C., Westmiller, S., Douglas, A. E. Impact of the resident microbiota on the nutritional phenotype of Drosophila melanogaster. PLoS One. 7 (5), e36765 (2012).
  31. Newell, P. D., et al. In vivo function and comparative genomic analyses of the Drosophila gut microbiota identify candidate symbiosis factors. Front Microbiol. 5, 576 (2014).
  32. Dewhirst, F. E., et al. Phylogeny of the defined murine microbiota: altered Schaedler flora. Appl Environ Microbiol. 65 (8), 3287-3292 (1999).
  33. Min, K. T., Benzer, S. Wolbachia, normally a symbiont of Drosophila, can be virulent, causing degeneration and early death. Proc Natl Acad Sci U S A. 94 (20), 10792-10796 (1997).

Tags

Drosophila MelanogasterAxenicGnotobioticMicrobiotaSterile DietMRS AgarLactobacillusAcetobacterGrape Juice AgarYeast PasteEgg Collection
check_url/54219?article_type=t

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Koyle, M. L., Veloz, M., Judd, A. M., Wong, A. C., Newell, P. D., Douglas, A. E., Chaston, J. M. Rearing the Fruit Fly Drosophila melanogaster Under Axenic and Gnotobiotic Conditions. J. Vis. Exp. (113), e54219, doi:10.3791/54219 (2016).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image