Allevamento la mosca della frutta<em> Drosophila melanogaster</em> Sotto axeniche e Gnotobiotic Condizioni
Summary
Un metodo per l'allevamento di Drosophila melanogaster in condizioni axeniche e gnotobiotic è presentato. Fly embrioni vengono dechorionated in ipoclorito di sodio, trasferiti asetticamente alla dieta sterili, e allevati in contenitori chiusi. Inoculando dieta ed embrioni con i batteri porta ad associazioni gnotobiotic, e la presenza di batteri è confermata dalla placcatura di tutto il corpo omogenati Drosophila.
Abstract
The influence of microbes on myriad animal traits and behaviors has been increasingly recognized in recent years. The fruit fly Drosophila melanogaster is a model for understanding microbial interactions with animal hosts, facilitated by approaches to rear large sample sizes of Drosophila under microorganism-free (axenic) conditions, or with defined microbial communities (gnotobiotic). This work outlines a method for collection of Drosophila embryos, hypochlorite dechorionation and sterilization, and transfer to sterile diet. Sterilized embryos are transferred to sterile diet in 50 ml centrifuge tubes, and developing larvae and adults remain free of any exogenous microbes until the vials are opened. Alternatively, flies with a defined microbiota can be reared by inoculating sterile diet and embryos with microbial species of interest. We describe the introduction of 4 bacterial species to establish a representative gnotobiotic microbiota in Drosophila. Finally, we describe approaches for confirming bacterial community composition, including testing if axenic Drosophila remain bacteria-free into adulthood.
Introduction
La maggior parte degli animali sono intimamente associati con i batteri ( 'microbiota') dalla nascita alla morte 1. I confronti di ( 'convenzionale') gli animali privi di microrganismi ( 'axeniche') e di microrganismi-associati hanno dimostrato microbi influenzano diversi aspetti della salute degli animali, tra cui metabolica, nutrizionale, vascolari, epatiche, respiratorio, immunologico, endocrino, e la funzione neurologica 2. La mosca della frutta Drosophila melanogaster è un modello chiave per comprendere molti di questi processi in presenza di microbi 3,4 e per studiare l'influenza microbiota su 5,6 salute degli animali. Nessuna specie batterica è presente in ogni individuo ( 'core'), ma Acetobacter e Lactobacillus specie numericamente dominano il microbiota di entrambi D. laboratorio-allevati e catturati in natura melanogaster. Altro Acetobacteraceae (compresi Komagataeibacter e Gluconobacter), Firmicutes (come Enterococcus e Leuconostoc), e Enterobacteriaceae sono sia spesso presente in individui Drosophila a bassa abbondanza, o irregolarmente presenti in grande abbondanza 7-12.
Il microbiota di Drosophila e mammiferi è incostanti all'interno e attraverso le generazioni 14,19. Microbiota incostanza può portare a rumore fenotipica quando si misurano i tratti microbiota-dipendente. Ad esempio, la memorizzazione Acetobacteraceae influenza lipidi (trigliceridi) in Drosophila 15-18. Se Acetobacteraceae sono più abbondanti nella mosche di una fiala che in un altro 19, mosche isogenici possono avere diversi fenotipi 20. Una soluzione per il problema del microbiota incostanza nei topi 14 è stato in pratica dal 1960, con l'introduzione di una comunità definita di 8 specie microbiche dominanti per cuccioli di topo ogni nuova generazione (alterata Schaedler flora),assicurando che ogni cucciolo è esposto agli stessi membri chiave del microbiota del mouse. Questa pratica controlla per la composizione microbica anche quando il microbiota non è l'obiettivo primario di studio 32, e imposta precedente per assicurare la presenza di microbi chiave in una varietà di condizioni sperimentali.
Per definire l'influenza dei microbi sulla Drosophila nutrizione, diversi protocolli per derivare linee di volo axenici sono state sviluppate, compresa ipoclorito dechorionation di embrioni (sia derivato de novo ogni generazione o mantenuta generationally mediante trasferimento diete sterili) e trattamento antibiotico 13. Ci sono benefici per diversi approcci, come la facilità e rapidità sia per il trattamento di antibiotici e di trasferimento seriale, contro un maggior controllo delle variabili confondenti con de novo dechorionation (ad esempio, la densità d'uovo, i microbi contaminanti residui, fuori bersaglio effetti antibiotici). Indipendentemente dal metodo dipreparazione, introduzione di specie microbiche specificati axeniche embrioni permette cultura della Drosophila con definite le comunità ( 'gnotobiotic'). In alternativa, mimando l'uso di flora Schaedler, questa comunità potrebbe essere inoculato alle uova convenzionalmente stabilite (seguenti passaggi 6-7 solo) per assicurare la presenza di microbi trait-influenzano in ogni flacone ed evitare complicazioni del microbiota incostanza. Qui si descrive il protocollo per l'allevamento axeniche e gnotobiotic Drosophila da de novo dechorionation di embrioni, e per confermare la presenza di introdotto o contaminazione microbica taxa.
Protocol
Representative Results
Discussion
Il metodo qui descritto è uno dei diversi approcci per embrione dechorionation 8,11,18,25,26,27, insieme con altri metodi di allevamento mosche axeniche, tra cui il trasferimento seriale di adulti axeniche 18,27 o 13,18 trattamento antibiotico. Altri metodi includono dechorionation lavaggi etanolo e ridurre 11,25,26 o estendono 8 Trattamento ipoclorito. Diverse fasi di lavaggio può essere di aiuto l'allevamento di diversi genotipi mosca: in un precedente…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Alcuni dettagli di questo protocollo sono state ottimizzate con l'aiuto del Dr. Adam Dobson, che ha anche fornito utili commenti sul manoscritto. Questo lavoro è stato sostenuto dalla Fondazione per il National Institutes of Health (FNIH) codice di autorizzazione R01GM095372 (JMC, A (CN) W, AJD, e AED). FNIH codice di autorizzazione 1F32GM099374-01 (PDN), e Brigham Young University fondi di avvio (JMC, MLK, MV). costi di pubblicazione sono stati sostenuti dalla Brigham Young University College of Life Sciences e del Dipartimento di Scienze della flora e fauna.
Materials
| Brewer's Yeast | MP Biomedicals, LLC. | 903312 | http://www.mpbio.com/product.php?pid=02903312 |
| Glucose | Sigma Aldrich | 158968-3KG | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/aldrich/158968?lang=en®ion=US |
| Agar | Fisher–Lab Scientific | fly802010 | https://www.fishersci.com/shop/products/drosophila-agar-8-100mesh-10kg/nc9349177 |
| Welch's 100% Grape Juice Concentrate | Walmart or other grocery store | 9116196 | http://www.walmart.com/ip/Welch-s-Frozen-100-Grape-Juice-Concentrate-11.5-oz/10804406 |
| Cage: 32 oz. Translucent Round Deli Container | Webstaurant Store | 999L5032Y | http://www.webstaurantstore.com/newspring-delitainer-sd5032y-32-oz-translucent-round-deli-container-24-pack/999L5032Y.html |
| Translucent Round Deli Container Lid | Webstaurant Store | 999YNL500 | http://www.webstaurantstore.com/newspring-delitainer-ynl500-translucent-round-deli-container-lid-60-pack/999YNL500.html |
| Stock Bottles | Genesee Scientific | 32-130 | https://geneseesci.com/shop-online/product-details/?product=32-130 |
| Droso-Plugs | Genesee Scientific | 49-101 | https://geneseesci.com/shop-online/product-details/?product=49-101 |
| Nylon Mesh | Genesee Scientific | 57-102 | https://geneseesci.com/shop-online/product-details/715/?product=57-102 |
| Plastic Bushing | Home Depot | 100343125 | http://www.homedepot.com/p/Halex-2-1-2-in-Rigid-Insulated-Plastic-Bushing-75225/100343125 |
| Specimen Cup | MedSupply Partners | K01-207067 | http://www.medsupplypartners.com/covidien-specimen-containers.html |
| Repeater M4 | Eppendorf | 4982000322 | https://online-shop.eppendorf.us/US-en/Manual-Liquid-Handling-44563/Dispensers–Burettes-44566/Repeater-M4-PF-44619.html |
| 50 ml Centrifuge Tubes | Laboratory Product Sales | TR2003 | https://www.lpsinc.com/Catalog4.asp?catalog_nu=TR2003 |
| Food Boxes | USA Scientific | 2316-5001 | http://www.usascientific.com/search.aspx?find=2316-5001 |
| Lysing Matrix D Bulk | MP Biomedicals, LLC. | 116540434 | http://www.mpbio.com/search.php?q=6540-434&s=Search |
| Filter Pipette Tips, 300μl | USA Scientific | 1120-9810 | http://www.usascientific.com/search.aspx?find=1120-9810 |
| Petri Dishes | Laboratory Product Sales | M089303 | https://www.lpsinc.com/Catalog4.asp?catalog_nu=M089303 |
| Ethanol | Decon Laboratories, INC. | 2701 | http://www.deconlabs.com/products.php?ID=88 |
| Paintbrush | Walmart | 5133 | http://www.walmart.com/ip/Chenille-Kraft-5133-Acrylic-Handled-Brush-Set-Assorted-Sizes-colors-8-Brushes-set/41446005 |
| Forceps | Fisher | 08-882 | https://www.fishersci.com/shop/products/fisherbrand-medium-pointed-forceps-3/p-128693 |
| Household Bleach (6-8% Hypochlorite) | Walmart | 550646751 | http://www.walmart.com/ip/Clorox-Concentrated-Regular-Bleach-121-fl-oz/21618295 |
| Universal Peptone | Genesee Scientific | 20-260 | https://geneseesci.com/shop-online/product-details/?product=20-260 |
| Yeast Extract | Fisher Scientific | BP1422-500 | https://www.fishersci.com/shop/products/fisher-bioreagents-microbiology-media-additives-yeast-extract-3/bp1422500?matchedCatNo=BP1422500 |
| Dipotassium Phosphate | Sigma Aldrich | P3786-1KG | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/search?term=P3786-1KG&interface=All&N=0&mode=match%20partialmax&lang=en®ion=US&focus=product |
| Ammonium Citrate | Sigma Aldrich | 25102-500g | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/search?term=25102-500g&interface=All&N=0&mode=match%20partialmax&lang=en®ion=US&focus=product |
| Sodium Acetate | VWR | 97061-994 | https://us.vwr.com/store/catalog/product.jsp?catalog_number=97061-994 |
| Magnesium Sulfate | Fisher Scientific | M63-500 | https://www.fishersci.com/shop/products/magnesium-sulfate-heptahydrate-crystalline-certified-acs-fisher-chemical-3/m63500?matchedCatNo=M63500 |
| Manganese Sulfate | Sigma Aldrich | 10034-96-5 | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/search?term=10034-96-5&interface=CAS%20No.&N=0&mode=match%20partialmax&lang=en®ion=US&focus=product |
| MRS Powder | Sigma Aldrich | 69966-500G | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sial/69966?lang=en®ion=US |
| 96 Well Plate Reader | BioTek (Epoch) | NA | http://www.biotek.com/products/microplate_detection/epoch_microplate_spectrophotometer.html |
| 1.7 ml Centrifuge Tubes | USA Scientific | 1615-5500 | http://www.usascientific.com/search.aspx?find=1615-5500 |
| Filter Pipette Tips, 1000μl | USA Scientific | 1122-1830 | http://www.usascientific.com/search.aspx?find=1122-1830 |
| 96 Well Plates | Greiner Bio-One | 655101 | https://shop.gbo.com/en/usa/articles/catalogue/article/0110_0040_0120_0010/13243/ |
| Ceramic Beads | MP Biomedicals, LLC. | 6540-434 | http://www.mpbio.com/product.php?pid=116540434 |
| Tissue Homogenizer | MP Biomedicals, LLC. | 116004500 | http://www.mpbio.com/product.php?pid=116004500 |
| Class 1 BioSafety Cabinet | Thermo Scientific | Model 1395 | http://www.thermoscientific.com/en/product/1300-series-class-ii-type-a2-biological-safety-cabinet-packages.html |
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