Elevando a mosca da fruta<em> Drosophila melanogaster</em> Sob axênicas e gnotobióticos Condições
Summary
Um método para a criação de Drosophila melanogaster sob condições axénicas e gnotobióticos é apresentada. embriões voam são dechorionated em hipoclorito de sódio, transferidos assepticamente à dieta estéril, e criados em recipientes fechados. Inoculando dieta e embriões com bactérias leva a associações gnotobióticos e presença de bactérias é confirmada por plaqueamento de corpo inteiro de Drosophila homogeneizados.
Abstract
The influence of microbes on myriad animal traits and behaviors has been increasingly recognized in recent years. The fruit fly Drosophila melanogaster is a model for understanding microbial interactions with animal hosts, facilitated by approaches to rear large sample sizes of Drosophila under microorganism-free (axenic) conditions, or with defined microbial communities (gnotobiotic). This work outlines a method for collection of Drosophila embryos, hypochlorite dechorionation and sterilization, and transfer to sterile diet. Sterilized embryos are transferred to sterile diet in 50 ml centrifuge tubes, and developing larvae and adults remain free of any exogenous microbes until the vials are opened. Alternatively, flies with a defined microbiota can be reared by inoculating sterile diet and embryos with microbial species of interest. We describe the introduction of 4 bacterial species to establish a representative gnotobiotic microbiota in Drosophila. Finally, we describe approaches for confirming bacterial community composition, including testing if axenic Drosophila remain bacteria-free into adulthood.
Introduction
A maioria dos animais estão intimamente associados com bactérias ( 'microbiota') desde o nascimento até a morte 1. Comparações de ( "convencional") animais livres de microrganismos ( 'axênico') e associada a microorganismos têm demonstrado micróbios influenciar diversos aspectos da saúde animal, incluindo metabólica, nutricional, vascular, hepática, respiratória, imunológicos, endócrino e função neurológica 2. A mosca da fruta Drosophila melanogaster é um modelo fundamental para a compreensão de muitos desses processos na presença de micróbios 3,4 e para o estudo da influência microbiota em 5,6 a saúde animal. Nenhuma espécie bacteriana está presente em cada indivíduo ( 'core'), mas Acetobacter e Lactobacillus espécies numericamente dominar a microbiota de ambos D. pego wild-criados em laboratório e melanogaster. Outros Acetobacteraceae (incluindo Komagataeibacter e Gluconobacter), Firmicútis (tais como Enterococcus e Leuconostoc) e Enterobacteriaceae ou são frequentemente presentes em indivíduos de Drosophila em baixa abundância, ou irregularmente presente em grande abundância 7-12.
A microbiota de Drosophila e mamíferos é inconstante dentro e entre gerações 14,19. Microbiota inconstância pode levar ao ruído fenotípica ao medir traços dependente da microbiota. Por exemplo, o armazenamento Acetobacteraceae influência lipídico (triglicéridos) em Drosophila 15-18. Se Acetobacteraceae são mais abundantes em moscas de um frasco do que nos outros 19, moscas isogênicos podem ter diferentes fenótipos 20. Uma solução para o problema da inconstância microbiota em camundongos 14 tem sido na prática desde 1960, através da introdução de uma comunidade definida de 8 espécies microbianas dominantes para filhotes de rato cada nova geração (alterada SCHAEDLER flora),garantindo que cada filhote está exposto aos mesmos membros-chave da microbiota mouse. Esta prática controla a composição da microbiota, mesmo quando a microbiota não é o alvo primário do estudo 32, e define precedente para assegurar a presença de micróbios chave numa variedade de condições experimentais.
Para definir a influência de micróbios em Drosophila nutrição, vários protocolos para derivar linhas mosca axênicas têm sido desenvolvidos, incluindo dechorionation hipoclorito de embriões (derivada quer de novo cada geração ou mantida generationally por transferência para uma alimentação esterilizada) e 13 tratamento com antibióticos. Há benefícios para diferentes abordagens, tais como a facilidade e rapidez para os dois tratamentos antibióticos e transferência de série, contra um maior controle de variáveis de confusão com de novo dechorionation (por exemplo, densidade de ovos, micróbios contaminantes residuais, longe do alvo efeitos antibióticos). Independentemente do método depreparação, a introdução de espécies microbianas especificados para axênicas embriões permite cultura de Drosophila com as comunidades ( 'gnotobióticos') definidas. Alternativamente, imitando o uso de flora SCHAEDLER, esta comunidade poderia ser inoculado aos ovos convencionalmente-estabelecidas (seguindo os passos 6-7 somente) para assegurar a presença de micróbios que influenciam a característica em cada frasco e evitar complicações da inconstância microbiota. Aqui descrevemos o protocolo para elevar e gnotobiótico axénica de Drosophila por dechorionation de novo de embriões e para a confirmação da presença dos taxa microbiana introduzido ou contaminantes.
Protocol
Representative Results
Discussion
O método descrito aqui é uma das várias abordagens para embrião dechorionation 8,11,18,25,26,27, juntamente com métodos alternativos de criação de moscas axênicas, incluindo a transferência de série dos adultos axênicas 18,27 ou tratamento antibiótico 13,18. Outros métodos incluem dechorionation lavagens de etanol e reduzir ou estender 11,25,26 8 tratamento de hipoclorito. Diferentes etapas de lavagem pode auxiliar criação de diferentes genótip…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Alguns detalhes deste protocolo foram otimizados com a assistência do Dr. Adam Dobson, que também forneceram comentários úteis sobre o manuscrito. Este trabalho foi financiado pela Fundação para o National Institutes of Health (FNIH) número de concessão R01GM095372 (JMC, A (CN) W, AJD, e AED). FNIH número de concessão 1F32GM099374-01 (PDN) e da Universidade Brigham Young fundos de inicialização (JMC, MLK, MV). Os custos de publicação foram apoiadas pela Academia Brigham Young University de Ciências da Vida e do Departamento de plantas e animais selvagens Sciences.
Materials
| Brewer's Yeast | MP Biomedicals, LLC. | 903312 | http://www.mpbio.com/product.php?pid=02903312 |
| Glucose | Sigma Aldrich | 158968-3KG | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/aldrich/158968?lang=en®ion=US |
| Agar | Fisher–Lab Scientific | fly802010 | https://www.fishersci.com/shop/products/drosophila-agar-8-100mesh-10kg/nc9349177 |
| Welch's 100% Grape Juice Concentrate | Walmart or other grocery store | 9116196 | http://www.walmart.com/ip/Welch-s-Frozen-100-Grape-Juice-Concentrate-11.5-oz/10804406 |
| Cage: 32 oz. Translucent Round Deli Container | Webstaurant Store | 999L5032Y | http://www.webstaurantstore.com/newspring-delitainer-sd5032y-32-oz-translucent-round-deli-container-24-pack/999L5032Y.html |
| Translucent Round Deli Container Lid | Webstaurant Store | 999YNL500 | http://www.webstaurantstore.com/newspring-delitainer-ynl500-translucent-round-deli-container-lid-60-pack/999YNL500.html |
| Stock Bottles | Genesee Scientific | 32-130 | https://geneseesci.com/shop-online/product-details/?product=32-130 |
| Droso-Plugs | Genesee Scientific | 49-101 | https://geneseesci.com/shop-online/product-details/?product=49-101 |
| Nylon Mesh | Genesee Scientific | 57-102 | https://geneseesci.com/shop-online/product-details/715/?product=57-102 |
| Plastic Bushing | Home Depot | 100343125 | http://www.homedepot.com/p/Halex-2-1-2-in-Rigid-Insulated-Plastic-Bushing-75225/100343125 |
| Specimen Cup | MedSupply Partners | K01-207067 | http://www.medsupplypartners.com/covidien-specimen-containers.html |
| Repeater M4 | Eppendorf | 4982000322 | https://online-shop.eppendorf.us/US-en/Manual-Liquid-Handling-44563/Dispensers–Burettes-44566/Repeater-M4-PF-44619.html |
| 50 ml Centrifuge Tubes | Laboratory Product Sales | TR2003 | https://www.lpsinc.com/Catalog4.asp?catalog_nu=TR2003 |
| Food Boxes | USA Scientific | 2316-5001 | http://www.usascientific.com/search.aspx?find=2316-5001 |
| Lysing Matrix D Bulk | MP Biomedicals, LLC. | 116540434 | http://www.mpbio.com/search.php?q=6540-434&s=Search |
| Filter Pipette Tips, 300μl | USA Scientific | 1120-9810 | http://www.usascientific.com/search.aspx?find=1120-9810 |
| Petri Dishes | Laboratory Product Sales | M089303 | https://www.lpsinc.com/Catalog4.asp?catalog_nu=M089303 |
| Ethanol | Decon Laboratories, INC. | 2701 | http://www.deconlabs.com/products.php?ID=88 |
| Paintbrush | Walmart | 5133 | http://www.walmart.com/ip/Chenille-Kraft-5133-Acrylic-Handled-Brush-Set-Assorted-Sizes-colors-8-Brushes-set/41446005 |
| Forceps | Fisher | 08-882 | https://www.fishersci.com/shop/products/fisherbrand-medium-pointed-forceps-3/p-128693 |
| Household Bleach (6-8% Hypochlorite) | Walmart | 550646751 | http://www.walmart.com/ip/Clorox-Concentrated-Regular-Bleach-121-fl-oz/21618295 |
| Universal Peptone | Genesee Scientific | 20-260 | https://geneseesci.com/shop-online/product-details/?product=20-260 |
| Yeast Extract | Fisher Scientific | BP1422-500 | https://www.fishersci.com/shop/products/fisher-bioreagents-microbiology-media-additives-yeast-extract-3/bp1422500?matchedCatNo=BP1422500 |
| Dipotassium Phosphate | Sigma Aldrich | P3786-1KG | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/search?term=P3786-1KG&interface=All&N=0&mode=match%20partialmax&lang=en®ion=US&focus=product |
| Ammonium Citrate | Sigma Aldrich | 25102-500g | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/search?term=25102-500g&interface=All&N=0&mode=match%20partialmax&lang=en®ion=US&focus=product |
| Sodium Acetate | VWR | 97061-994 | https://us.vwr.com/store/catalog/product.jsp?catalog_number=97061-994 |
| Magnesium Sulfate | Fisher Scientific | M63-500 | https://www.fishersci.com/shop/products/magnesium-sulfate-heptahydrate-crystalline-certified-acs-fisher-chemical-3/m63500?matchedCatNo=M63500 |
| Manganese Sulfate | Sigma Aldrich | 10034-96-5 | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/search?term=10034-96-5&interface=CAS%20No.&N=0&mode=match%20partialmax&lang=en®ion=US&focus=product |
| MRS Powder | Sigma Aldrich | 69966-500G | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sial/69966?lang=en®ion=US |
| 96 Well Plate Reader | BioTek (Epoch) | NA | http://www.biotek.com/products/microplate_detection/epoch_microplate_spectrophotometer.html |
| 1.7 ml Centrifuge Tubes | USA Scientific | 1615-5500 | http://www.usascientific.com/search.aspx?find=1615-5500 |
| Filter Pipette Tips, 1000μl | USA Scientific | 1122-1830 | http://www.usascientific.com/search.aspx?find=1122-1830 |
| 96 Well Plates | Greiner Bio-One | 655101 | https://shop.gbo.com/en/usa/articles/catalogue/article/0110_0040_0120_0010/13243/ |
| Ceramic Beads | MP Biomedicals, LLC. | 6540-434 | http://www.mpbio.com/product.php?pid=116540434 |
| Tissue Homogenizer | MP Biomedicals, LLC. | 116004500 | http://www.mpbio.com/product.php?pid=116004500 |
| Class 1 BioSafety Cabinet | Thermo Scientific | Model 1395 | http://www.thermoscientific.com/en/product/1300-series-class-ii-type-a2-biological-safety-cabinet-packages.html |
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