L'élevage du Fruit Fly<em> Drosophila melanogaster</em> Sous axéniques et gnotobiotique Conditions
Summary
Une méthode pour l' élevage Drosophila melanogaster dans des conditions axéniques et gnotobiotiques est présenté. Fly embryons sont dechorionated dans l'hypochlorite de sodium, transférés de manière aseptique à l'alimentation stérile, et élevés dans des récipients fermés. Inoculant régime alimentaire et les embryons avec des bactéries conduit à des associations gnotobiotiques, et la présence bactérienne est confirmée par plaquage du corps entier homogénats drosophile.
Abstract
The influence of microbes on myriad animal traits and behaviors has been increasingly recognized in recent years. The fruit fly Drosophila melanogaster is a model for understanding microbial interactions with animal hosts, facilitated by approaches to rear large sample sizes of Drosophila under microorganism-free (axenic) conditions, or with defined microbial communities (gnotobiotic). This work outlines a method for collection of Drosophila embryos, hypochlorite dechorionation and sterilization, and transfer to sterile diet. Sterilized embryos are transferred to sterile diet in 50 ml centrifuge tubes, and developing larvae and adults remain free of any exogenous microbes until the vials are opened. Alternatively, flies with a defined microbiota can be reared by inoculating sterile diet and embryos with microbial species of interest. We describe the introduction of 4 bacterial species to establish a representative gnotobiotic microbiota in Drosophila. Finally, we describe approaches for confirming bacterial community composition, including testing if axenic Drosophila remain bacteria-free into adulthood.
Introduction
La plupart des animaux sont intimement associés à des bactéries ( «microbiote») de la naissance à la mort 1. Les comparaisons de ( «classique») des animaux exempts de micro – organismes ( 'axénique') et un micro-organisme associé ont montré microbes influencent divers aspects de la santé animale, y compris métabolique, nutritionnel, vasculaire, hépatique, respiratoire, immunologique, endocrinien, et la fonction neurologique 2. La mouche des fruits Drosophila melanogaster est un modèle clé pour comprendre un grand nombre de ces processus dans la présence de microbes 3,4 et pour l' étude microbiote influence sur 5,6 de la santé animale. Aucune espèce bactérienne est présente dans chaque individu ( «noyau»), mais les espèces Acetobacter et Lactobacillus dominent numériquement le microbiote des deux élevés en laboratoire et sauvages capturés D. melanogaster. Acetobacteraceae autres (y compris Komagataeibacter et Gluconobacter) Firmicutes (comme Enterococcus et Leuconostoc), et entérobactéries sont soit souvent présent chez les individus de drosophile à faible abondance, ou irrégulièrement présent à forte abondance 7-12.
Le microbiote de la drosophile et les mammifères est inconstante au sein et à travers les générations 14,19. Microbiota inconsistance peut conduire à un bruit phénotypique lors de la mesure des traits de microbiote-dépendants. Par exemple, le stockage Acetobacteraceae influence lipides (triglycérides) chez la drosophile 15-18. Si Acetobacteraceae sont plus abondants dans les mouches d'un flacon que dans un autre 19, les mouches isogéniques peuvent avoir différents phénotypes 20. Une solution pour le problème de microbiote inconsistance chez la souris 14 a été dans la pratique depuis les années 1960, par l' introduction d' une communauté définie de 8 espèces microbiennes dominantes souriceaux chaque nouvelle génération (modifié la flore SCHAEDLER),veiller à ce que chaque chiot est exposé aux mêmes membres clés de la microflore de la souris. Cette pratique contrôle de la composition du microbiote même lorsque le microbiote est pas la cible principale de l' étude 32, et crée un précédent pour assurer la présence de microbes clés dans une variété de conditions expérimentales.
Pour définir l'influence des microbes sur la drosophile nutrition, plusieurs protocoles pour dériver des lignes de mouche axéniques ont été mis au point, y compris l' hypochlorite dechorionation d'embryons (soit dérivée de novo chaque génération ou maintenu generations par transfert à des régimes alimentaires stériles) et un traitement antibiotique 13. Il y a des avantages à différentes approches, telles que la facilité et la rapidité à la fois du traitement aux antibiotiques et transfert en série, par rapport à un plus grand contrôle des variables confondantes avec de novo dechorionation (par exemple, la densité des oeufs, des microbes contaminants résiduels, les effets hors-cible d' antibiotiques). Indépendamment de la méthode dela préparation, l' introduction d'espèces microbiennes spécifiées aux axéniques embryons permet la culture de Drosophila avec les communautés ( 'gnotobiotiques') définis. Alternativement, imitant l'utilisation de la flore SCHAEDLER, cette communauté pourrait être inoculé aux œufs conventionnellement fixées (en suivant les étapes 6-7 seulement) pour assurer la présence de microbes de traits influençant dans chaque flacon et éviter les complications de microbiote inconsistance. Nous décrivons ici le protocole pour élever axénique et gnotobiotique Drosophila par de novo dechorionation d'embryons, et pour confirmer la présence de taxons microbien introduit ou contaminant.
Protocol
Representative Results
Discussion
La méthode décrite ici est l' une de plusieurs approches pour l' embryon dechorionation 8,11,18,25,26,27, ainsi que d' autres méthodes d'élevage des mouches axéniques, y compris le transfert série des adultes axéniques 18,27 ou un traitement antibiotique 13,18. D' autres méthodes de dechorionation comprennent des lavages à l'éthanol et à réduire les 11,25,26 ou étendent 8 traitement hypochlorite. Étapes de lavage différen…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Certains détails de ce protocole ont été optimisés avec l'aide du Dr Adam Dobson, qui a également fourni des commentaires utiles sur le manuscrit. Ce travail a été soutenu par la Fondation pour les National Institutes of Health (SPNI) numéro de subvention R01GM095372 (JMC, A (CN) W, AJD et AED). SPNI numéro de subvention 1F32GM099374-01 (PDN), et Brigham Young University démarrage des fonds (JMC, MLK, MV). Les frais de publication ont été soutenus par le Collège universitaire Brigham Young Life Sciences et du ministère des plantes et de la faune Sciences.
Materials
| Brewer's Yeast | MP Biomedicals, LLC. | 903312 | http://www.mpbio.com/product.php?pid=02903312 |
| Glucose | Sigma Aldrich | 158968-3KG | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/aldrich/158968?lang=en®ion=US |
| Agar | Fisher–Lab Scientific | fly802010 | https://www.fishersci.com/shop/products/drosophila-agar-8-100mesh-10kg/nc9349177 |
| Welch's 100% Grape Juice Concentrate | Walmart or other grocery store | 9116196 | http://www.walmart.com/ip/Welch-s-Frozen-100-Grape-Juice-Concentrate-11.5-oz/10804406 |
| Cage: 32 oz. Translucent Round Deli Container | Webstaurant Store | 999L5032Y | http://www.webstaurantstore.com/newspring-delitainer-sd5032y-32-oz-translucent-round-deli-container-24-pack/999L5032Y.html |
| Translucent Round Deli Container Lid | Webstaurant Store | 999YNL500 | http://www.webstaurantstore.com/newspring-delitainer-ynl500-translucent-round-deli-container-lid-60-pack/999YNL500.html |
| Stock Bottles | Genesee Scientific | 32-130 | https://geneseesci.com/shop-online/product-details/?product=32-130 |
| Droso-Plugs | Genesee Scientific | 49-101 | https://geneseesci.com/shop-online/product-details/?product=49-101 |
| Nylon Mesh | Genesee Scientific | 57-102 | https://geneseesci.com/shop-online/product-details/715/?product=57-102 |
| Plastic Bushing | Home Depot | 100343125 | http://www.homedepot.com/p/Halex-2-1-2-in-Rigid-Insulated-Plastic-Bushing-75225/100343125 |
| Specimen Cup | MedSupply Partners | K01-207067 | http://www.medsupplypartners.com/covidien-specimen-containers.html |
| Repeater M4 | Eppendorf | 4982000322 | https://online-shop.eppendorf.us/US-en/Manual-Liquid-Handling-44563/Dispensers–Burettes-44566/Repeater-M4-PF-44619.html |
| 50 ml Centrifuge Tubes | Laboratory Product Sales | TR2003 | https://www.lpsinc.com/Catalog4.asp?catalog_nu=TR2003 |
| Food Boxes | USA Scientific | 2316-5001 | http://www.usascientific.com/search.aspx?find=2316-5001 |
| Lysing Matrix D Bulk | MP Biomedicals, LLC. | 116540434 | http://www.mpbio.com/search.php?q=6540-434&s=Search |
| Filter Pipette Tips, 300μl | USA Scientific | 1120-9810 | http://www.usascientific.com/search.aspx?find=1120-9810 |
| Petri Dishes | Laboratory Product Sales | M089303 | https://www.lpsinc.com/Catalog4.asp?catalog_nu=M089303 |
| Ethanol | Decon Laboratories, INC. | 2701 | http://www.deconlabs.com/products.php?ID=88 |
| Paintbrush | Walmart | 5133 | http://www.walmart.com/ip/Chenille-Kraft-5133-Acrylic-Handled-Brush-Set-Assorted-Sizes-colors-8-Brushes-set/41446005 |
| Forceps | Fisher | 08-882 | https://www.fishersci.com/shop/products/fisherbrand-medium-pointed-forceps-3/p-128693 |
| Household Bleach (6-8% Hypochlorite) | Walmart | 550646751 | http://www.walmart.com/ip/Clorox-Concentrated-Regular-Bleach-121-fl-oz/21618295 |
| Universal Peptone | Genesee Scientific | 20-260 | https://geneseesci.com/shop-online/product-details/?product=20-260 |
| Yeast Extract | Fisher Scientific | BP1422-500 | https://www.fishersci.com/shop/products/fisher-bioreagents-microbiology-media-additives-yeast-extract-3/bp1422500?matchedCatNo=BP1422500 |
| Dipotassium Phosphate | Sigma Aldrich | P3786-1KG | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/search?term=P3786-1KG&interface=All&N=0&mode=match%20partialmax&lang=en®ion=US&focus=product |
| Ammonium Citrate | Sigma Aldrich | 25102-500g | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/search?term=25102-500g&interface=All&N=0&mode=match%20partialmax&lang=en®ion=US&focus=product |
| Sodium Acetate | VWR | 97061-994 | https://us.vwr.com/store/catalog/product.jsp?catalog_number=97061-994 |
| Magnesium Sulfate | Fisher Scientific | M63-500 | https://www.fishersci.com/shop/products/magnesium-sulfate-heptahydrate-crystalline-certified-acs-fisher-chemical-3/m63500?matchedCatNo=M63500 |
| Manganese Sulfate | Sigma Aldrich | 10034-96-5 | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/search?term=10034-96-5&interface=CAS%20No.&N=0&mode=match%20partialmax&lang=en®ion=US&focus=product |
| MRS Powder | Sigma Aldrich | 69966-500G | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sial/69966?lang=en®ion=US |
| 96 Well Plate Reader | BioTek (Epoch) | NA | http://www.biotek.com/products/microplate_detection/epoch_microplate_spectrophotometer.html |
| 1.7 ml Centrifuge Tubes | USA Scientific | 1615-5500 | http://www.usascientific.com/search.aspx?find=1615-5500 |
| Filter Pipette Tips, 1000μl | USA Scientific | 1122-1830 | http://www.usascientific.com/search.aspx?find=1122-1830 |
| 96 Well Plates | Greiner Bio-One | 655101 | https://shop.gbo.com/en/usa/articles/catalogue/article/0110_0040_0120_0010/13243/ |
| Ceramic Beads | MP Biomedicals, LLC. | 6540-434 | http://www.mpbio.com/product.php?pid=116540434 |
| Tissue Homogenizer | MP Biomedicals, LLC. | 116004500 | http://www.mpbio.com/product.php?pid=116004500 |
| Class 1 BioSafety Cabinet | Thermo Scientific | Model 1395 | http://www.thermoscientific.com/en/product/1300-series-class-ii-type-a2-biological-safety-cabinet-packages.html |
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