JoVE Journal > Developmental Biology
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
Automatic Translation
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Developmental Biology

Uppfödning bananfluga<em> Drosophila melanogaster</em> Under axenisk och gnotobiotiska Villkor

Published: July 30, 2016
doi:
10.3791/54219
, , , , , ,
1Department of Plant and Wildlife Sciences,Brigham Young University, 2Department of Entomology,Cornell University, 3Department of Molecular Biology and Genetics,Cornell University, 4Division of Infectious Diseases, Boston Children’s Hospital,Harvard Medical School, 5Biological Sciences,SUNY Oswego

Summary

En metod för uppfödning Drosophila melanogaster enligt axenisk och gnotobiotiska villkor presenteras. Fly embryon dechorionated natriumhypoklorit, överfördes aseptiskt till sterila diet, och föds upp i slutna behållare. Ympning kost och embryon med bakterier leder till gnotobiotiska föreningar, och bakteriell närvaro bekräftas genom plätering hela kroppen Drosophila homogen.

Abstract

The influence of microbes on myriad animal traits and behaviors has been increasingly recognized in recent years. The fruit fly Drosophila melanogaster is a model for understanding microbial interactions with animal hosts, facilitated by approaches to rear large sample sizes of Drosophila under microorganism-free (axenic) conditions, or with defined microbial communities (gnotobiotic). This work outlines a method for collection of Drosophila embryos, hypochlorite dechorionation and sterilization, and transfer to sterile diet. Sterilized embryos are transferred to sterile diet in 50 ml centrifuge tubes, and developing larvae and adults remain free of any exogenous microbes until the vials are opened. Alternatively, flies with a defined microbiota can be reared by inoculating sterile diet and embryos with microbial species of interest. We describe the introduction of 4 bacterial species to establish a representative gnotobiotic microbiota in Drosophila. Finally, we describe approaches for confirming bacterial community composition, including testing if axenic Drosophila remain bacteria-free into adulthood.

Introduction

De flesta djur är intimt förknippade med bakterier (mikroorganismer) från födseln till döden 1. Jämförelser av mikroorganismer fria (axenisk ") och mikroorganismassocierade (" konventionella ") djur har visat mikrober påverkar olika aspekter av djurhälsa, inklusive metaboliska, näringsmässiga, vaskulär, lever-, respiratoriska, immunologiska, endokrina och neurologisk funktion 2. Bananflugan Drosophila melanogaster är en viktig modell för att förstå många av dessa processer i närvaro av mikrober 3,4 och för att studera mikrobiota inverkan på djurhälsa 5,6. Inga bakteriearter finns i varje individ ( "kärna"), men Acetobacter och Lactobacillus arter dominerar numeriskt mikrobiota av både laboratorie uppfödda och vildfångad D. melanogaster. Andra Acetobacteraceae (inklusive Komagataeibacter och Gluconobacter), Firmicutes (t.ex. Enterococcus och Leuconostoc), och Enterobacteriaceae är antingen ofta förekommer i Drosophila individer med låg förekomst, eller oregelbundet närvarande vid hög förekomst 7-12.

Mikrobiota av Drosophila och däggdjur obeständig inom och mellan generationer 14,19. Mikrobiota förgänglighet kan leda till fenotypisk buller vid mätning mikrobiota beroende egenskaper. Till exempel Acetobacteraceae inflytande lipid (triglycerider) lagring i Drosophila 15-18. Om Acetobacteraceae är mer rikligt i flugor i en flaska än i en annan 19, kan isogena flugor ha olika fenotyper 20. En lösning på problemet med mikrobiota förgänglighet i möss 14 har i praktiken sedan 1960-talet, genom att införa en definierad gemenskap av 8 dominerande mikrobiella arter mus valpar varje ny generation (förändrad Schaedler flora),se till att varje valp utsätts för samma nyckelpersoner i musen mikroorganismer. Denna praxis kontroller för mikrobiota sammansättningen även när mikrobiota är inte det primära målet för studien 32, och sätter prejudikat för att säkerställa förekomsten av viktiga mikrober i en mängd olika experimentella betingelser.

För att definiera påverkan av mikrober på Drosophila näring har flera protokoll för att härleda axenisk fluglinor utvecklats, bland annat hypoklorit dechorionation av embryon (antingen härrör de novo varje generation eller underhålls generationally genom överföring till sterila dieter) och antibiotikabehandling 13. Det finns fördelar för olika metoder, såsom lätthet och snabbhet för både av antibiotika behandling och seriell överföring, jämfört med större kontroll över störande variabler med de novo dechorionation (t.ex. ägg densitet, restkontaminerande mikrober, off-target antibiotika effekter). Oberoende av metoden förberedning, införandet av specificerade mikrobiella arter axenisk embryon tillåter odling av Drosophila med definierade ( "gnotobiotiska) samhällen. Alternativt imitera användningen av Schaedler flora, denna gemenskap kan ympas till konventionellt som ägg (efter steg 6-7) för att säkerställa närvaron av egenskapspåverkande mikrober i varje flaska och undvika komplikationer av mikrobiota förgänglighet. Här beskriver vi protokoll för att höja axenisk och gnotobiotisk Drosophila av de novo dechorionation av embryon, och för att bekräfta närvaron av infört eller kontaminerande mikrobiella taxa.

Protocol

1. Kultur Bakterier (Start ~ 1 vecka innan plocka ägg) Förbered modifierad MRS 20 (mMRS) plattor och buljong rör (Tabell 1). Häll 20 ml mMRS agar i varje 100 mm petriplatta och låt svalna / torka över natten, eller 5 ml mMRS buljong i 18 mm provrör. Strimma Acetobacter pomorum, A. tropicalis, Lactobacillus brevis, och L. plantarum på mMRS agarplattor. Inkubera Acetobacter natten vid 30 ° C. Inkubera Lactobacillus</…

Representative Results

Framgångsrik uppfödning av axenisk flugor bekräftas genom isolering av någon CFU från hela kroppen homogenizations av D. melanogaster vuxna (Figur 1). Alternativt, om det pläterade homogenatet ger kolonier, är flaskorna förorenade och måste kasseras. För gnotobiotiska flugor, var och en av de fyra bakterieisolat isolerades från pooler av 5 vuxna hannar, vilket visar skillnader i totala viabla CFUs associerade med vuxna flugor (Figur 1).</stron…

Discussion

Den metod som beskrivs här är en av flera metoder för embryo dechorionation 8,11,18,25,26,27, tillsammans med alternativa metoder för uppfödning axenisk flugor, inklusive seriell överföring av axenisk vuxna 18,27 eller antibiotikabehandling 13,18. Andra dechorionation metoder inkluderar etanol tvättar och minska 11,25,26 eller förlänga 8 hypoklorit behandling. Olika tvättsteg kan underlätta uppfödning olika flyga genotyper: i en tidigare studie fl…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Vissa detaljer i detta protokoll har optimerats med hjälp av Dr Adam Dobson, som också värdefulla kommentarer på manuskriptet. Detta arbete stöddes av Stiftelsen för National Institutes of Health (FNIH) licensnummer R01GM095372 (JMC, A (CN) W, AJD och AED). FNIH licensnummer 1F32GM099374-01 (PDN), och Brigham Young University startmedel (JMC, MLK, MV). Kostnader för publicering stöddes av Brigham Young University College of Life Sciences och Institutionen för växt- och djurliv Sciences.

Materials

Brewer's Yeast MP Biomedicals, LLC. 903312 http://www.mpbio.com/product.php?pid=02903312
Glucose Sigma Aldrich 158968-3KG http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/aldrich/158968?lang=en&region=US
Agar Fisher–Lab Scientific fly802010 https://www.fishersci.com/shop/products/drosophila-agar-8-100mesh-10kg/nc9349177
Welch's 100% Grape Juice Concentrate Walmart or other grocery store 9116196 http://www.walmart.com/ip/Welch-s-Frozen-100-Grape-Juice-Concentrate-11.5-oz/10804406
Cage: 32 oz. Translucent Round Deli Container Webstaurant Store 999L5032Y http://www.webstaurantstore.com/newspring-delitainer-sd5032y-32-oz-translucent-round-deli-container-24-pack/999L5032Y.html
Translucent Round Deli Container Lid Webstaurant Store 999YNL500 http://www.webstaurantstore.com/newspring-delitainer-ynl500-translucent-round-deli-container-lid-60-pack/999YNL500.html
Stock Bottles Genesee Scientific 32-130 https://geneseesci.com/shop-online/product-details/?product=32-130
Droso-Plugs Genesee Scientific 49-101 https://geneseesci.com/shop-online/product-details/?product=49-101
Nylon Mesh Genesee Scientific 57-102  https://geneseesci.com/shop-online/product-details/715/?product=57-102
Plastic Bushing Home Depot 100343125 http://www.homedepot.com/p/Halex-2-1-2-in-Rigid-Insulated-Plastic-Bushing-75225/100343125
Specimen Cup MedSupply Partners K01-207067 http://www.medsupplypartners.com/covidien-specimen-containers.html
Repeater M4 Eppendorf 4982000322 https://online-shop.eppendorf.us/US-en/Manual-Liquid-Handling-44563/Dispensers–Burettes-44566/Repeater-M4-PF-44619.html
50 ml Centrifuge Tubes Laboratory Product Sales TR2003 https://www.lpsinc.com/Catalog4.asp?catalog_nu=TR2003
Food Boxes USA Scientific 2316-5001 http://www.usascientific.com/search.aspx?find=2316-5001
Lysing Matrix D Bulk MP Biomedicals, LLC. 116540434 http://www.mpbio.com/search.php?q=6540-434&s=Search
Filter Pipette Tips, 300μl USA Scientific 1120-9810 http://www.usascientific.com/search.aspx?find=1120-9810
Petri Dishes Laboratory Product Sales M089303 https://www.lpsinc.com/Catalog4.asp?catalog_nu=M089303
Ethanol Decon Laboratories, INC. 2701 http://www.deconlabs.com/products.php?ID=88
Paintbrush Walmart 5133 http://www.walmart.com/ip/Chenille-Kraft-5133-Acrylic-Handled-Brush-Set-Assorted-Sizes-colors-8-Brushes-set/41446005
Forceps Fisher 08-882 https://www.fishersci.com/shop/products/fisherbrand-medium-pointed-forceps-3/p-128693
Household Bleach (6-8% Hypochlorite) Walmart 550646751 http://www.walmart.com/ip/Clorox-Concentrated-Regular-Bleach-121-fl-oz/21618295
Universal Peptone Genesee Scientific 20-260 https://geneseesci.com/shop-online/product-details/?product=20-260
Yeast Extract  Fisher Scientific BP1422-500 https://www.fishersci.com/shop/products/fisher-bioreagents-microbiology-media-additives-yeast-extract-3/bp1422500?matchedCatNo=BP1422500
Dipotassium Phosphate Sigma Aldrich P3786-1KG http://www.sigmaaldrich.com/catalog/search?term=P3786-1KG&interface=All&N=0&mode=match%20partialmax&lang=en&region=US&focus=product
Ammonium Citrate Sigma Aldrich 25102-500g http://www.sigmaaldrich.com/catalog/search?term=25102-500g&interface=All&N=0&mode=match%20partialmax&lang=en&region=US&focus=product
Sodium Acetate VWR 97061-994 https://us.vwr.com/store/catalog/product.jsp?catalog_number=97061-994
Magnesium Sulfate Fisher Scientific M63-500 https://www.fishersci.com/shop/products/magnesium-sulfate-heptahydrate-crystalline-certified-acs-fisher-chemical-3/m63500?matchedCatNo=M63500
Manganese Sulfate Sigma Aldrich 10034-96-5 http://www.sigmaaldrich.com/catalog/search?term=10034-96-5&interface=CAS%20No.&N=0&mode=match%20partialmax&lang=en&region=US&focus=product
MRS Powder Sigma Aldrich 69966-500G http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sial/69966?lang=en&region=US
96 Well Plate Reader BioTek (Epoch)  NA http://www.biotek.com/products/microplate_detection/epoch_microplate_spectrophotometer.html
1.7 ml Centrifuge Tubes USA Scientific 1615-5500 http://www.usascientific.com/search.aspx?find=1615-5500
Filter Pipette Tips, 1000μl USA Scientific 1122-1830 http://www.usascientific.com/search.aspx?find=1122-1830
96 Well Plates Greiner Bio-One 655101 https://shop.gbo.com/en/usa/articles/catalogue/article/0110_0040_0120_0010/13243/
Ceramic Beads MP Biomedicals, LLC. 6540-434 http://www.mpbio.com/product.php?pid=116540434
Tissue Homogenizer MP Biomedicals, LLC. 116004500 http://www.mpbio.com/product.php?pid=116004500
Class 1 BioSafety Cabinet Thermo Scientific  Model 1395 http://www.thermoscientific.com/en/product/1300-series-class-ii-type-a2-biological-safety-cabinet-packages.html
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. McFall-Ngai, M. J. Giving microbes their due–animal life in a microbially dominant world. J Exp Biol. 218, 1968-1973 (2015).
  2. Smith, K., McCoy, K. D., Macpherson, A. J. Use of axenic animals in studying the adaptation of mammals to their commensal intestinal microbiota. Semin Immunol. 19 (2), 59-69 (2007).
  3. Rieder, L. E., Larschan, E. N. Wisdom from the fly. Trends Genet. 30 (11), 479-481 (2014).
  4. Arias, A. M. Drosophila melanogaster and the development of biology in the 20th century. Methods Mol Biol. 420, 1-25 (2008).
  5. Lee, W. J., Brey, P. T. How microbiomes influence metazoan development: insights from history and Drosophila modeling of gut-microbe interactions. Annu Rev Cell Dev Biol. 29, 571-592 (2013).
  6. Erkosar, B., Leulier, F. Transient adult microbiota, gut homeostasis and longevity: novel insights from the Drosophila model. FEBS Lett. 588 (22), 4250-4257 (2014).
  7. Chandler, J. A., Lang, J. M., Bhatnagar, S., Eisen, J. A., Kopp, A. Bacterial communities of diverse Drosophila species: ecological context of a host-microbe model system. PLoS Genet. 7 (9), e1002272 (2011).
  8. Broderick, N. A., Buchon, N., Lemaitre, B. Microbiota-induced changes in drosophila melanogaster host gene expression and gut morphology. MBio. 5 (3), 01117 (2014).
  9. Wong, C. N., Ng, P., Douglas, A. E. Low-diversity bacterial community in the gut of the fruitfly Drosophila melanogaster. Environ Microbiol. 13 (7), 1889-1900 (2011).
  10. Staubach, F., Baines, J. F., Kunzel, S., Bik, E. M., Petrov, D. A. Host species and environmental effects on bacterial communities associated with Drosophila in the laboratory and in the natural environment. PLoS One. 8 (8), e70749 (2013).
  11. Brummel, T., Ching, A., Seroude, L., Simon, A. F., Benzer, S. Drosophila lifespan enhancement by exogenous bacteria. Proc Natl Acad Sci U S A. 101 (35), 12974-12979 (2004).
  12. Cox, C. R., Gilmore, M. S. Native microbial colonization of Drosophila melanogaster and its use as a model of Enterococcus faecalis pathogenesis. Infect Immun. 75 (4), 1565-1576 (2007).
  13. Ridley, E. V., Wong, A. C., Douglas, A. E. Microbe-dependent and nonspecific effects of procedures to eliminate the resident microbiota from Drosophila melanogaster. Appl Environ Microbiol. 79 (10), 3209-3214 (2013).
  14. Rogers, G. B., et al. Functional divergence in gastrointestinal microbiota in physically-separated genetically identical mice. Sci Rep. 4, 5437 (2014).
  15. Chaston, J. M., Newell, P. D., Douglas, A. E. Metagenome-wide association of microbial determinants of host phenotype in Drosophila melanogaster. MBio. 5 (5), 01631-01714 (2014).
  16. Huang, J. H., Douglas, A. E. Consumption of dietary sugar by gut bacteria determines Drosophila lipid content. Biology Letters. , (2015).
  17. Shin, S. C., et al. Drosophila microbiome modulates host developmental and metabolic homeostasis via insulin signaling. Science. 334 (6056), 670-674 (2011).
  18. Storelli, G., et al. Lactobacillus plantarum promotes Drosophila systemic growth by modulating hormonal signals through TOR-dependent nutrient sensing. Cell Metab. 14 (3), 403-414 (2011).
  19. Wong, A. C., Chaston, J. M., Douglas, A. E. The inconstant gut microbiota of Drosophila species revealed by 16S rRNA gene analysis. ISME J. 7 (10), 1922-1932 (2013).
  20. Newell, P. D., Douglas, A. E. Interspecies interactions determine the impact of the gut microbiota on nutrient allocation in Drosophila melanogaster. Appl Environ Microbiol. 80 (2), 788-796 (2014).
  21. Broderick, N. A., Lemaitre, B. Gut-associated microbes of Drosophila melanogaster. Gut Microbes. 3 (4), 307-321 (2012).
  22. Ren, C., Webster, P., Finkel, S. E., Tower, J. Increased internal and external bacterial load during Drosophila aging without life-span trade-off. Cell Metab. 6 (2), 144-152 (2007).
  23. Wong, A. C., et al. The Host as the Driver of the Microbiota in the Gut and External Environment of Drosophila melanogaster. Appl Environ Microbiol. 81 (18), 6232-6240 (2015).
  24. Dobson, A. J., et al. Host genetic determinants of microbiota-dependent nutrition revealed by genome-wide analysis of Drosophila melanogaster. Nat Commun. 6, 6312 (2015).
  25. Bakula, M. The persistence of a microbial flora during postembryogenesis of Drosophila melanogaster. J Invertebr Pathol. 14 (3), 365-374 (1969).
  26. Ryu, J. H., et al. Innate immune homeostasis by the homeobox gene caudal and commensal-gut mutualism in Drosophila. Science. 319 (5864), 777-782 (2008).
  27. Blum, J. E., Fischer, C. N., Miles, J., Handelsman, J. Frequent replenishment sustains the beneficial microbiome of Drosophila melanogaster. MBio. 4 (6), 00860 (2013).
  28. Bitner-Mathe, B. C., Klaczko, L. B. Plasticity of Drosophila melanogaster wing morphology: effects of sex, temperature and density. Genetica. 105 (2), 203-210 (1999).
  29. Edward, D. A., Chapman, T. Sex-specific effects of developmental environment on reproductive trait expression in Drosophila melanogaster. Ecol Evol. 2 (7), 1362-1370 (2012).
  30. Ridley, E. V., Wong, A. C., Westmiller, S., Douglas, A. E. Impact of the resident microbiota on the nutritional phenotype of Drosophila melanogaster. PLoS One. 7 (5), e36765 (2012).
  31. Newell, P. D., et al. In vivo function and comparative genomic analyses of the Drosophila gut microbiota identify candidate symbiosis factors. Front Microbiol. 5, 576 (2014).
  32. Dewhirst, F. E., et al. Phylogeny of the defined murine microbiota: altered Schaedler flora. Appl Environ Microbiol. 65 (8), 3287-3292 (1999).
  33. Min, K. T., Benzer, S. Wolbachia, normally a symbiont of Drosophila, can be virulent, causing degeneration and early death. Proc Natl Acad Sci U S A. 94 (20), 10792-10796 (1997).

Tags

Drosophila MelanogasterAxenicGnotobioticMicrobiotaSterile DietMRS AgarLactobacillusAcetobacterGrape Juice AgarYeast PasteEgg Collection
check_url/54219?article_type=t

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Koyle, M. L., Veloz, M., Judd, A. M., Wong, A. C., Newell, P. D., Douglas, A. E., Chaston, J. M. Rearing the Fruit Fly Drosophila melanogaster Under Axenic and Gnotobiotic Conditions. J. Vis. Exp. (113), e54219, doi:10.3791/54219 (2016).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image