طريقة سهلة لمحطة Polysome التنميط
Summary
This protocol describes an easy method to extract and fractionate transcripts from plant tissues on the basis of the number of bound ribosomes. It allows a global estimate of translation activity and the determination of the translational status of specific mRNAs.
Abstract
Translation of mRNA to protein is a fundamental and highly regulated biological process. Polysome profiling is considered as a gold standard for the analysis of translational regulation. The method described here is an easy and economical way for fractionating polysomes from various plant tissues. A sucrose gradient is made without the need for a gradient maker by sequentially freezing each layer. Cytosolic extracts are then prepared in a buffer containing cycloheximide and chloramphenicol to immobilize the cytosolic and chloroplastic ribosomes to mRNA and are loaded onto the sucrose gradient. After centrifugation, six fractions are directly collected from the bottom to the top of the gradient, without piercing the ultracentrifugation tube. During collection, the absorbance at 260 nm is read continuously to generate a polysome profile that gives a snapshot of global translational activity. Fractions are then pooled to prepare three different mRNA populations: the polysomes, mRNAs bound to several ribosomes; the monosomes, mRNAs bound to one ribosome; and mRNAs that are not bound to ribosomes. mRNAs are then extracted. This protocol has been validated for different plants and tissues including Arabidopsis thaliana seedlings and adult plants, Nicotiana benthamiana, Solanum lycopersicum, and Oryza sativa leaves.
Introduction
تخليق البروتين هو عملية أساسية ومكلفة بقوة في جميع الخلايا 1. أولا وقبل كل شيء، يجب أن الخلايا استثمار الطاقة في إنتاج الآلات الترجمة، والريبوسومات. على سبيل المثال خلية الخميرة تقسيم بنشاط تنتج ما يصل الى 2000 الريبوسومات في الدقيقة الواحدة. ويتطلب هذا الإنتاج إلى 60٪ من إجمالي النشاط النسخي، وتصل إلى 90٪ من النشاط الربط الكلي للخلية 2. وبالإضافة إلى ذلك، فإن الطاقة اللازمة لتركيب الأحماض الأمينية، أمينوأسيل-الحمض الريبي النووي النقال والسندات الببتيد. في النباتات، إضافة حمض أميني واحد إلى تكاليف سلسلة ببتيد 4،5-5،9 جزيئات ATP 3. ولذلك، فإنه ليس من المستغرب أن الترجمة من مرنا إلى البروتين هو موقع كبير من التنظيم، لا سيما عندما يتعلق الأمر بالتعامل مع الظروف البيئية المتغيرة.
الخطوة الشروع في الترجمة، وهذا هو جمعية مرنا مع الريبوسوم، هو الهدف الرئيسي من تنظيمترجمة 4. ونتيجة لذلك من اللائحة الترجمة فضلا عن غيرها من الخطوات التنظيمية بعد النسخي، 40٪ فقط من التغيرات في تركيز البروتين يمكن تفسير مرنا وفرة 5،6. وهكذا، فإن الدراسة من إجمالي مرنا تعطي معلومات فقيرة نسبيا عن وفرة البروتين. من ناحية أخرى، فإن جمعية مرنا مع الريبوسومات يعطي نظرة أفضل إلى وفرة البروتين مما يتيح الوصول إلى تلك من mRNAs المشاركة في الترجمة. وترتبط من mRNAs تترجم بنشاط مع العديد من الريبوسومات في هياكل ودعا polysomes. على العكس من ذلك، سوف تكون مرتبطة من mRNAs سوء ترجمة مع الريبوسوم واحدة فقط (صبغي جنسي أحادي). ونتيجة لذلك، ووضع متعدية من مرنا يمكن تقييمها من خلال رصد ارتباطه الريبوسومات 7.
يصف هذا البروتوكول عزلة polysomes من ستة أيام القديمة الشتلات نبات الأرابيدوبسيس thaliana، والعزلة لاحقة من الحمض النووي الريبي، وتحليل النتائج. بويتم فصل lysomes وmonosomes من خلال التدرج الكثافة السكروز. يتم جمع التدرجات إلى ستة أجزاء. يتم تجميع بعض الكسور للحصول على ثلاثة أجزاء يفصل جيدا: polysomes، monosomes والأجزاء الخفيفة (ويشار إليها طاف)، الذي يحتوي على حرة 60S و 40S مفارز الريباسي ومن mRNAs التي لا ترتبط مع الريبوسومات. ويمكن تقدير حركة الترجمة العالمي من خلال توليد polysome / نسبة صبغي جنسي أحادي، والتي يتم تحديدها من قبل الاندماج في المنطقة تحت المنحنى، وبمقارنة ملامح polysomes. ثم يتم استخراج من mRNAs والبروتينات من كسور مختلفة وتستخدم للتحليل RT-PCR، QRT-PCR، لطخة الشمالية، ميكروأري، لطخة غربية أو البروتينات. وقد تم التحقق من صحة هذا البروتوكول للنباتات والأنسجة الأخرى.
تم العثور على المعدات اللازمة لتنفيذ هذا البروتوكول عادة في معظم المختبرات: ليست هناك حاجة لصانع التدرج. تجميد كل طبقة قبل إضافة واحدة المقبل منعالصورة من أي مزيج أو اضطراب في طبقات. لا يتم استخدام ثاقبة أنبوب لجمع الانحدار الذي لا يمكن أن يتحقق عن طريق الغمر من أنبوب زجاجي الشعرية في الانحدار. لذلك، لا تزال أنابيب نابذة مكلفة التالفة ويمكن إعادة استخدامها مرات عديدة. بشكل جماعي، وهذا يجعل هذا البروتوكول وسيلة سهلة ورخيصة لتحديد ملامح polysome.
Protocol
Representative Results
Discussion
The protocol we present here is an easy and cheap method for generating polysome profiles and isolating mRNAs associated with polysomes, single ribosomes or free of ribosomes. A wide range of different polysome fractionation methods is described in the literature. The method we have described here has been optimized to keep only the necessary compounds and has been adapted for plant material. In particular, we reduced the amount of detergent11 and added chloramphenicol to the buffer to fix the chloroplastic ri…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
وأيد هذا العمل من قبل وكالة الأبحاث الوطنية الفرنسية (وكالة الاستخبارات الوطنية-14-CE02-0010). نشكر الدكتور بنيامين الميدان والدكتور إيلودي Lanet لقراءة نقدية للمخطوطة. نشكر السيد ميشيل تيريز لمساعدته مع تحرير الفيديو.
Materials
| Ultracentrifuge tube, thinwall, polyallomer – 13.2 ml | Beckman Coulter | 331372 | |
| Ultracentrifuge tube, thinwall, polyallomer – 38.5 ml | Beckman Coulter | 326823 | |
| Glass capillary tube | Drummond Scientific | 1-000-1000 | |
| Ultracentrifuge | Beckman Coulter | Optima series | |
| Ultracentrifuge Rotor SW41 | Beckman Coulter | 331362 | |
| Ultracentrifuge Rotor SW32 | Beckman Coulter | 369650 | |
| Peristaltic pump | Any | ||
| Tygon R3607 polyvinyl chloride tubing | Fisher Scientific | 070534-22 | Polyvinyl chloride tubing, 2.29 mm |
| Fraction collector Model 2110 | Bio-Rad | 731-8120 | |
| UV cuvette | Hellma | 170.700-QS | Quartz flow-through cuvette |
| UV Spectrophotometer | Varian | Cary50 | Read every 0.0125 sec |
| All chemicals | Any | Use only Molecular Biology Grade | |
| Murashige and Skoog Basal Salt Mixture (MS) | Sigma-Aldrich | M5524 | |
| Rnase-Free water | Any | ||
| Petri Dishes | Fisher Scientific | 10083251 | |
| Octylphenoxy poly(ethyleneoxy)ethanol, branched (Nonidet P40) | Euromedex | UN3500 | |
| Linear acrylamide (acryl carrier) | ThermoFischer scientific | AM9520 | RNA precipitation carrier |
| OriginPro 8 | OriginLab | Analysis software |
References
- Nelson, C. J., Millar, A. H. Protein turnover in plant biology. Nat Plants. 1 (3), 15017 (2015).
- Warner, J. R. The economics of ribosome biosynthesis in yeast. Trends Biochem Sci. 24 (11), 437-440 (1999).
- Amthor, J. S. The McCree-de Wit-Penning de Vries-Thornley Respiration Paradigms: 30 Years Later. Ann Bot. 86 (1), 1-20 (2000).
- Preiss, T., W Hentze, M. Starting the protein synthesis machine: eukaryotic translation initiation. BioEssays news and reviews in molecular, cellular and developmental biology. 25 (12), 1201-1211 (2003).
- Vogel, C., Marcotte, E. M. Insights into the regulation of protein abundance from proteomic and transcriptomic analyses. Nat Rev Genet. 13 (4), 227-232 (2013).
- Baerenfaller, K., et al. Genome-scale proteomics reveals Arabidopsis thaliana gene models and proteome dynamics. Science. 320 (5878), 938-941 (2008).
- Zanetti, E., Chang, I., Gong, F., Galbraith, D. W., Bailey-Serres, J. Immunopurification of Polyribosomal Complexes of Arabidopsis for Global Analysis of Gene Expression. Plant physiol. 138 (2), 624-635 (2005).
- Murashige, T., Skoog, F. A revised medium for rapid growth and bioassays with tobacco tissue cultures. Physiol plant. 15 (3), 473-497 (1962).
- del Prete, M. J., Vernal, R., Dolznig, H., Müllner, E. W., Garcia-Sanz, J. A. Isolation of polysome-bound mRNA from solid tissues amenable for RT-PCR and profiling experiments. RNA. 13 (3), 414-421 (2007).
- Salinas, J., Sanchez-Serrano, J. J. . Arabidopsis protocols. , (2006).
- Piques, M., et al. Ribosome and transcript copy numbers, polysome occupancy and enzyme dynamics in Arabidopsis. Mol syst biol. 5 (314), 314 (2009).
- Morita, M., Alain, T., Topisirovic, I., Sonenberg, N. Polysome Profiling Analysis. bio-protocol. 3 (14), 3-8 (2013).
- Yángüez, E., Castro-Sanz, A. B., Fernández-Bautista, N., Oliveros, J. C., Castellano, M. M. Analysis of genome-wide changes in the translatome of Arabidopsis seedlings subjected to heat stress. PloS One. 8 (8), (2013).
- Sormani, R., et al. Sublethal cadmium intoxication in Arabidopsis thaliana impacts translation at multiple levels. Cell Physiol. 52 (2), 436-447 (2011).
- Lanet, E., et al. Biochemical evidence for translational repression by Arabidopsis microRNAs. Plant cell. 21 (6), 1762-1768 (2009).
- Jabnoune, M., Secco, D., Lecampion, C., Robaglia, C., Shu, Q., Poirier, Y. A Rice cis-Natural Antisense RNA Acts as a Translational Enhancer for Its Cognate mRNA and Contributes to Phosphate Homeostasis and Plant Fitness. Plant cell. 25 (10), 4166-4182 (2013).
- Ingolia, N. T. Genome-wide translational profiling by ribosome footprinting. Methods Enzymol. 470 (10), (2010).
- Juntawong, P., Girke, T., Bazin, J., Bailey-Serres, J. Translational dynamics revealed by genome-wide profiling of ribosome footprints in Arabidopsis. PNAS. 111 (1), 203-212 (2013).
- Ingolia, N. T. Ribosome profiling: new views of translation, from single codons to genome scale. Nat Rev Genet. 15 (3), 205-213 (2014).
