Een eenvoudige methode voor Plant polysoomdisplays Profiling

Summary

This protocol describes an easy method to extract and fractionate transcripts from plant tissues on the basis of the number of bound ribosomes. It allows a global estimate of translation activity and the determination of the translational status of specific mRNAs.

Abstract

Translation of mRNA to protein is a fundamental and highly regulated biological process. Polysome profiling is considered as a gold standard for the analysis of translational regulation. The method described here is an easy and economical way for fractionating polysomes from various plant tissues. A sucrose gradient is made without the need for a gradient maker by sequentially freezing each layer. Cytosolic extracts are then prepared in a buffer containing cycloheximide and chloramphenicol to immobilize the cytosolic and chloroplastic ribosomes to mRNA and are loaded onto the sucrose gradient. After centrifugation, six fractions are directly collected from the bottom to the top of the gradient, without piercing the ultracentrifugation tube. During collection, the absorbance at 260 nm is read continuously to generate a polysome profile that gives a snapshot of global translational activity. Fractions are then pooled to prepare three different mRNA populations: the polysomes, mRNAs bound to several ribosomes; the monosomes, mRNAs bound to one ribosome; and mRNAs that are not bound to ribosomes. mRNAs are then extracted. This protocol has been validated for different plants and tissues including Arabidopsis thaliana seedlings and adult plants, Nicotiana benthamiana, Solanum lycopersicum, and Oryza sativa leaves.

Introduction

Eiwitsynthese is een essentieel en energetisch kostbaar proces in alle cellen ^1. Allereerst moeten cellen energie in de productie van de translatie machinerie, de ribosomen. Bijvoorbeeld een actief delende gistcel produceert zoveel 2000 ribosomen per minuut. Deze productie is maximaal 60% van de totale transcriptionele activiteit en tot 90% van de totale splicing activiteit van de cel ^2. Bovendien wordt energie gebruikt voor de synthese van aminozuren, aminoacyl-tRNA en peptidebindingen. In planten, het toevoegen van een aminozuur aan een peptideketen kosten 4,5-5,9 moleculen ATP ^3. Daarom is het niet verwonderlijk dat de vertaling van mRNA tot eiwit is een belangrijke plaats van de regelgeving, met name als het gaat om het omgaan met veranderende omgevingsfactoren.

De initiatie stap van de vertaling, dat is de vereniging van een mRNA met het ribosoom, is het belangrijkste doelwit van de regulering van devertaling ^4. Als gevolg van de regulering van translatie en andere post-transcriptionele regulerende stappen, kan slechts 40% van de variaties in eiwitconcentratie te verklaren door mRNA overvloed ^5,6. Zo is de studie van het totale mRNA geeft relatief slechte informatie over eiwit overvloed. Aan de andere kant, de vereniging van mRNA met ribosomen geeft een beter inzicht in eiwit overvloed door het geven van toegang tot die mRNA's die betrokken zijn bij de vertaling. Actief vertaald mRNA's geassocieerd met een aantal ribosomen structuren genaamd polysomen. Omgekeerd zal slecht vertaald mRNA's geassocieerd worden met slechts één ribosoom (monosome). Bijgevolg kan de translationele status van mRNA geëvalueerd door monitoring de associatie met ribosomen ^7.

Dit protocol beschrijft de isolatie van polysomen zes dagen oud Arabidopsis thaliana zaailingen, de daaropvolgende isolatie van RNA en de analyse van de resultaten. polysomes en monosomes worden gescheiden door een sucrose dichtheidsgradiënt. Verlopen worden verzameld in zes fracties. Enkele fracties worden samengevoegd tot drie goed gescheiden fracties te verkrijgen: polysomen, monosomes en de lichte fractie (hierna supernatant), waarin het vrije 60S en 40S ribosomale subeenheden en mRNA's die niet zijn gekoppeld aan ribosomen bevat. Global vertaling activiteit kan worden bepaald door het genereren van een polysoom / monosome verhouding die wordt bepaald door integratie van het gebied onder de curve, en door vergelijking van de polysomen profielen. mRNA's en eiwitten worden geëxtraheerd uit de verschillende fracties en gebruikt voor analyse door RT-PCR, qRT-PCR, Northern blot, microarray, western blot of proteomics. Dit protocol is gevalideerd voor andere planten en weefsels.

De voor dit protocol voeren materiaal worden aangetroffen in de meeste laboratoria: Er is geen behoefte aan een gradiënt maker. Bevriezing elke laag voor het toevoegen van het volgende voorkomens uit een mix of verstoring van de lagen. Nr buis piercer wordt gebruikt gradiënt collectie die kan worden bereikt door onderdompeling van een glazen capillaire buis in het verloop. Daarom is de kostbare ultracentrifugebuizen onbeschadigd blijven en kunnen worden hergebruikt vaak. Collectief, dit maakt het huidige protocol een gemakkelijke en goedkope methode voor het polysoomdisplays profilering.

Protocol

1. Bereiding van 20 tot 50% (w / v) sucrose gradiënten Opmerking: De gradiënten bestaan ​​uit 4 lagen sucrose (50%, 35% en 2 lagen 20%) in 13,2 ml ultracentrifuge buis. In onze ervaring, het gieten van de 20% sucrose in twee afzonderlijke lagen aanzienlijk verbetert de kwaliteit van polysoomdisplays preparaten. Bereid de voorraad oplossingen. Zorg ervoor dat alle oplossingen zijn RNAse en DNAse gratis. Bereid 10X zoutoplossing: 400 mM Tris-HCl pH 8,4, 200 mM KCl en …

Representative Results

In de literatuur worden polysoomdisplay profielen vaak blijkt uit de lichte fractie met de zware fractie als gevolg van de manier waarop de gradiënten worden verzameld, dus van boven naar beneden. Omdat in het hier beschreven protocol het verlopen worden verzameld van de bodem naar de top, de profielen tonen we beginnen met de zware fractie (de polysomen) en naar de lichte fractie (vrij ribosoom subeenheden en RNA) (Figuur 2A). Vervolgens hebben we het verzamelen van el…

Discussion

The protocol we present here is an easy and cheap method for generating polysome profiles and isolating mRNAs associated with polysomes, single ribosomes or free of ribosomes. A wide range of different polysome fractionation methods is described in the literature. The method we have described here has been optimized to keep only the necessary compounds and has been adapted for plant material. In particular, we reduced the amount of detergent¹¹ and added chloramphenicol to the buffer to fix the chloroplastic ri…

Materials

Ultracentrifuge tube, thinwall, polyallomer – 13.2 ml	Beckman Coulter	331372
Ultracentrifuge tube, thinwall, polyallomer – 38.5 ml	Beckman Coulter	326823
Glass capillary tube	Drummond Scientific	1-000-1000
Ultracentrifuge	Beckman Coulter	Optima series
Ultracentrifuge Rotor SW41	Beckman Coulter	331362
Ultracentrifuge Rotor SW32	Beckman Coulter	369650
Peristaltic pump	Any
Tygon R3607 polyvinyl chloride tubing	Fisher Scientific	070534-22	Polyvinyl chloride tubing, 2.29 mm
Fraction collector Model 2110	Bio-Rad	731-8120
UV cuvette	Hellma	170.700-QS	Quartz flow-through cuvette
UV Spectrophotometer	Varian	Cary50	Read every 0.0125 sec
All chemicals	Any		Use only Molecular Biology Grade
Murashige and Skoog Basal Salt Mixture (MS)	Sigma-Aldrich	M5524
Rnase-Free water	Any
Petri Dishes	Fisher Scientific	10083251
Octylphenoxy poly(ethyleneoxy)ethanol, branched (Nonidet P40)	Euromedex	UN3500
Linear acrylamide (acryl carrier)	ThermoFischer scientific	AM9520	RNA precipitation carrier
OriginPro 8	OriginLab		Analysis software