Un método fácil para la planta de perfiles de polisomas

Summary

This protocol describes an easy method to extract and fractionate transcripts from plant tissues on the basis of the number of bound ribosomes. It allows a global estimate of translation activity and the determination of the translational status of specific mRNAs.

Abstract

Translation of mRNA to protein is a fundamental and highly regulated biological process. Polysome profiling is considered as a gold standard for the analysis of translational regulation. The method described here is an easy and economical way for fractionating polysomes from various plant tissues. A sucrose gradient is made without the need for a gradient maker by sequentially freezing each layer. Cytosolic extracts are then prepared in a buffer containing cycloheximide and chloramphenicol to immobilize the cytosolic and chloroplastic ribosomes to mRNA and are loaded onto the sucrose gradient. After centrifugation, six fractions are directly collected from the bottom to the top of the gradient, without piercing the ultracentrifugation tube. During collection, the absorbance at 260 nm is read continuously to generate a polysome profile that gives a snapshot of global translational activity. Fractions are then pooled to prepare three different mRNA populations: the polysomes, mRNAs bound to several ribosomes; the monosomes, mRNAs bound to one ribosome; and mRNAs that are not bound to ribosomes. mRNAs are then extracted. This protocol has been validated for different plants and tissues including Arabidopsis thaliana seedlings and adult plants, Nicotiana benthamiana, Solanum lycopersicum, and Oryza sativa leaves.

Introduction

La síntesis de proteínas es un proceso esencial y energéticamente costoso en todas las células ^1. En primer lugar, las células deben invertir energía en la producción de la maquinaria de traducción, los ribosomas. Por ejemplo, una célula de levadura dividiendo activamente produce tanto como 2000 ribosomas por minuto. Una producción de este tipo requiere de hasta 60% de la actividad transcripcional total y hasta 90% de la actividad total de empalme de la célula ^2. Además, se requiere energía para la síntesis de aminoácidos, aminoacil-tRNA y enlaces peptídicos. En las plantas, la adición de un aminoácido a un costos de la cadena de péptido de 4,5 a 5,9 moléculas de ATP ^3. Por lo tanto, no es sorprendente que la traducción de ARNm de la proteína es un sitio importante de la regulación, en particular cuando se trata de lidiar con el cambio de las condiciones ambientales.

La etapa de iniciación de la traducción, que es la asociación de un ARNm con el ribosoma, es el principal objetivo de la regulación deTraducción ^4. Como consecuencia de la regulación de la traducción, así como otras medidas de regulación post-transcripcional, sólo el 40% de las variaciones en la concentración de proteína se puede explicar por la abundancia de ARNm ^5,6. Por lo tanto, el estudio de ARNm total de da relativamente pobre información sobre la abundancia de proteínas. Por otra parte, la asociación de ARNm con ribosomas da una mejor penetración en la abundancia de proteínas, dando acceso a esos mRNAs implicados en la traducción. mRNAs traducidos de forma activa se asocian con varios ribosomas en estructuras llamadas polisomas. Por el contrario, los ARNm mal traducidas estarán asociadas con un solo ribosoma (monosome). En consecuencia, el estado de la traducción de un ARNm puede ser evaluada mediante el control de su asociación con ribosomas ^7.

Este protocolo describe el aislamiento de polisomas procedentes de seis días plántulas de Arabidopsis thaliana, el posterior aislamiento de RNA, y el análisis de los resultados. Correoslysomes y monosomas se separan a través de un gradiente de densidad de sacarosa. Los gradientes se recogen en seis fracciones. Algunas de las fracciones se agrupan para obtener tres fracciones separadas así: polisomas, monosomas y la fracción ligera (de aquí en adelante llamado sobrenadante), que contiene los libres 60S y 40S ribosomal subunidades y mRNAs que no están asociados con los ribosomas. actividad de traducción Global se puede estimar mediante la generación de un / relación de polisomas monosome, que se determina por la integración del área bajo la curva, y mediante la comparación de los perfiles de polisomas. mRNAs y proteínas se extraen a partir de las diferentes fracciones y se utilizaron para el análisis por RT-PCR, QRT-PCR, transferencia de Northern, microarray, Western blot o la proteómica. Este protocolo ha sido validado para otras plantas y tejidos.

El equipo necesario para llevar a cabo este protocolo se encuentran comúnmente en la mayoría de los laboratorios: No hay necesidad de un fabricante de gradiente. Congelación de cada capa antes de añadir el siguiente prevenirs de cualquier mezcla o perturbación de las capas. No perforador tubo se utiliza para la recogida de gradiente que puede lograrse mediante la inmersión de un tubo capilar de vidrio en el gradiente. Por lo tanto, los tubos de ultracentrífuga costosos permanecen sin daños y se pueden volver a utilizar muchas veces. En conjunto, esto hace que el presente protocolo de un método sencillo y barato para los perfiles de polisomas.

Protocol

1. Preparación de 20 a 50% (p / v) de sacarosa gradientes Nota: Los gradientes son de 4 capas de sacarosa (50%, 35% y el 2 capas de 20%) en un tubo de ultracentrífuga 13.2 ml. En nuestra experiencia, el vertido de la sacarosa al 20% en dos capas separadas mejora en gran medida la calidad de las preparaciones polisomas. Preparar las soluciones madre. Asegúrese de que todas las soluciones son de RNAsa y DNAsa. Preparar 10X Solución Salina: mM Tris-HCl pH 8,4 400, KCl 20…

Representative Results

En la literatura, los perfiles de polisomas a menudo se muestran a partir de la fracción ligera de la fracción pesada como resultado de la forma en que se recogen los gradientes, es decir, desde la parte superior a la parte inferior. Dado que en el protocolo descrito aquí los gradientes son recogidos desde el fondo hasta la parte superior, los perfiles mostrados comienzan con la fracción pesada (los polisomas) e ir a la fracción ligera (subunidades de ribosomas libres y ARN) <strong…

Discussion

The protocol we present here is an easy and cheap method for generating polysome profiles and isolating mRNAs associated with polysomes, single ribosomes or free of ribosomes. A wide range of different polysome fractionation methods is described in the literature. The method we have described here has been optimized to keep only the necessary compounds and has been adapted for plant material. In particular, we reduced the amount of detergent¹¹ and added chloramphenicol to the buffer to fix the chloroplastic ri…

Materials

Ultracentrifuge tube, thinwall, polyallomer – 13.2 ml	Beckman Coulter	331372
Ultracentrifuge tube, thinwall, polyallomer – 38.5 ml	Beckman Coulter	326823
Glass capillary tube	Drummond Scientific	1-000-1000
Ultracentrifuge	Beckman Coulter	Optima series
Ultracentrifuge Rotor SW41	Beckman Coulter	331362
Ultracentrifuge Rotor SW32	Beckman Coulter	369650
Peristaltic pump	Any
Tygon R3607 polyvinyl chloride tubing	Fisher Scientific	070534-22	Polyvinyl chloride tubing, 2.29 mm
Fraction collector Model 2110	Bio-Rad	731-8120
UV cuvette	Hellma	170.700-QS	Quartz flow-through cuvette
UV Spectrophotometer	Varian	Cary50	Read every 0.0125 sec
All chemicals	Any		Use only Molecular Biology Grade
Murashige and Skoog Basal Salt Mixture (MS)	Sigma-Aldrich	M5524
Rnase-Free water	Any
Petri Dishes	Fisher Scientific	10083251
Octylphenoxy poly(ethyleneoxy)ethanol, branched (Nonidet P40)	Euromedex	UN3500
Linear acrylamide (acryl carrier)	ThermoFischer scientific	AM9520	RNA precipitation carrier
OriginPro 8	OriginLab		Analysis software