This protocol describes an easy method to extract and fractionate transcripts from plant tissues on the basis of the number of bound ribosomes. It allows a global estimate of translation activity and the determination of the translational status of specific mRNAs.
Translation of mRNA to protein is a fundamental and highly regulated biological process. Polysome profiling is considered as a gold standard for the analysis of translational regulation. The method described here is an easy and economical way for fractionating polysomes from various plant tissues. A sucrose gradient is made without the need for a gradient maker by sequentially freezing each layer. Cytosolic extracts are then prepared in a buffer containing cycloheximide and chloramphenicol to immobilize the cytosolic and chloroplastic ribosomes to mRNA and are loaded onto the sucrose gradient. After centrifugation, six fractions are directly collected from the bottom to the top of the gradient, without piercing the ultracentrifugation tube. During collection, the absorbance at 260 nm is read continuously to generate a polysome profile that gives a snapshot of global translational activity. Fractions are then pooled to prepare three different mRNA populations: the polysomes, mRNAs bound to several ribosomes; the monosomes, mRNAs bound to one ribosome; and mRNAs that are not bound to ribosomes. mRNAs are then extracted. This protocol has been validated for different plants and tissues including Arabidopsis thaliana seedlings and adult plants, Nicotiana benthamiana, Solanum lycopersicum, and Oryza sativa leaves.
A síntese de proteínas é um processo essencial e dispendiosa energeticamente em todas as células 1. Em primeiro lugar, as células devem investir energia na produção da maquinaria de tradução, os ribossomas. Por exemplo, uma célula de levedura dividindo ativamente produz tanto quanto 2.000 ribossomas por minuto. Essa produção exige até 60% da actividade de transcrição total e até 90% da actividade total de splicing da célula 2. Além disso, é necessária energia para a síntese de aminoácidos, aminoacil-ARNt e ligações peptídicas. Nas plantas, a adição de um aminoácido a uma cadeia peptídica custos de 4,5 a 5,9 moléculas de ATP 3. Portanto, não é surpreendente que a tradução do mRNA para a proteína é um importante local de regulação, especialmente quando se trata de lidar com a mudança de condições ambientais.
A etapa de iniciação da tradução, que é a associação de um mRNA com o ribossoma, é o principal alvo da regulamentação dosTradução 4. Como uma consequência da regulação da tradução, bem como outros passos de regulação pós-transcricional, apenas 40% das variações na concentração de proteína pode ser explicada por ARNm de abundância 5,6. Assim, o estudo de mRNA total fornece relativamente pouca informação sobre a abundância de proteínas. Por outro lado, a associação de mRNA com ribossomos dá melhor visão sobre a abundância de proteínas, dando acesso a esses mRNAs envolvidos na tradução. mRNAs activamente traduzida estão associados com vários ribossomas em estruturas chamadas polissomas. Por outro lado, mRNAs mal traduzidas será associado a apenas um ribossomo (monosome). Por conseguinte, o status translacional de um ARNm pode ser avaliado por monitorização da sua associação com ribossomas 7.
Este protocolo descreve o isolamento de polissomas a partir de seis dias de idade plântulas de Arabidopsis thaliana, o subsequente isolamento do ARN e a análise dos resultados. Polysomes monosomes e são separadas através de um gradiente de densidade de sacarose. Gradientes são coletados em seis fracções. Algumas das fracções são reunidas para obter três fracções bem separados: polissomos, monosomes ea fração leve (doravante denominado sobrenadante), que contém os 60 e 40S subunidades ribossomais livres e mRNAs que não estão associados a ribossomas. actividade de tradução global pode ser estimada através da geração de uma relação de polissoma / monosome, que é determinada por integração da área sob a curva, e por comparação dos perfis de polissomas. ARNm e as proteínas são, em seguida, extraiu-se a partir das diferentes fracções e utilizado para análise por RT-PCR, qRT-PCR, Northern blot, microarray, Western blot ou proteómica. Este protocolo foi validado para outras plantas e tecidos.
Os equipamentos necessários para realizar este protocolo são comumente encontrados na maioria dos laboratórios: Não há necessidade de uma máquina de inclinação. Congelação cada camada antes de adicionar o próximo prevenirs de qualquer mistura ou perturbação das camadas. Nenhuma perfurador tubo é utilizado para a recolha de inclinação que pode ser obtida por imersão de um tubo capilar de vidro no gradiente. Por conseguinte, os tubos de ultracentrífuga dispendiosos não ficam danificadas e podem ser re-utilizada várias vezes. Coletivamente, isso faz com que o presente protocolo de um método fácil e barato para profiling polysome.
The protocol we present here is an easy and cheap method for generating polysome profiles and isolating mRNAs associated with polysomes, single ribosomes or free of ribosomes. A wide range of different polysome fractionation methods is described in the literature. The method we have described here has been optimized to keep only the necessary compounds and has been adapted for plant material. In particular, we reduced the amount of detergent11 and added chloramphenicol to the buffer to fix the chloroplastic ri…
The authors have nothing to disclose.
Este trabalho foi apoiado pela Agência Nacional de Investigação francesa (ANR-14-CE02-0010). Agradecemos Dr. Benjamin Campo e Dr. Elodie Lanet para a leitura crítica do manuscrito. Agradecemos ao Sr. Michel Terese por sua ajuda com edição de vídeo.
Ultracentrifuge tube, thinwall, polyallomer – 13.2 ml | Beckman Coulter | 331372 | |
Ultracentrifuge tube, thinwall, polyallomer – 38.5 ml | Beckman Coulter | 326823 | |
Glass capillary tube | Drummond Scientific | 1-000-1000 | |
Ultracentrifuge | Beckman Coulter | Optima series | |
Ultracentrifuge Rotor SW41 | Beckman Coulter | 331362 | |
Ultracentrifuge Rotor SW32 | Beckman Coulter | 369650 | |
Peristaltic pump | Any | ||
Tygon R3607 polyvinyl chloride tubing | Fisher Scientific | 070534-22 | Polyvinyl chloride tubing, 2.29 mm |
Fraction collector Model 2110 | Bio-Rad | 731-8120 | |
UV cuvette | Hellma | 170.700-QS | Quartz flow-through cuvette |
UV Spectrophotometer | Varian | Cary50 | Read every 0.0125 sec |
All chemicals | Any | Use only Molecular Biology Grade | |
Murashige and Skoog Basal Salt Mixture (MS) | Sigma-Aldrich | M5524 | |
Rnase-Free water | Any | ||
Petri Dishes | Fisher Scientific | 10083251 | |
Octylphenoxy poly(ethyleneoxy)ethanol, branched (Nonidet P40) | Euromedex | UN3500 | |
Linear acrylamide (acryl carrier) | ThermoFischer scientific | AM9520 | RNA precipitation carrier |
OriginPro 8 | OriginLab | Analysis software |