संयंत्र polysome रूपरेखा के लिए एक आसान तरीका
Summary
This protocol describes an easy method to extract and fractionate transcripts from plant tissues on the basis of the number of bound ribosomes. It allows a global estimate of translation activity and the determination of the translational status of specific mRNAs.
Abstract
Translation of mRNA to protein is a fundamental and highly regulated biological process. Polysome profiling is considered as a gold standard for the analysis of translational regulation. The method described here is an easy and economical way for fractionating polysomes from various plant tissues. A sucrose gradient is made without the need for a gradient maker by sequentially freezing each layer. Cytosolic extracts are then prepared in a buffer containing cycloheximide and chloramphenicol to immobilize the cytosolic and chloroplastic ribosomes to mRNA and are loaded onto the sucrose gradient. After centrifugation, six fractions are directly collected from the bottom to the top of the gradient, without piercing the ultracentrifugation tube. During collection, the absorbance at 260 nm is read continuously to generate a polysome profile that gives a snapshot of global translational activity. Fractions are then pooled to prepare three different mRNA populations: the polysomes, mRNAs bound to several ribosomes; the monosomes, mRNAs bound to one ribosome; and mRNAs that are not bound to ribosomes. mRNAs are then extracted. This protocol has been validated for different plants and tissues including Arabidopsis thaliana seedlings and adult plants, Nicotiana benthamiana, Solanum lycopersicum, and Oryza sativa leaves.
Introduction
प्रोटीन संश्लेषण सभी कोशिकाओं 1 में एक आवश्यक और उर्जा महंगी प्रक्रिया है। सबसे पहले, कोशिकाओं अनुवाद मशीनरी, राइबोसोम के उत्पादन में ऊर्जा निवेश करना चाहिए। उदाहरण के लिए एक सक्रिय रूप से विभाजित खमीर सेल प्रति मिनट के रूप में ज्यादा के रूप में 2,000 राइबोसोम पैदा करता है। इस तरह की एक उत्पादन की कुल ट्रांसक्रिप्शनल गतिविधि का 60% करने के लिए और सेल 2 की कुल splicing गतिविधि के 90% अप करने की आवश्यकता है। इसके अलावा, ऊर्जा अमीनो एसिड, अमीनोएसिल-tRNA और पेप्टाइड बांडों के संश्लेषण के लिए आवश्यक है। पौधों में, एटीपी 3 के 4.5 5.9 करने के अणुओं से एक पेप्टाइड श्रृंखला की लागत के लिए एक एमिनो एसिड जोड़ने। इसलिए, यह है कि विनियमन के एक प्रमुख स्थल है प्रोटीन के लिए mRNA की बात है, खासकर जब यह पर्यावरण की स्थिति को बदलने के साथ काम करने के लिए आता है आश्चर्य की बात नहीं है।
अनुवाद की दीक्षा कदम है, राइबोसोम के साथ एक mRNA की एसोसिएशन है कि, के नियमन का मुख्य लक्ष्य हैअनुवाद 4। अनुवाद के नियमन का एक परिणाम के रूप में अच्छी तरह के रूप में अन्य के बाद विनियामक कदम के रूप में, प्रोटीन एकाग्रता में बदलाव का केवल 40% mRNA बहुतायत 5,6 से समझाया जा सकता है। इस प्रकार, कुल mRNA के अध्ययन प्रोटीन बहुतायत के बारे में अपेक्षाकृत गरीब जानकारी देता है। दूसरी ओर, राइबोसोम के साथ mRNA के सहयोग से उन अनुवाद में शामिल mRNAs के लिए उपयोग देकर प्रोटीन बहुतायत में बेहतर जानकारी देता है। सक्रिय रूप से अनुवाद mRNAs संरचनाओं polysomes बुलाया में कई राइबोसोम के साथ जुड़े रहे हैं। इसके विपरीत, खराब अनुवाद mRNAs केवल एक राइबोसोम (monosome) के साथ संबद्ध किया जाएगा। नतीजतन, एक mRNA के translational स्थिति राइबोसोम 7 के साथ अपने सहयोग की निगरानी के द्वारा मूल्यांकन किया जा सकता है।
इस प्रोटोकॉल छह दिन पुराने Arabidopsis thaliana अंकुर, आरएनए के बाद के अलगाव से polysomes के अलगाव, और परिणाम का विश्लेषण बताता है। पोlysomes और monosomes एक सुक्रोज घनत्व ढाल के माध्यम से अलग हो रहे हैं। ढ़ाल छह भागों में एकत्र कर रहे हैं। polysomes, monosomes और प्रकाश अंश (इसके बाद बुलाया सतह पर तैरनेवाला) है, जो नि: शुल्क 60 और 40S ribosomal सब यूनिटों और mRNAs कि राइबोसोम के साथ जुड़े नहीं हैं: अंशों से कुछ अच्छी तरह से तीन अलग भागों प्राप्त करने के लिए जमा कर रहे हैं। वैश्विक अनुवाद गतिविधि एक polysome / monosome अनुपात है, जो वक्र के तहत क्षेत्र के एकीकरण के द्वारा निर्धारित किया जाता पैदा करने से अनुमान लगाया जा सकता है, और polysomes प्रोफाइल की तुलना द्वारा। mRNAs और प्रोटीन तो विभिन्न भागों से निकाले और आरटी पीसीआर, QRT- पीसीआर, उत्तरी धब्बा, माइक्रोएरे, पश्चिमी धब्बा या प्रोटिओमिक्स द्वारा विश्लेषण के लिए उपयोग किया जाता है। इस प्रोटोकॉल अन्य पौधों और ऊतकों के लिए मान्य किया गया है।
उपकरण इस प्रोटोकॉल प्रदर्शन करने के लिए आवश्यक आमतौर पर ज्यादातर प्रयोगशालाओं में पाए जाते हैं: एक ढाल निर्माता के लिए कोई जरूरत नहीं है। अगले एक को रोकने के जोड़ने से पहले प्रत्येक परत बर्फ़ीलीकिसी भी मिश्रण या परतों की अशांति से है। कोई ट्यूब बेधनेवाला ढाल संग्रह जो ढाल में एक गिलास केशिका ट्यूब के विसर्जन के द्वारा प्राप्त किया जा सकता है के लिए प्रयोग किया जाता है। इसलिए, महंगा ultracentrifuge ट्यूबों undamaged बनी रहती है और कई बार फिर से इस्तेमाल किया जा सकता है। सामूहिक रूप से, यह वर्तमान प्रोटोकॉल polysome रूपरेखा के लिए एक आसान और सस्ते विधि बनाता है।
Protocol
Representative Results
Discussion
The protocol we present here is an easy and cheap method for generating polysome profiles and isolating mRNAs associated with polysomes, single ribosomes or free of ribosomes. A wide range of different polysome fractionation methods is described in the literature. The method we have described here has been optimized to keep only the necessary compounds and has been adapted for plant material. In particular, we reduced the amount of detergent11 and added chloramphenicol to the buffer to fix the chloroplastic ri…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
इस काम फ्रेंच राष्ट्रीय अनुसंधान एजेंसी (ANR-14-CE02-0010) द्वारा समर्थित किया गया। हम पांडुलिपि के महत्वपूर्ण पढ़ने के लिए डॉ बेंजामिन फील्ड और डॉ Elodie Lanet धन्यवाद। हम वीडियो संपादन के साथ उनकी मदद के लिए श्री मिशेल Terese धन्यवाद।
Materials
| Ultracentrifuge tube, thinwall, polyallomer – 13.2 ml | Beckman Coulter | 331372 | |
| Ultracentrifuge tube, thinwall, polyallomer – 38.5 ml | Beckman Coulter | 326823 | |
| Glass capillary tube | Drummond Scientific | 1-000-1000 | |
| Ultracentrifuge | Beckman Coulter | Optima series | |
| Ultracentrifuge Rotor SW41 | Beckman Coulter | 331362 | |
| Ultracentrifuge Rotor SW32 | Beckman Coulter | 369650 | |
| Peristaltic pump | Any | ||
| Tygon R3607 polyvinyl chloride tubing | Fisher Scientific | 070534-22 | Polyvinyl chloride tubing, 2.29 mm |
| Fraction collector Model 2110 | Bio-Rad | 731-8120 | |
| UV cuvette | Hellma | 170.700-QS | Quartz flow-through cuvette |
| UV Spectrophotometer | Varian | Cary50 | Read every 0.0125 sec |
| All chemicals | Any | Use only Molecular Biology Grade | |
| Murashige and Skoog Basal Salt Mixture (MS) | Sigma-Aldrich | M5524 | |
| Rnase-Free water | Any | ||
| Petri Dishes | Fisher Scientific | 10083251 | |
| Octylphenoxy poly(ethyleneoxy)ethanol, branched (Nonidet P40) | Euromedex | UN3500 | |
| Linear acrylamide (acryl carrier) | ThermoFischer scientific | AM9520 | RNA precipitation carrier |
| OriginPro 8 | OriginLab | Analysis software |
References
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