En enkel metode for Plant Polysome Profiling

Summary

This protocol describes an easy method to extract and fractionate transcripts from plant tissues on the basis of the number of bound ribosomes. It allows a global estimate of translation activity and the determination of the translational status of specific mRNAs.

Abstract

Translation of mRNA to protein is a fundamental and highly regulated biological process. Polysome profiling is considered as a gold standard for the analysis of translational regulation. The method described here is an easy and economical way for fractionating polysomes from various plant tissues. A sucrose gradient is made without the need for a gradient maker by sequentially freezing each layer. Cytosolic extracts are then prepared in a buffer containing cycloheximide and chloramphenicol to immobilize the cytosolic and chloroplastic ribosomes to mRNA and are loaded onto the sucrose gradient. After centrifugation, six fractions are directly collected from the bottom to the top of the gradient, without piercing the ultracentrifugation tube. During collection, the absorbance at 260 nm is read continuously to generate a polysome profile that gives a snapshot of global translational activity. Fractions are then pooled to prepare three different mRNA populations: the polysomes, mRNAs bound to several ribosomes; the monosomes, mRNAs bound to one ribosome; and mRNAs that are not bound to ribosomes. mRNAs are then extracted. This protocol has been validated for different plants and tissues including Arabidopsis thaliana seedlings and adult plants, Nicotiana benthamiana, Solanum lycopersicum, and Oryza sativa leaves.

Introduction

Proteinsyntese er en viktig og energimessig kostbar prosess i alle celler ^1. Først av alt må investere celler energi i produksjonen av oversettelsen maskineri, ribosomene. For eksempel et aktivt delende gjærcelle som produserer så mye som 2000 ribosomer pr minutt. En slik produksjon krever opp til 60% av den totale transkripsjonen aktivitet og opp til 90% av den totale aktivitet spleising av cellen ^2. I tillegg er energien som kreves for syntesen av aminosyrer, aminoacyl-tRNA og peptidbindinger. I planter, tilsetning av en aminosyre til en peptidkjede koster fra 4,5 til 5,9 molekyler av ATP ^3. Derfor er det ikke overraskende at translasjonen av mRNA til protein er et hovedsete for regulering, særlig når det gjelder å håndtere endrede miljøforhold.

Innvielsen trinn i oversettelsen, som er foreningen av et mRNA med ribosomet, er det viktigste målet for reguleringen avoversettelse ^fire. Som en konsekvens av regulering av translasjon, så vel som andre post-transkripsjonelle regulatoriske trinn, kan bare 40% av variasjonen i proteinkonsentrasjon forklares ved mRNA-overflod ^5,6. Dermed studiet av total mRNA gir relativt dårlig informasjon om protein overflod. På den annen side, foreningen av mRNA med ribosomer gir bedre innsikt i protein overflod ved å gi tilgang til disse mRNA involvert i oversettelsen. Aktivt oversatte mRNA er forbundet med flere ribosomer i strukturer kalt polysomes. Omvendt vil dårlig oversatte mRNA være forbundet med bare en ribosom (monosome). Følgelig kan den translatoriske status for et mRNA bli evaluert ved å overvåke sin tilknytning til ribosomer ^7.

Denne protokollen beskriver isoleringen av polysomes fra seks dager gamle Arabidopsis thaliana planter, den etterfølgende isolering av RNA, og analyse av resultatene. Polysomes og monosomes skilles gjennom en sukrose tettshetsgradient. Gradienter er samlet inn i seks fraksjoner. Noen av fraksjonene slås sammen for å oppnå tre godt separerte fraksjoner: polysomes, monosomes og lettfraksjonen (heretter kalt supernatant), som inneholder frie 60S og 40S ribosomale subenheter og mRNA som ikke er forbundet med ribosomer. Global oversettelse aktivitet kan estimeres ved å generere et polysome / monosome-forhold, som bestemmes ved integrering av arealet under kurven, og ved å sammenligne polysomes profiler. mRNA og proteiner blir så trukket ut fra de forskjellige fraksjoner og anvendt for analyse ved hjelp av RT-PCR, QRT-PCR, Northern blot, mikromatriser, western blot eller proteomikk. Denne protokollen er validert for andre planter og vev.

Utstyret som kreves for å utføre denne protokollen er ofte funnet i de fleste laboratorier: Det er ikke behov for en gradient maker. Frysing hvert lag før du legger den neste hindres fra en blanding eller forstyrrelse av lagene. Ingen rør gjennomtrenger benyttes for samling gradient som kan oppnås ved neddykking av et glass kapillarrør i gradienten. Derfor er de kostbare ultrasentrifuge-rør forbli uskadet og kan brukes om igjen mange ganger. Samlet gjør dette til den nåværende protokollen en enkel og billig metode for polysome profilering.

Protocol

1. Fremstilling av 20 til 50% (w / v) sukrosegradienter Merk: gradienter er laget av 4 lag sukrose (50%, 35% og 2 lag med 20%) i en 13,2 ml ultrasentrifuge tube. I vår erfaring, helle 20% sukrose i to separate lag forbedrer kvaliteten på polysome forberedelser. Forbered lager løsninger. Sørg for at alle løsninger er RNase og DNAse gratis. Forbered 10X Salt Solution: 400 mM Tris-HCl pH 8,4, 200 mM KCI og 100 mM MgCl2. Forbered to M Sukrose Løsnin…

Representative Results

I litteraturen blir polysome profilene ofte vist fra den lette fraksjonen av den tunge fraksjonen som et resultat av måten gradientene blir samlet inn, det vil si fra toppen til bunnen. Siden i protokollen beskrevet her gradienter er samlet fra bunnen til toppen, profilene vi viser starte med den tunge fraksjonen (de polysomes) og gå til den lette fraksjonen (gratis ribosom subenheter og RNA) (figur 2A). Vi samler deretter hver gradient i seks 2 ml fraksjoner, men mind…

Discussion

The protocol we present here is an easy and cheap method for generating polysome profiles and isolating mRNAs associated with polysomes, single ribosomes or free of ribosomes. A wide range of different polysome fractionation methods is described in the literature. The method we have described here has been optimized to keep only the necessary compounds and has been adapted for plant material. In particular, we reduced the amount of detergent¹¹ and added chloramphenicol to the buffer to fix the chloroplastic ri…

Materials

Ultracentrifuge tube, thinwall, polyallomer – 13.2 ml	Beckman Coulter	331372
Ultracentrifuge tube, thinwall, polyallomer – 38.5 ml	Beckman Coulter	326823
Glass capillary tube	Drummond Scientific	1-000-1000
Ultracentrifuge	Beckman Coulter	Optima series
Ultracentrifuge Rotor SW41	Beckman Coulter	331362
Ultracentrifuge Rotor SW32	Beckman Coulter	369650
Peristaltic pump	Any
Tygon R3607 polyvinyl chloride tubing	Fisher Scientific	070534-22	Polyvinyl chloride tubing, 2.29 mm
Fraction collector Model 2110	Bio-Rad	731-8120
UV cuvette	Hellma	170.700-QS	Quartz flow-through cuvette
UV Spectrophotometer	Varian	Cary50	Read every 0.0125 sec
All chemicals	Any		Use only Molecular Biology Grade
Murashige and Skoog Basal Salt Mixture (MS)	Sigma-Aldrich	M5524
Rnase-Free water	Any
Petri Dishes	Fisher Scientific	10083251
Octylphenoxy poly(ethyleneoxy)ethanol, branched (Nonidet P40)	Euromedex	UN3500
Linear acrylamide (acryl carrier)	ThermoFischer scientific	AM9520	RNA precipitation carrier
OriginPro 8	OriginLab		Analysis software