En enkel metod för växt polysom Profiling
Summary
This protocol describes an easy method to extract and fractionate transcripts from plant tissues on the basis of the number of bound ribosomes. It allows a global estimate of translation activity and the determination of the translational status of specific mRNAs.
Abstract
Translation of mRNA to protein is a fundamental and highly regulated biological process. Polysome profiling is considered as a gold standard for the analysis of translational regulation. The method described here is an easy and economical way for fractionating polysomes from various plant tissues. A sucrose gradient is made without the need for a gradient maker by sequentially freezing each layer. Cytosolic extracts are then prepared in a buffer containing cycloheximide and chloramphenicol to immobilize the cytosolic and chloroplastic ribosomes to mRNA and are loaded onto the sucrose gradient. After centrifugation, six fractions are directly collected from the bottom to the top of the gradient, without piercing the ultracentrifugation tube. During collection, the absorbance at 260 nm is read continuously to generate a polysome profile that gives a snapshot of global translational activity. Fractions are then pooled to prepare three different mRNA populations: the polysomes, mRNAs bound to several ribosomes; the monosomes, mRNAs bound to one ribosome; and mRNAs that are not bound to ribosomes. mRNAs are then extracted. This protocol has been validated for different plants and tissues including Arabidopsis thaliana seedlings and adult plants, Nicotiana benthamiana, Solanum lycopersicum, and Oryza sativa leaves.
Introduction
Proteinsyntes är en viktig och energiskt kostsam process i alla celler 1. Först av allt, måste celler såväl energi i produktionen av översättningsmaskiner, ribosomerna. Till exempel en aktivt dela jästcellen producerar så mycket som 2000 ribosomer per minut. En sådan produktion kräver upp till 60% av den totala transkriptionsaktivitet och upp till 90% av den totala skarvnings aktiviteten hos cellen 2. Dessutom krävs energi för syntes av aminosyror, aminoacyl-tRNA och peptidbindningar. I växter och att addera en aminosyra till en peptidkedja kostnader från 4,5 till 5,9 molekyler ATP 3. Därför är det inte förvånande att översättningen av mRNA till protein är en viktig plats för reglering, i synnerhet när det gäller att hantera förändrade miljöförhållanden.
Den inledande steget översättning, som är en sammanslutning av ett mRNA med ribosomen, är det främsta målet för regleringen avöversättning 4. Som en konsekvens av regleringen av översättning samt andra post-transkriptionella regulatoriska steg, kan bara 40% av variationerna i proteinkoncentration förklaras av mRNA överflöd 5,6. Således, studiet av den totala mRNA ger relativt dålig information om protein överflöd. Å andra sidan, en sammanslutning av mRNA med ribosomer ger bättre inblick i protein överflöd genom att ge tillgång till dessa mRNA är inblandade i översättningen. Aktivt översatta mRNA är förknippade med flera ribosomer i strukturer som kallas polysomer. Omvänt kommer dåligt översatta mRNA vara associerad med endast en ribosomen (monosome). Följaktligen kan den translation status av ett mRNA utvärderas genom att övervaka dess association med ribosomer 7.
Detta protokoll beskriver isoleringen av polysomer från sex dagar gamla Arabidopsis thaliana plantor, den efterföljande isoleringen av RNA, och analysen av resultaten. polysomes och monosomes separeras genom en sackarosdensitetsgradient. Gradienter samlas i sex fraktioner. Några av de fraktioner slås samman för att erhålla tre väl åtskilda fraktioner: polysomer, monosomes och den lätta fraktionen (nedan kallad supernatant), som innehåller den fria 60S och 40S ribosomala subenheter och mRNA som inte är förknippade med ribosomer. Global översättningsverksamhet kan uppskattas genom att generera en polysom / monosome förhållande, som bestäms genom integrering av arean under kurvan, och genom att jämföra polysomer profiler. mRNA och proteiner extraheras sedan från de olika fraktionerna och användes för analys av RT-PCR, QRT-PCR, Northern blot, microarray, western blöt eller proteomik. Detta protokoll har godkänts för andra växter och vävnader.
Den utrustning som krävs för att utföra detta protokoll är vanligt förekommande i de flesta laboratorier: Det finns inget behov av en gradient maker. Frysning varje lager innan du lägger nästa förhindras från någon blandning eller störningar av skikten. Ingen röret piercer används för gradient samling som kan uppnås genom nedsänkning av en glas kapillärrör i gradienten. Därför dyra ultracentrifugrör förblir oskadad och kan återanvändas många gånger. Sammantaget gör detta det nuvarande protokollet en enkel och billig metod för polysom profilering.
Protocol
Representative Results
Discussion
The protocol we present here is an easy and cheap method for generating polysome profiles and isolating mRNAs associated with polysomes, single ribosomes or free of ribosomes. A wide range of different polysome fractionation methods is described in the literature. The method we have described here has been optimized to keep only the necessary compounds and has been adapted for plant material. In particular, we reduced the amount of detergent11 and added chloramphenicol to the buffer to fix the chloroplastic ri…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Detta arbete stöddes av den franska nationella forskningsinstitut (ANR-14-CE02-0010). Vi tackar Dr Benjamin Field och Dr Elodie Lanet för kritisk läsning av manuskriptet. Vi tackar Michel Terese för hans hjälp med videoredigering.
Materials
| Ultracentrifuge tube, thinwall, polyallomer – 13.2 ml | Beckman Coulter | 331372 | |
| Ultracentrifuge tube, thinwall, polyallomer – 38.5 ml | Beckman Coulter | 326823 | |
| Glass capillary tube | Drummond Scientific | 1-000-1000 | |
| Ultracentrifuge | Beckman Coulter | Optima series | |
| Ultracentrifuge Rotor SW41 | Beckman Coulter | 331362 | |
| Ultracentrifuge Rotor SW32 | Beckman Coulter | 369650 | |
| Peristaltic pump | Any | ||
| Tygon R3607 polyvinyl chloride tubing | Fisher Scientific | 070534-22 | Polyvinyl chloride tubing, 2.29 mm |
| Fraction collector Model 2110 | Bio-Rad | 731-8120 | |
| UV cuvette | Hellma | 170.700-QS | Quartz flow-through cuvette |
| UV Spectrophotometer | Varian | Cary50 | Read every 0.0125 sec |
| All chemicals | Any | Use only Molecular Biology Grade | |
| Murashige and Skoog Basal Salt Mixture (MS) | Sigma-Aldrich | M5524 | |
| Rnase-Free water | Any | ||
| Petri Dishes | Fisher Scientific | 10083251 | |
| Octylphenoxy poly(ethyleneoxy)ethanol, branched (Nonidet P40) | Euromedex | UN3500 | |
| Linear acrylamide (acryl carrier) | ThermoFischer scientific | AM9520 | RNA precipitation carrier |
| OriginPro 8 | OriginLab | Analysis software |
References
- Nelson, C. J., Millar, A. H. Protein turnover in plant biology. Nat Plants. 1 (3), 15017 (2015).
- Warner, J. R. The economics of ribosome biosynthesis in yeast. Trends Biochem Sci. 24 (11), 437-440 (1999).
- Amthor, J. S. The McCree-de Wit-Penning de Vries-Thornley Respiration Paradigms: 30 Years Later. Ann Bot. 86 (1), 1-20 (2000).
- Preiss, T., W Hentze, M. Starting the protein synthesis machine: eukaryotic translation initiation. BioEssays news and reviews in molecular, cellular and developmental biology. 25 (12), 1201-1211 (2003).
- Vogel, C., Marcotte, E. M. Insights into the regulation of protein abundance from proteomic and transcriptomic analyses. Nat Rev Genet. 13 (4), 227-232 (2013).
- Baerenfaller, K., et al. Genome-scale proteomics reveals Arabidopsis thaliana gene models and proteome dynamics. Science. 320 (5878), 938-941 (2008).
- Zanetti, E., Chang, I., Gong, F., Galbraith, D. W., Bailey-Serres, J. Immunopurification of Polyribosomal Complexes of Arabidopsis for Global Analysis of Gene Expression. Plant physiol. 138 (2), 624-635 (2005).
- Murashige, T., Skoog, F. A revised medium for rapid growth and bioassays with tobacco tissue cultures. Physiol plant. 15 (3), 473-497 (1962).
- del Prete, M. J., Vernal, R., Dolznig, H., Müllner, E. W., Garcia-Sanz, J. A. Isolation of polysome-bound mRNA from solid tissues amenable for RT-PCR and profiling experiments. RNA. 13 (3), 414-421 (2007).
- Salinas, J., Sanchez-Serrano, J. J. . Arabidopsis protocols. , (2006).
- Piques, M., et al. Ribosome and transcript copy numbers, polysome occupancy and enzyme dynamics in Arabidopsis. Mol syst biol. 5 (314), 314 (2009).
- Morita, M., Alain, T., Topisirovic, I., Sonenberg, N. Polysome Profiling Analysis. bio-protocol. 3 (14), 3-8 (2013).
- Yángüez, E., Castro-Sanz, A. B., Fernández-Bautista, N., Oliveros, J. C., Castellano, M. M. Analysis of genome-wide changes in the translatome of Arabidopsis seedlings subjected to heat stress. PloS One. 8 (8), (2013).
- Sormani, R., et al. Sublethal cadmium intoxication in Arabidopsis thaliana impacts translation at multiple levels. Cell Physiol. 52 (2), 436-447 (2011).
- Lanet, E., et al. Biochemical evidence for translational repression by Arabidopsis microRNAs. Plant cell. 21 (6), 1762-1768 (2009).
- Jabnoune, M., Secco, D., Lecampion, C., Robaglia, C., Shu, Q., Poirier, Y. A Rice cis-Natural Antisense RNA Acts as a Translational Enhancer for Its Cognate mRNA and Contributes to Phosphate Homeostasis and Plant Fitness. Plant cell. 25 (10), 4166-4182 (2013).
- Ingolia, N. T. Genome-wide translational profiling by ribosome footprinting. Methods Enzymol. 470 (10), (2010).
- Juntawong, P., Girke, T., Bazin, J., Bailey-Serres, J. Translational dynamics revealed by genome-wide profiling of ribosome footprints in Arabidopsis. PNAS. 111 (1), 203-212 (2013).
- Ingolia, N. T. Ribosome profiling: new views of translation, from single codons to genome scale. Nat Rev Genet. 15 (3), 205-213 (2014).
