Framställning av Single-kohort kolonier och hormonbehandling av arbetsbin Analysera fysiologi associerad med Roll och / eller endokrina systemet

Summary

Här beskriver vi vår detaljerade protokoll för framställning av en enda kohort honungs kolonier – ett användbart verktyg för att analysera rollen associerade arbetare fysiologi. Vi beskriver också detaljerade protokoll för behandling av arbetare med juvenil hormon och ekdyson att utvärdera medverkan av dessa hormoner i regleringen av arbetar beteende och / eller fysiologi.

Abstract

Honeybee workers are engaged in various tasks related to maintaining colony activity. The tasks of the workers change according to their age (age-related division of labor). Young workers are engaged in nursing the brood (nurse bees), while older workers are engaged in foraging for nectar and pollen (foragers). The physiology of the workers changes in association with this role shift. For example, the main function of the hypopharyngeal glands (HPGs) changes from the secretion of major royal jelly proteins (MRJPs) to the secretion of carbohydrate-metabolizing enzymes. Because worker tasks change as the workers age in typical colonies, it is difficult to discriminate the physiological changes that occur with aging from those that occur with the role shift. To study the physiological changes in worker tissues, including the HPGs, in association with the role shift, it would be useful to manipulate the honeybee colony population by preparing single-cohort colonies in which workers of almost the same age perform different tasks. Here we describe a detailed protocol for preparing single-cohort colonies for this analysis. Six to eight days after single-cohort colony preparation, precocious foragers that perform foraging tasks earlier than usual appear in the colony. Representative results indicated role-associated changes in HPG gene expression, suggesting role-associated HPG function. In addition to manipulating the colony population, analysis of the endocrine system is important for investigating role-associated physiology. Here, we also describe a detailed protocol for treating workers with 20-hydroxyecdysone (20E), an active form of ecdysone, and methoprene, a juvenile hormone analogue. The survival rate of treated bees was sufficient to examine gene expression in the HPGs. Gene expression changes were observed in response to 20E- and/or methoprene-treatment, suggesting that hormone treatments induce physiological changes of the HPGs. The protocol for hormone treatment described here is appropriate for examining hormonal effects on worker physiology.

Introduction

Den europeiska honungsbiet, Apis mellifera, är en eusocial insekt med en mycket organiserat samhälle ^1. Arbetsbin (arbets kast) är engagerade i olika åtgärder för att upprätthålla koloni aktivitet, och dessa uppgifter ändras beroende på arbetstaga honeybee ålder efter eclosion, som kallas åldersrelaterad arbetsfördelning ^2-4. Unga arbetstagare (<13 dagar gamla) tar hand om yngel i kupan genom att utsöndra bidrottninggelé (sjuksköterska bin), medan äldre (> 15 dagar gamla) samla nektar och pollen utanför kupan (hackar) ^2-4. Fysiologi arbetarna förändras i samband med denna roll skift. Till exempel, funktionen hos de hypofarynxcancer körtlar (HPGs), parade exokrina körtlar belägna i huvudet, förändringar i association med den roll förskjutning från omvårdnad för födoinsamlande ^2,5. Sjuksköterska bee HPGs syntetisera huvudsakligen stora drottninggelé proteiner, som är viktiga komponenter i bee mjölk. Å andra sidan, fält HPGs huvudsakligensyntetisera kolhydrat metaboliserande enzymer, såsom α-glukosidas III, för att bearbeta nektar in honung genom att omvandla sackaros till glukos och fruktos. Våra tidigare studier avslöjade att uttrycket av mrjp2, som kodar en stor drottninggelé protein och Hbg3, som kodar α-glukosidas III, förändringar under roll skift ^6-9.

För att avgöra om de fysiologiska förändringar i arbetstaga vävnader, inklusive HPGs, är förknippad med rollen skift eller med en ålder av arbetarna, skulle det vara lämpligt att manipulera befolkningen sammansättningen av en honungsbinas koloni, såsom att förbereda enda kohort kolonier där arbetarna i nästan samma ålder utföra olika uppgifter ^10,11. Robinson et al. (1989) beskrev en metod för att upprätta en enda kohort koloni ^10. Single-kohort kolonier omfattar initialt en drottning och 0-2 dagar gamla arbetstagare. Flera dagar efter fastställande av kolonierna, arbetarna i almost samma ålder anta olika uppgifter. Några arbetare utför omvårdnadsuppgifter som i typiska kolonier, medan andra arbetstagare utför födosök uppgifter tidigare än vanligt och därför kallas brådmogna hackar. Genuttryck jämförelser mellan sjuksköterska bin och brådmogen hackar skulle ge användbar information om den roll associerade fysiologi arbetar vävnader ^12-16. Här beskriver vi ett detaljerat protokoll för framställning av single-kohort kolonier för analys av roll- och / eller åldersrelaterad fysiologi HPGs ^16. Vi har också kortfattat beskriva hur att undersöka genuttrycket av mrjp2 och Hbg3 genom kvantitativ omvänd transkription-polymeraskedjereaktion (RT-PCR) för att utvärdera HPG fysiologi.

Utöver analysen av arbetar fysiologi i enkel kohortstudier kolonier, är viktigt för att analysera de reglerande mekanismerna för roll tillhörande arbetare fysiologi undersökning av det endokrina systemet. Juvenil hormon (JH), som KNOwn som "status quo" hormon i insektslarver, accelererar skiftet i rollen från omvårdnad till födosök i arbetsbin ^11. Vidare ekdyson, som är känd som ömsat hormon under metamorfos, kan vara inblandade i rollen skift som gener som kodar för ekdyson signalmolekyler uttrycks i svamp kroppar, en högre centrum för arbetstagaren hjärnan ^17-19. Därför beskriver vi också detaljerat protokoll som används i vår tidigare studie ¹⁶ att behandla arbetstagare med 20E, som är en aktiv form av ekdyson, och metopren, en JH analog, för analys av effekten av det endokrina systemet på HPG fysiologi (uttryck av mrjp2 och Hbg3).

Protocol

1. Framställning av Single-cohort kolonier Förbered tre honungs kolonier att skapa två enkel kohort kolonier och att få ett tillräckligt antal nykläckta arbetare. Kontrollera att vissa puppor i utjämnade perifera celler i kammar har bruna ögon och en pigmenterad nagelband genom att öppna utjämnade kammar använder pincett. Om dessa puppor finns i perifera kam celler, kommer de flesta av puppor i hela kammar dyka upp i ca 1-3 dagar. Därefter samlar kammar innehåller dessa puppor …

Representative Results

En översikt av protokollet för framställning av single-cohort kolonier visas i figur 1A. Tidsförloppet för experiment från framställning av single-cohort kolonier till provsamling visas i figur 1B. Arbetare som uppfyller de beteende kriterierna för omvårdnad beteende eller födosöksbeteende samlades från en enda cohort kolonier, och HPG utveckling uppskattades i dessa arbetare Tabell 1 visar klassificeringen av HPG utveckling …

Discussion

Framställning av en enda cohort kolonier

Här har vi beskrivit det protokoll som används i vår tidigare studie ¹⁶ att förbereda enda kohort kolonier för analys av HPG fysiologi i samband med övergången i rollen som arbetstagare bin. Sjuksköterska bin och brådmogen hackar som uppfyllde de kriterier som beskrivs i försök 1,6-1,7 och Figur 2 observerades i en enda kohort kolonier (tabell 1). Fotografierna i figur 2 skulle …

Materials

UNIPOSCA	Mitsubishi pencil	PC-5M	Marker pen for the application of marks to bees
20-hydroxyecdysone	Sigma Aldrich	H5142
Methoprene	Sigma Aldrich	33375
Breeding case insect	IRIS OHYAMA	CP-SS
Electromotion mixier	ISO	23M-R25	homogenization of tissue
TRIZol Reagent	Invitrogen	15596-026	the reagent for total RNA extraction
DNase I	Takara	2270A
PrimeScript RT reagent kit	Takara	RR037A	the reagent for reverse transcription
SYBR Premix ExTaq II	Takara	RR820A	the reagent for real-time PCR
LightCycle 1.2 Instrument	Roche	12011468001	the instrument for real-time PCR
LightCycle Capillaries (20μl)	Roche	4929292001	the material for real-time PCR