Een High-gehalte<em&gt; In Vitro</em&gt; Eilandjes van Langerhans β-cel Replication Discovery Platform

Zhengshan Zhao; Yassan Abdolazimi; Neali A. Armstrong; Justin P. Annes

doi:10.3791/54298

Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.

Methodenartikel

Een High-gehalte

10.6K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/54298

⸱

16 juli 2016

Zhengshan Zhao¹ , Yassan Abdolazimi¹ , Neali A. Armstrong¹ , Justin P. Annes¹

¹Department of Medicine, Division of Endocrinology, Stanford University School of Medicine

In dit artikel

Samenvatting

Cruciale uitdagingen voor het onderzoeksgebied diabetes zijn de moleculaire mechanismen die eilandje β-cellen replicatie en op werkwijzen voor het stimuleren van β-celregeneratie ontwikkelen begrijpen. Hierin een high-gehalte screening methode voor het identificeren en evalueren van de β-cel-replicatie bevorderende activiteit van kleine moleculen wordt gepresenteerd.

Samenvatting

Verlies van insulineproducerende β-cellen is een centraal kenmerk van diabetes. Hoewel er verschillende potentiële vervangende therapieën worden onderzocht, blijft de uitbreiding van endogene insulineproducerende pancreatische eilandjes β-cellen een aantrekkelijke strategie. β-cellen hebben een beperkte spontane regeneratieve activiteit; bijgevolg is een cruciale onderzoeksinspanning om een nauwkeurig begrip te ontwikkelen van de moleculaire paden die β-celgroei beperken en om geneesmiddelen te identificeren die in staat zijn deze beperkingen te overwinnen. Hier wordt een geautomatiseerde hoogwaardige beeldgebaseerde primaire celscreeningsmethode gepresenteerd om β-celreplicatie-bevorderende kleine moleculen te identificeren. Verschillende beperkingen van eerdere methodologieën worden overwonnen. Ten eerste, het gebruik van primaire eilandjescellen in plaats van een geïmmortaliseerde cellijn maximaliseert het behoud van in vivo groeirestricties. Ten tweede, het gebruik van gemengde samenstelling eilandje-celculturen in plaats van een β-cellijn maakt het mogelijk om zowel lijnbeperkte als algemene groei-stimulatoren te identificeren. Ten derde, maakt de techniek het praktisch om primaire eilandjes te gebruiken, een beperkte bron, door gebruik van een 384-well formaat. Ten vierde, wordt schadelijke experimentele variabiliteit geassocieerd met onregelmatige eilandje-cultuurkwaliteit overwonnen door optimalisatie van isolatie-, dispersi-, platerings- en cultuurparameters. Ten vijfde, de moeilijkheden om de lage basale replicatiesnelheid van eilandje-endocriene cellen nauwkeurig en consistent te meten, worden overwonnen met geoptimaliseerde immunokleuringparameters, geautomatiseerde data-acquisitie en data-analyse; automatisering verbetert tegelijkertijd de doorvoer en beperkt de experimentatorbias. Opmerkelijke beperkingen van deze assay zijn het gebruik van verspreide eilandje-culturen die de eilandje-architectuur verstoren, het gebruik van knaagdier- in plaats van humane eilandjes en de inherente beperkingen van doorvoer en kosten geassocieerd met het gebruik van primaire cellen. Belangrijk is dat de strategie gemakkelijk kan worden aangepast voor humane eilandje-replicatiestudies. Deze assay is goed geschikt voor het onderzoeken van het mitogene effect van stoffen op β-cellen en de moleculaire mechanismen die β-celgroei reguleren.

Inleiding

Diabetes omvat een verzameling van aandoeningen delen de gemeenschappelijke eindpunt van verstoorde glucose homeostase. Hoewel de pathogene mechanismen van diabetes subtypen worden onderscheiden, delen ze het gevolg van verminderde β-celmassa, bijvoorbeeld, verlies van insulineproductie capaciteit ^1,2. Momenteel diabetes behandelingsstrategieën vertrouwen op chronische toediening van exogeen insuline, farmacologische stimulering van insulineproductie of verbetering van de insulinegevoeligheid, en zelden, de transplantatie van pancreaseilandjes of hele alvleesklier ^3,4. Helaas, het succes van deze strategieën is van korte duur en / of ni....