En hög halt<em> In Vitro</em> Pancreatic Islet β-cell replikering Discovery Platform

Summary

Kritiska utmaningar för diabetesforskningen fältet är att förstå de molekylära mekanismer som reglerar ö β-cellreplikation och för att utveckla metoder för att stimulera β-cellförnyelsen. Häri en hög halt screening metod för att identifiera och bedöma β-cellreplikation främjande aktivitet av små molekyler presenteras.

Abstract

Loss of insulin-producing β-cells is a central feature of diabetes. While a variety of potential replacement therapies are being explored, expansion of endogenous insulin-producing pancreatic islet β-cells remains an attractive strategy. β-cells have limited spontaneous regenerative activity; consequently, a crucial research effort is to develop a precise understanding of the molecular pathways that restrain β-cell growth and to identify drugs capable of overcoming these restraints. Herein an automated high-content image-based primary-cell screening method to identify β-cell replication-promoting small molecules is presented. Several, limitations of prior methodologies are surmounted. First, use of primary islet cells rather than an immortalized cell-line maximizes retention of in vivo growth restraints. Second, use of mixed-composition islet-cell cultures rather than a β-cell-line allows identification of both lineage-restricted and general growth stimulators. Third, the technique makes practical the use of primary islets, a limiting resource, through use of a 384-well format. Fourth, detrimental experimental variability associated with erratic islet culture quality is overcome through optimization of isolation, dispersion, plating and culture parameters. Fifth, the difficulties of accurately and consistently measuring the low basal replication rate of islet endocrine-cells are surmounted with optimized immunostaining parameters, automated data acquisition and data analysis; automation simultaneously enhances throughput and limits experimenter bias. Notable limitations of this assay are the use of dispersed islet cultures which disrupts islet architecture, the use of rodent rather than human islets and the inherent limitations of throughput and cost associated with the use of primary cells. Importantly, the strategy is easily adapted for human islet replication studies. This assay is well suited for investigating the mitogenic effect of substances on β-cells and the molecular mechanisms that regulate β-cell growth.

Introduction

Diabetes omfattar en samling av sjukdomar som delar den gemensamma slutpunkten av sönder glukoshomeostas. Även de patogena mekanismerna för diabetes subtyper är olika, de delar en följd av minskad β-cellmassan, det vill säga förlust av insulinproduktionen kapacitet ^1,2. För närvarande diabetes behandlingsstrategier lita på kronisk administrering av exogent insulin, farmakologisk stimulering av produktion eller förstärkning av insulininsulinkänslighet, och sällan, transplantation av pankreasöar eller hela bukspottkörteln ^3,4. Tyvärr, är framgången för dessa strategier kortlivad och / eller underlåter att tillräckligt rekapitulera funktionen av insulinproduktion. Trots användbarheten av att utveckla en metod för att stimulera β-cellförnyelsen, existerar inget sådant tillvägagångssätt. Följaktligen är en stor diabetesforskningen mål att utveckla metoder för att generera nya p-celler eller att expandera endogen β-cellmassan ⁵ </sup>. Även β-cellförnyelsen från förnybara källor som embryonala stamceller går framåt, säkerhet och effektivitetsproblem gör jakten på alternativa strategier, inklusive expansion av mogna p-celler, en prioritet ^6,7. Viktigt är den dominerande källan till nya p-celler in vivo redan existerande p-celler snarare än specialiserade progenitorceller ^8,9. Även p-celler verkar ha begränsad replikering kapacitet, en liten ökning av β-cellmassan (~ 30%) kan vara tillräcklig för att återställa glukoshomeostas i många diabetiker. Vidare in situ farmakologisk stimulering av β-cellmassan är en potentiellt billig och skalbar behandlingsstrategi. Häri en hög halt screening metod för att identifiera och karakterisera små molekyler som stimulerar β-celltillväxt presenteras.

Ett flertal in vitro experimentella metoder kan användas för att identifiera genprodukter och / eller molekyler that främja primär β-cellreplikation. Tidiga insatser för att mäta β-cellreplikation induktion används foster gnagare pancreata kultur eller intakta isolerade ö kulturer för att mäta ^[3 H] tymidininkorporering, BrdU inkorporering eller mitotiska kroppar i aldehyd-tionin eller insulin färgade befolkningen i svar på specifika behandlingsförhållanden ^{10, 11.} Dessa in vitro metoder och nära varianter därav har flera begränsningar. Framstående brister inkluderar (1) användningen av fosterceller som till skillnad från mogna p-celler, visar en hög basal β-cellreplikation hastighet och är tillväxt regleras på ett tydligt sätt ^12; (2) den subjektiva karaktär försöksberoende prövning av β-cellreplikeringshändelser; (3) arbets- och tidskrävande karaktär försöksberoende räkning av β-cellreplikeringshändelser fördröjer experimentell genomströmning; (4) användning av kärn inkorporering / bets / utseende för att identifiera replikering ävents och en icke-överlappande cytoplasmatisk fläck för att identifiera p-celler leder till felattribueringen av närbelägna icke-β-cellreplikeringshändelser till p-celler.

På senare tid mogna primära p-celler har använts för att bedöma effekten av transgen överuttryck samt genprodukt eller förening behandling på β-cellreplikation ^13-16. Emellertid har dessa studier också åberopas subjektivt räkning av replikeringshändelser, cytoplasmiskt staining- eller icke-specifika metoder för identifiering β-cell och / eller arbetsintensiva steg som begränsar genomströmningen, t.ex. individuell glid väl plätering av celler eller intakta ö paraffininbäddning och bearbetning ^17. Notably, en bildbaserad human β-cellreplikation screening metodologi, som liknar den som presenteras häri, har publicerat ^18; har dock framgångsrik användning av denna analys inte påvisats och användningen av humana öar för primär screening kan inte vara i stort sett FEAligt.

En alternativ strategi för att identifiera replikationsbefrämjande substanser är att bedöma tillväxt induktion av β-cellinjer. Initiala ansträngningar används transformerade p-cellinjer såsom MIN6 celler eller INS 832/13-celler ^14,19-21. Dessa cellinjer visar ohämmad tillväxt och bär föga likhet med väl differentierade p-celler ^22. Följaktligen är tillväxtinduktionskapacitet minimal, av oklar relevans och ibland svårt att sammanfatta. En förbättrad strategi för cellinje baserad screening utnyttjar "reversibelt omvandlas" celler som tillväxt greps i frånvaro av tetracyklin (doxycyklin) -beroende SV40 T-antigen uttryck ^23,24. Det är dock oklart om dessa celler återgår till en "normal" β-cell-liknande tillstånd vid doxycyklin bort. Tyvärr har användningen av dessa celler gav generaliserade tillväxtbefrämjande föreningar som inte verkar ha omedelbar nytta24. Sammanfattningsvis kan användningen av cellinjer för att studera tillväxtreglering av en celltyp som visar minimal spontan replikering aktivitet har begränsad användbarhet.

Den β-cellreplikation screening plattform presenteras här utnyttjar mogna primära rått p-celler att behålla in vivo tillväxtreglering i möjligaste mån, ö-cellkulturer av blandad celltyp komposition för att möjliggöra identifiering av linjebegränsade tillväxtbefrämjande aktiviteter, multi -Ja formatering för att maximera genomströmningen och automatiserad analys för att eliminera fördomar och underlätta genomströmningen. Framgångsrik användning av denna plattform har möjliggjort identifiering av flera föreningar som främjar β-cellreplikation ^25,26. Dessutom har analysen använts för struktur-aktivitetssamband studier och kemiska epistasis experiment för att tillhandahålla mekanistiska insikter i den molekylära regleringen av β-cellreplikation. De presenterade plattformen framgångsrikt anpassat for Lentiviral RNAi-baserad undersökning av β-cellreplikation vägar ^25. Begränsningar av analysen inkluderar begränsad skalbarhet (användning av primärceller), användning av gnagare snarare än mänskliga ö-celler (även om analysen kan anpassas för mänskliga ö studier), kostnader i samband med antikroppsbaserad avbildning och primär ö, användning av spridda öar (störs holme arkitektur) för att underlätta automatiserad bildtagning och beroende av tillgången på ett automatiserat mikroskop med bildtagning och analyskapacitet. Även om en enkel in vivo screening metod för att identifiera genprodukter eller föreningar som stimulerar β-cellförnyelsen in situ skulle vara perfekt, är en sådan plattform ännu inte tillgängliga ^27. Följaktligen är lämpligt för forskare intresserade av att undersöka de flesta aspekterna av β-cellreplikation den beskrivna plattformen.

Protocol

Detta protokoll genomfördes i enlighet med Institutional Animal Care och användning kommittén (IACUC) vid Stanford University School of Medicine. Den beskrivna protokollet skalas för ö-isolering från sex 250-300 g (8 – 9 veckor gamla) Sprague Dawley-hanråttor, som är tillräcklig för att alstra 228 brunnar i en 384-brunnsplatta för ö-cellreplikation bedömning. 1. Material Beredning Förbereda beläggningsmedier före initiering holmen isolering genom uppsamling av konditionerade m…

Representative Results

Att bedöma β-cell eller α-cellreplikation, är en fyra-färganalysprotokoll erfordras. Först objekt identifieras med DAPI färgning (Kanal 1, 386 nm). Därefter p-celler (händelse 1) räknade: objekt som samuttrycker PDX-1 + (kanal 2, 650 nm) och peri-nukleär insulin (kanal 3, 549 nm). Därefter replikerande p-celler (händelse 2) räknas: p-celler (händelse 1) som co-express Ki-67 (kanal 4, 485 nm) (Figur 3). Den procentuella andelen av replikerande p-…

Discussion

Experimentella metoder för att studera de molekylära vägar som kontrollerar β-celltillväxt och förnyelse är viktiga verktyg för diabetesforskare. Häri till en råtta-ö-baserad screening plattform identifiera och karakterisera småmolekylära stimulatorer av β-cellreplikation presenteras.

Medan de flesta aspekterna av detta protokoll är lätt utföras av erfarna forskare, bara några steg kräver särskild teknik. Först under holme isolering, kanyle av galla-kanal utan att störa…

Materials

250g male Male Sprague Dawly Rat	Charles River	Stain # 400
12 cm teeth tisuue forceps	Fine Science Tools	11021-12
11.5 cm fine scissors	Fine Science Tools	14058-11
14.5 cm surgical scissors	Fine Science Tools	14001-14
16 cm curved forceps	Fine Science Tools	11003-16
12 cm curved hepostat	Fine Science Tools	13011-12
12 cm scalpel handle	Fine Science Tools	10003-12
Tissue sieve-30 mesh	Bellco Glass	1985-85000
Cizyme RI, 375,000 CDA units	VitaCyte	005-1030
Hanks' Balanced Salt solution (Ca++ and Mg++)	Gibco	24020-117
Ketamine HCl (200 mg/20 ml)	JHP Pharmaceuticals	NDC# 42023-113-10	to make anesthetic cocktail
Xylazine (5 g/50 ml)	LLOYD	NADA# 139-236	to make anesthetic cocktail
Histopaque 1077	Sigma	H-1077	to make histopaque 1100
Histopaque 1119	Sigma	H-1119	to make histopaque 1100
Newborn Calf Serum 500 ml	Hyclone	SH30118.03
Hanks' Balanced Salt solution	Hyclone	SH30268.01
Dulbecco's Modified Eagle Medium/Low Glucose	Hyclone	SH30021.01
Functionality/Viability Solution	Mediatech	99-768-CV
RPMI1640 media	Hyclone	SH30096.01	to make conditioned medium
804G rat bladder carcinoma cell-line	Available upon request		to make conditioned medium
Fetal Bovine Serum, Qualified	Gibco	26160
GlutaMax-I	Gibco	35050-061
Penicillin (5,000 IU/ml/Strptomycin (5 mg/ml)	MP Biomedicals	1670049
Formamide 500 mL	Fisher BioReagents	BP227-500
Antigen Unmasking Solution 250 mL (PH 6.0)	Vector Laboratories	H-3300	to make 0.15 M Sodium Sitrate solution
Dextrose, Anhydrous	EMD Chemicals	DX0145-1	to make 1 M glucose solution
Nomal Donkey Serum (Powder)	Jackson ImmunoResearch	017-000-121
Triton X-100	Sigma	T8787-100ML
Mouse anti-human Ki67 antibody	BD Biosciences	556003
Goat anti-human PDX-1 antibody	R&D Systems	AF2419
Polyclonal Guinea Pig anti-insulin antibody	Dako	2016-08
Polyclonal Rabbit anti-glucagon antibody	Dako	2014-06
Polyclonal Rabbit anti-somatostatin antibody	Dako	2011-08
Polyclonal chicken anti-vimentin antibody	abcam	ab24525
Biotin-SP-conjugated, Donkey Anti-Mouse IgG	Jackson ImmunoResearch	715-065-150
StreptAvidin, Alex Flour 488 conjugated	Invitrogen	S32354
Rhodamine-conjugated Donkey Anti-Goat IgG	Jackson ImmunoResearch	705-025-147
Rhodamine-conjugated Donkey Anti-Guinea Pig IgG	Jackson ImmunoResearch	706-025-148
Rhodamine-conjugated Donkey Anti-Rabbit IgG	Jackson ImmunoResearch	711-025-152
Cy 5-conjugated Donkey Anti-Guinea Pig IgG	Jackson ImmunoResearch	706-175-148
Cy 5-conjugated Donkey Anti-Goat IgG	Jackson ImmunoResearch	705-175-147
Cy 5-conjugated Donkey Anti-Rabbit IgG	Jackson ImmunoResearch	711-175-152
Cy 5-conjugated Donkey Anti-Chicken IgG	Jackson ImmunoResearch	703-175-155
DAPI	Millipore	S7113
Disposable Reagent Reservoir 25 mL	Sorenson BioScience	39900
384 well, black/clear, tissue culture treated plate	BD Falcon	353962
96 well, black/clear, tissue culture treated plate	Costar	3603
Multi-channel pipettor	Costar	4880
12-channel vaccume aspirator	Drummond	3-000-096
Cell Scraper	Falcon	353085
Isotemp Water Bath Model 2223	Fisher Scientific
High-content screening instrument: ArrayScan VTI	Thermo Scientific