ووصف منهجية فعالة وبسيطة لتحليل الكمبيوتر المستندة إلى السلوك السباحة الخيطية في السائل. الطريقة يتطلب القليل من أي استثمار لجيم مختبرات ايليجانس. الأجهزة المستخدمة هو المعيار، وبرامج الكمبيوتر لتحليل السلوكي (CeleST) هو مفتوح المصدر واحد.
تشريح الدوائر العصبية والعصبية والعضلية التي تنظم سلوك لا يزال يشكل تحديا كبيرا في علم الأحياء. وقد أثبتت الديدان الخيطية انواع معينة ايليجانس أن يكون كائن نموذجا لا تقدر بثمن في المساعدة على مواجهة هذا التحدي، من الملهم النهج التكنولوجية، بناء connectome الدماغ البشري، لتسليط الضوء على الواقع السائقين الجزيئية محددة من أنماط الوظيفية الأساسية. وقد أجريت معظم الدراسات السلوكية في C. ايليجانس على ركائز متينة. في السائل، والحيوانات يحمل الأنماط السلوكية التي تشمل الحركة في مجموعة من السرعات في 3D، وكذلك حركات الجسم جزئية، مثل حليقة الخلفية دون تغيير شكل الأمامي، الذي يعرض تحديات جديدة لتحديد الكميات. ، يتم عرض خطوات إجراء بسيط، واستخدام البرمجيات التي تمكن من تحليل عالية الدقة من جيم ايليجانس السباحة السلوك هنا. البرنامج، واسمه CeleST، يستخدم برنامج كمبيوتر متخصص أن يتتبعمتعددة في وقت واحد الحيوانات وتوفر تدابير جديدة للجيم ايليجانس الحركة في السائل (السباحة). ترتكز التدابير معظمها في الموقف الحيوانية وعلى أساس الرياضيات المستخدمة في رؤية الكمبيوتر والتعرف على الأنماط، دون المتطلبات الحسابية لعتبة قطع العرضية. يمكن استخدام أداة البرمجيات على حد سواء تقييم براعة السباحة العامة في مئات من الحيوانات من التجارب دفعة صغيرة مجتمعة والكشف عن الظواهر الجديدة حتى في المسوخ وراثية تتميز بشكل جيد. إعداد العينات للتحليل مع CeleST بسيطة ومنخفضة التكنولوجيا، مما يتيح التكيف واسعة من قبل المجتمع العلمي. ولذلك ينبغي استخدام النهج الحسابي هو موضح هنا يساهم في زيادة فهم السلوك ودوائر السلوكية في C. نموذج ايليجانس.
تحديد كيفية السلوك وعلم الوراثة، علم التخلق، والخبرة، والبيئة تأثير يمثل تحديا كبيرا في علم الأحياء الحديث. بسيطة، ونماذج قابلة راثيا التي يمكن تتبعها حسابيا وقياس يمكن تقديم مساهمات حاسمة لتحقيق هذا الهدف. في انواع معينة ايليجانس الخيطية هي واحدة من هذه النماذج. والغرض من هذه المقالة هو لشرح كيفية يمكن تتبع C. ايليجانس السباحة تحرك وquantitated لاستخراج المعلومات عن ثمانية ميزات جديدة مع أهميتها البيولوجية.
C. ايليجانس لديه لمدة قصيرة نسبيا من حوالي 2-3 ث وفترة الإنجاب ما يقرب من 4 د عند 20 درجة مئوية 1،2. في الثقافات المختبر القياسية، ويزرع هذا الخيطية المجهرية على لوحات بتري تحتوي على نيماتودا نمو وسائل الإعلام (NGM) التي تنتشر مع مصدر غذاء للبكتيريا 3،4. الحيوانات WT N2 تتحرك بنشاط في موجات جيبية أنيقة على لوحات مليئة أجار. يغيروا حركة الفئرانوفاق عند التجوال (بحثا عن الغذاء)، مسكن (تصفح)، أو للشفاء من وجبة (هدوء الشبع غير نشط) 5. ضعف 6 أو سن 7-12 يمكن أيضا أن يغير بشكل كبير حركة على لوحات.
الجينات التي تعدل السلوك، healthspan أو الشيخوخة، يمكن وصف وظيفيا من خلال تحليل جيم أنماط الحركة ايليجانس أو الحركة. نهج واحد لقياس healthspan هو تصنيف الكبار في السن إلى ثلاث فئات (على سبيل المثال، A، B، و C) وفقا لتنقل على لوحات، مع نشاط حثيث المادي كونها فئة A و الشلل كونها الفئة C 7،8،13. على الرغم من أن هذا الفرز النوعي هو مفيد للكشف عن الاختلافات في اللياقة البدنية، وفئات واسعة من دون حدود واضحة، وبالتالي التهديف من يخضع لمجرب التحيز.
وقد رفع عدد متزايد من بتتبع الموضوعية والتطور، ودقة التحليل من جيم ايليجانس حركةعلى وسائل الاعلام الصلبة 14-18. C. ايليجانس الحركة على لوحات يقتصر في معظمه إلى الطائرة التي الحيوان يجعل الاتصال مع سطح صلب وسائل الإعلام. (C. ايليجانس ويمكن أيضا حمل الاستكشاف من خلال رفع رأسه بعيدا عن بقية أجزاء الجسم التي لا تزال على اتصال مع سطح صلب، وتحديد المواقع الجسم في الطائرات متعددة. ومع ذلك، فإن هذا السلوك غير عادي.) عندما وضعت في السائل، وهذا الخيطية يبادر حركة الموجية، أو السباحة، الذي يضم حركة أوسع الأبعاد، مجموعة أكبر من سرعة وعمق الحركة، وزيادة في حدوث مع التقدم في السن الأمامي يتحرك بشكل مختلف من الخلفي بالمقارنة مع الحيوانات على الأسطح الصلبة. ونتيجة لتحليل سريع من اللياقة البدنية وردا على البيئة الجديدة، يمكن للمجرب وضع حيوان الفردي إلى قطرة السائل ويسجل ترددها من الانحناءات الجسم تحت نطاق تشريح. تسجيل الفيديو يمكن أن تسهل تحززات الحالية والمستقبلية للقوة السباحة للالحيوان. ومع ذلك، فإن نهج اليدوي يحد من عدد من الميزات التي يمكن أن يسجل هدف ومقيدة تماما بتسجيله حيوان واحد في وقت واحد.
تم أقل استكشاف الحركة في السائل من الحركة على وسائل الاعلام الصلبة. في الواقع، هناك عدد قليل من الخيارات البرامج التي قوية وسهلة التنفيذ في المختبر لقياس الحركة في السائل 19-24. وCeleST برنامج (جيم ايليجانس السباحة اختبار) تقدم بساطة إجراءات استخدام والرياضية على أساس أن تقديم البيانات (عشرات انحناء) ذات الصلة مباشرة إلى طبيعة الحركة 8؛ (وصف مفصل من الميزات والمزايا في Restif وآخرون. 8). وعلاوة على ذلك، التحليل الحسابي يمكن استجلاء ملامح المظهرية التي من المستحيل للعين البشرية للتسجيل. هنا، يتم عرض البيانات التي تجسد قرار من هذا النهج التحليل وسيلة سهلة لتنفيذ بروتوكول لتسجيل التجارب السباحة لليوصف تحليل CeleST لاحق.
استمر استخدام C. ايليجانس كنظام نموذج لزيادة نظرا لسهولة تشكيل وراثية، قابلية الإستطراق التجريبي وعلم التشريح المشروح بالتفصيل الدقيق. على سبيل المثال، يتم تعيين بنية الخلايا العصبية والتواصل بين C. ايليجانس خنثى بوضوح 34-36، يسهل كثيرا التحقيقات الدوائر العصبية الخاصة التي تتحكم في تصرفات معينة. تشكل 302 الخلايا العصبية الجهاز العصبي للخنثى الكبار، التي تقوم بتصنيع مجموعة واسعة من المدخلات الحسية إلى مخرجات السلوكية الأساسية مثل الحركة. كما تم وصف هيكل الجهاز العصبي الذكور أكثر تعقيدا 37، تمكين الدوائر الجنس محددة لمعالجتها. 37
وقد درس جيم السلوك ايليجانس على نطاق واسع على لوحات ثقافة القياسية التي تحتوي على وسائل الاعلام الصلبة. منذ WT C. ايليجانس يتحرك في موجات جيبية يمكن التنبؤ بها على لوحات مليئة أجار، الانحرافات عنيمكن الكشف عن النمط العام عن طريق العين وسجل يدويا. هذا النهج، ومع ذلك، يخضع لمعيار مجرب وغير كثيفة العمالة. الأجهزة والبرامج الأدوات المصممة لتتبع وقياس جيم ايليجانس الحركة على وسائل الاعلام الصلبة إزالة التحيز الذاتية وتسمح للدراسات واسعة النطاق، والسماح الأسئلة البيولوجية أكثر تطورا لمعالجتها. قاعدة البيانات السلوكية الأخيرة التي تم إنشاؤها من قبل مختبر شافر 16 هي مثال ممتاز على تمديد التحليلي والعمق الذي تم تحقيقه مع النظام الحسابي للتحرك على لوحات.
عندما يتم وضع WT C. ايليجانس في السائل، والحيوان بسرعة يتكيف حركته مع البيئة الجديدة، وبدء السباحة. C. ايليجانس السباحة تستخدم مجموعة أكبر من الحركة من الزحف ويمكن أن تكون أكثر غير النظامية 8. ويهدف البرنامج مثل CeleST لملء الفراغ لتحليل مفصل لجيم ايليجانس السلوك في السائل، permiالكميات tting من معلمات المرتبطة الحركة التي لا تقاس بسهولة بالعين بمساعدة الامم المتحدة، أو التي يمكن إنجازها بسرعة أكبر من اليدوي التهديف. في 8 ساعات الصعبة يمكن لفرد ومعالجة ما يصل الى 200 أشرطة الفيديو، ~ 1000 سجلات يوميا.
البرنامج وتعرف السباحة المعلمات تقييم هذا بمثابة بصمة شاملة من اللياقة البدنية والسلوك. بالإضافة إلى إثراء فهم جوانب معقدة من جيم السلوك ايليجانس في السائل والمسارات الجزيئية التي تقوم عليها، وهذا البرنامج يمكن أن تستخدم لاستكشاف جوانب متعددة من علم الأحياء بما في ذلك ردود الدوائية، والشيخوخة، وسلوك متميز. المقدمة هنا، نظرة عامة على التغيرات كميا التي تحدث في الأداء البدني من C. ايليجانس البالغين عند تقدمهم في السن هو مثال واحد من هذا الطلب من البرنامج (لحساب أكثر تفصيلا، انظر Restif وآخرون. 8). في سياق الشيخوخة، انخفضت بعض المعلمات قياس حينارتفع الآخرين أو لم تتغير باستمرار في النوع البري. وتأكدت الاتجاهات إلى حد كبير من قبل الشخصية الحسابية من المسوخ طول العمر، والشخصية النسبية للأفواج اجير رشيقة والسيئة من السكان في السن من نفس أبقى في ظروف بيئية موحدة. يمكن عالية الدقة من البرنامج أيضا تكشف الظواهر خفية لم تكن معروفة سابقا في المسوخ تتميز على نطاق واسع (على سبيل المثال، في سن 1 (hx546) في الشكل رقم 1).
هناك عدد قليل من الخطوات الحاسمة ولا سيما من بروتوكول صفها. الحفاظ على بيئة درجة حرارة ثابتة بين البيئة السباحة وثقافة لوحة سلالة من المهم بالنسبة للاستنساخ السباحة، لذلك يتم تشجيع غاية المجربون للذهاب إلى آلام كبيرة لتجنب التغيرات في درجات الحرارة عشوائية. وينبغي أن تكون وسائل الإعلام السباحة في نفس درجة حرارة لوحات. وبالمثل، فإن الاهتمام الدقيق لحجم قطرة للالسباحة تساعد على ضمان التكاثر. وأخيرا، فإنه من الحكمة أن نفكر فيدفع عن تفريغ ملفات الفيديو الكبيرة التي تتراكم. معالجة الصور على موقع وبصرف النظر عن الكمبيوتر التقاط الفيديو الموصى بها.
استخدام البرامج المقدمة هنا لتحليل تسبح له بعض القيود. أولا، على الرغم من أن برامج يمكن أن تتبع في وقت واحد الحيوانات متعددة، إذا تم تحليلها أكثر من خمسة الحيوانات معا، وهناك زيادة فرصة أن الحيوانات والسباحة عبر بعضها البعض في صور الفيديو. إذا كان البرنامج لا يمكن تحديد بشكل لا لبس فيه الحيوان الذي كان الذي كان تراقب تلك الأطر البيانات. على الرغم من أن هذه الميزة برنامج يضمن أن البيانات عن الحيوانات الفردية هي ذات جودة عالية، فإنه يحد من الإنتاجية. ثانيا، يجب أن تكون الصور نظيفة إلى حد ما، وهذا هو خال من الغبار والأوساخ وعلى مرأى ومسمع من الأضواء، والإشارات المرتبطة يمكن أيضا أن يربك تحليل الصور. كما لوحظ في القسم بروتوكول 2.1.1، استثمار منخفضة جدا التكنولوجيا التي يمكن أن تساعد إلى حد كبير التقاط الصور عن طريق القضاء على التعقيدات مع تقلبات طالإضاءة البيئية ن هي لتغطية المنطقة مرحلة بقطعة قماش سوداء لا تسمح للضوء المحيط لتصل إلى هذه المرحلة. ثالثا، تم تحسين البرنامج للحيوانات في مرحلة البلوغ. الشباب اليرقات السباحة بسرعة جدا ولها أجسام صغيرة، مما يزيد من الخطأ البرنامج. رابعا، بعض البرامج تستخدم MATLAB، وعندما تكون هناك ترقية الإصدار و / أو ترقيات نظام التشغيل، قد تتعطل بعض وصلات البرنامج. حاليا، هو الأمثل البرامج لاستخدامها في MATLAB 2015b و Mac OS الإصدار 10.10، ولكننا نتوقع قريبا لمرحلة ما بعد إصدار البرنامج الذي هو أكثر قوة ضد هذه التغييرات. وأخيرا، يمكن للملفات البيانات والفيديو تصبح كبيرة بسرعة، وتتطلب مساحة التخزين التي ينبغي تخصيصها.
وباختصار، المعروضة هنا هي منهجية بسيطة التي يمكن تنفيذها بسهولة من قبل أي مختبر من دون استثمار الكثير لإنشاء ملفات الفيديو جيم ايليجانس السباحة لتحليل CeleST. وتشمل الميزات من حزمة برامج التشغيل الآلي واسعة من تتبع من خلالتحليل، في وقت واحد تتبع متعددة الحيوان، واستخدام القواعد الرياضية (أي تدابير منحي) لتحديد الكميات من معظم المعلمات الحركة. هذا البرنامج هو مفتوح المصدر، مع رمز والعروض متاحة للجمهور على النحو المفصل في Restif وآخرون. 8. على الرغم من أن البرنامج يتميز تحليل الرؤية الحاسوبية المتقدمة لتتبع، وغيرها من نظم تتبع المنشورة (على سبيل المثال، Greenblum وآخرون، 2014 38) متوافقة مع تحليل معلمة من البرامج المقدمة هنا. وسيتم توجيه التحسينات المستقبلية نحو تحويل البرنامج إلى مجموعة أكثر قوة لا يقيد استخدام لإصدارات معينة من أنظمة التشغيل المذكورة أعلاه (المشار إليها أيضا في جدول المواد).
The authors have nothing to disclose.
تطوير CeleST كان مدعوما من المعاهد الوطنية للصحة تمنح R21AG027513 وU01AG045864. يتم تكييفها البيانات وبعض التأكيدات فيديو قصيرة من Restif وآخرون. (2014) 8، التي نشرت تحت المشاع المبدع مؤلفه (CC BY) رخصة http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/. نشكر ريكاردو ارانجيرو لمساعدة المخطوطات.
REAGENT | |||
N2 | Caenorhabditis Genetics Center (CGC) | C. elegans wild type (ancestral). | |
OP50 Escherichia coli | Caenorhabditis Genetics Center (CGC) | Biosafety Level: BSL-1. | |
OP50-1 Escherichia Coli | Caenorhabditis Genetics Center (CGC) | Streptomycin resistant strain of OP50. Biosafety Level: BSL-1. | |
Streptomycin sulfate salt | Sigma-Aldrich | S6501 | |
Printed Microscope Slides | Thermo Fisher Scientific | Gold Seal Fluorescent Antibody Microslides: 3032-002 | have two etched 10mm diameter circles delineated by white ceramic ink |
Nematode Growth Medium (NGM) | For 1L: 17g Agar, 3g NaCl, 2.5g Peptone, 1mL 1M CaCl2, 1mL 5mg/mL Cholesterol in ethanol, 25mL 1M KPO4 buffer, 1mL 1M MgSO4, H2O to 1 L. Sterilize by autoclaving. | Stiernagle, T. Maintenance of C. elegans. WormBook, 1-11, doi:10.1895/wormbook.1.101.1 (2006) | |
M9 buffer | For 1L: 3g KH2PO4, 6g Na2HPO4, 5g NaCl, 1mL 1 M MgSO4, H2O to 1 L. Sterilize by autoclaving. | Stiernagle, T. Maintenance of C. elegans. WormBook, 1-11, doi:10.1895/wormbook.1.101.1 (2006) | |
EQUIPMENT | |||
CeleST | Driscoll Lab, Rutgers University | C. elegans Swim Test | Open Source, see http://celestmod.github.io/CeleST/ and http://celest.mbb.rutgers.edu/ |
MATLAB | www.mathworks.com/downloads | MatLab version 2015b (best) | The CeleST version demonstrated here has best functionality with Mac OS 10.10 and MatLab 2015b. MATLAB 2015B introduced changes to how MATLAB handled graphics, including a new coding convention and syntax. These changes resolved an issue that couldn't be resolved elegantly (primarily because the internals of MATLAB really needed the major graphics overhaul implemented in MATLAB 2015B). For this reason, CeleST should always be run on MATLAB 2015B or later versions. However for users without access to MATLAB version 2015B or later (or MATLAB at all), we have created a CeleST program that doesn't need MATLAB on the computer at al. An installer is downloaded by the prospective user and then it installs itself onto the computer through a couple prompts like most programs. |
Mac OS | www.apple.com | Version 10.10 | Currently, CeleST has been ported to the major operating systems (Windows, Mac, and Linux). The current code can be run on any of the operating systems and there are versions for each operating system that don't even require users to have MATLAB to use CeleST (this version requires a large download). The Windows version has been tested the least and is most prone to bugs as such. Linux has been moderately tested. And Mac has been and continues to be tested extensively (primarily because it's the operating system in our lab). |
Stereomicroscope | Zeiss | Stemi 2000-C | |
Transmitted Light Base | Diagnostic Instruments | TLB 3.1 | |
Digital CCD Camera | QImaging | Rolera-XR Mono Fast 1394 (ROL-XR-F-M-12) | |
Digital Video Recording Software | Norpix | Streampix Version 3.17.2 |