Эффективная и простая методика компьютерного анализа поведения нематод плавание в жидкости описывается. Метод практически не требует инвестиций для C. Элеганс лабораторий. Оборудование, используемое является стандартным, и компьютерная программа для анализа поведения (CELEST) является открытым исходным кодом один.
Анатомический нейронные и нервно-мышечные цепи, которые регулируют поведение остается серьезной проблемой в области биологии. Нематоды Caenorhabditis Элеганс оказалась бесценным модель организма, помогая справиться с этой задачей, от вдохновляющих технологических подходов, построение Коннектом человеческого мозга, на самом деле пролить свет на конкретных молекулярных драйверов основных функциональных моделей. Основная часть поведенческих исследований в C. Элеганс были выполнены на твердых подложках. В жидкости, животные проявляют поведенческие модели, которые включают движение в диапазоне скоростей в 3D, а также частичные движения тела, такие как задний ротор без изменения передней формы, которые вводят новые вызовы для количественному. Этапы простой процедуры и использование программного обеспечения , которое позволяет с высокой разрешающей способностью анализ C. Элеганс плавать поведение, здесь представлены. Программное обеспечение, названное CELEST, использует специализированную компьютерную программу, которая отслеживаетодновременно несколько животных и обеспечивает новые меры C. Элеганс локомоцию в жидком (плавание). Эти меры в основном основаны на животных позе и на основе математики, используемых в области компьютерного зрения и распознавания образов, без вычислительных требований к пороговым отключений. Программное средство может использоваться как для оценки общего доблесть плавание в сотни животных из комбинированных мелкосерийного испытаний и выявить новые фенотипы даже в хорошо охарактеризованных генетических мутантов. Подготовка образцов для анализа с CELEST прост и низкотехнологичных, что позволяет широкий адаптации со стороны научного сообщества. Поэтому использование вычислительного подхода , описанного здесь , должны способствовать более глубокому пониманию поведения и поведенческих схем в C. Элеганс модели.
Определение того, что поведение генетика, эпигенетика, опыт и влияние окружающей среды является одной из основных проблем современной биологии. Простые, генетически аменабельные модели, которые могут быть вычислительно отслеживаемые и измеренные может внести важный вклад к достижению этой цели. Нематод Caenorhabditis Элеганс является одной из таких моделей. Цель данной статьи состоит в том, чтобы показать , как C. Элеганс плавание локомоцию могут быть отслежены и количественному , чтобы извлечь информацию о восьми новых функций с биологической значимости.
C. Элеганс имеет относительно короткую продолжительность жизни приблизительно 2 – 3 Вт и репродуктивный период около 4 дней при 20 ° C 1,2. В стандартных лабораторных культурах, эта микроскопическая нематода выращивают на чашках Петри , содержащих нематодой роста Media (NGM), которые распространяются с бактериальным источником питания 3,4. WT N2 животные активно передвигаются в элегантных синусоидальных волн на агар заполненные пластинами; они меняют движение крысыэс при роуминге (продукты питания) Знакомлюсь, жилище (просмотр), или восстанавливается после еды (неактивным сытости неподвижности) 5. Обесценение 6 или возраст 7-12 также может резко изменить движение на пластинах.
Гены , которые модулируют поведение, или старение при сохранении здоровья, может быть функционально характеризуется анализом C. Элеганс моделей движения или передвижения. Один из подходов для измерения заключается в сохранении здоровья классифицировать старение взрослых на три категории (например, A, B, и C) в соответствии с их передвижению на пластинах, с энергичной физической активности как класс А и паралич как класс C 7,8,13. Хотя такая качественная сортировка полезно, чтобы выявить различия в физической культуры, категории являются широкими, без четких границ и, следовательно, их выигрыш подлежит экспериментатор уклон.
Все большее число трекеров повышали объективность, изысканность и точность анализа C. Элеганс движенияна твердых средах 14-18. C. Элеганс локомоции на пластинах, в основном , ограничена плоскостью , в которой животное контактирует с твердой поверхностью носителя. (C. Элеганс может также вызвать разведку, подняв голову от остальной части тела , которая находится в контакте с твердой поверхностью, позиционирование тела в нескольких плоскостях. Тем не менее, такое поведение необычно.) При помещении в жидкость, это нематода инициирует волнообразную движение, или плавание, который показывает более обширное одномерное движение, больший диапазон скорости и глубины движения, а также увеличение числа случаев с возрастом передней движущейся в отличие от задней по сравнению с животными на твердых поверхностях. В качестве быстрого анализа физической подготовленности и реагирования на новую среду, экспериментатор может поместить отдельное животное в капли жидкости и оценка его частоту изгибов тела под действие рассекает. Запись видео может облегчить настоящим и будущим задиров на плавательный изощренностьюживотное. Тем не менее, руководство подход ограничивает число функций, которые могут быть забиты, и полностью ограничен для забив одно животное в то время.
Передвижение в жидкости было меньше, чем исследовал передвижению на твердых средах. Действительно, есть несколько вариантов программного обеспечения , которые являются надежными и легко осуществить в лаборатории для измерения локомоцию в жидком 19-24. Программное обеспечение CELEST (C. Элеганс плавательного теста) предлагает простоту использования и математических основе мер , которые обеспечивают данные (искривление баллов) , имеющих непосредственное отношение к характеру движения 8; (подробное описание особенностей и преимуществ в Restif и др. 8). Кроме того, вычислительный анализ позволяет выяснению фенотипических признаков, которые невозможны для человеческого глаза забить. При этом данные, которые иллюстрируют решение этого анализа подхода представлены и легко реализовать протокол для записи плавать испытания для последующего анализа CELEST описан.
Использование C. Элеганс в качестве модельной системы продолжает увеличиваться из – за своей генетической пластичностью, экспериментальной сговорчивости и анатомии аннотированный к тщательной детализации. Например, нейронная структура и связность C. Элеганс гермафродита четко наметил 34-36, значительно облегчает исследования конкретных нейронных цепей , которые контролируют определенные модели поведения. 302 нейроны образуют нервную систему взрослого гермафродитом, которая обрабатывать широкий спектр сенсорных входов в основные поведенческие выходы, как локомоции. Структура более сложной мужской нервной системы также было описано 37, что позволяет связанный с полом схемы , которые будут рассмотрены. 37
C. Элеганс поведение широко изучалась на стандартных культуральных пластин , содержащих твердые носители. Так как WT C. Элеганс движется в предсказуемых синусоидальных волн на чашках заполненные пластинами, отклонения отобщий рисунок можно обнаружить невооруженным глазом и вручную подсчитывают. Такой подход, однако, при условии соблюдения критерия экспериментатора и является трудоемким. Аппаратные и программные средства , предназначенные для отслеживания и измерения C. Элеганс локомоция на твердых средах удалить смещение субъективность и позволяют крупномасштабных исследований, что позволяет более сложные биологические вопросы должны быть рассмотрены. Недавно поведенческая база данных , созданная в лаборатории Schafer 16 является прекрасным примером аналитического расширения и глубины , что было достигнуто с помощью вычислительной системы для передвижения на пластинах.
Когда WT C. Элеганс помещают в жидкость, животное быстро адаптируется свое движение к новой среде, инициируя плавать. C. Элеганс плавание использует больший диапазон движения , чем ползать и может быть более нерегулярным 8. Программное обеспечение , как CELEST предназначен , чтобы заполнить пробел для детального анализа C. Элеганс поведение в жидкости, Permiчал Количественное параметров движения ассоциированных, которые не легко измерить с помощью оон автоматизированного глаза, или которые могут быть выполнены быстрее, чем вручную скоринга. В 8 ч жесткий человек может обрабатывать до 200 видео, ~ 1000 записей в день.
Программное обеспечение определяет плавание параметры, оценивающие служат в качестве всеобъемлющего отпечатка пальца физической культуры и поведения. В дополнение к обогащению понимания сложных аспектов поведения C. Элеганс в жидкости и лежащих в их основе молекулярных путей, это программное обеспечение может быть использовано для изучения различных аспектов биологии в том числе фармакологических реакций, старение и отчетливым поведения. Представленные здесь, обзор полученных количественных изменений , которые происходят в физическом исполнении C. Элеганс взрослых , как они возраст является одним из примеров такого применения программного обеспечения (для более детального отчета см Restif и др. 8). В контексте старения, некоторые измеряемые параметры снизились в то время какдругие увеличены или последовательно не изменится в дикого типа. Тенденции были подтверждены в значительной степени вычислительной профилем долговечности мутантов, а относительные профили грациозных и плохих Äger когорт населения того же возраста содержатся в одинаковых условиях окружающей среды. Высокое разрешение программного обеспечения может также выявить тонкие фенотип ранее неизвестные в широко характеризуемых мутантов (например, возраст-1 (hx546) на рисунке 1).
Есть несколько особо важных шагов протокола, описанного. Поддержание постоянной среды между температурой окружающей среды и плавательного штаммом пластины культуры имеет важное значение для плавания воспроизводимости, поэтому экспериментаторы настоятельно рекомендуется идти на большие усилия, чтобы избежать случайных изменений температуры. Плавают средства массовой информации должны быть при той же температуре, что и пластин. Кроме того, пристальное внимание к размеру капли для купания поможет обеспечить воспроизводимость. И, наконец, это разумно думатьзаранее о разгрузку больших видео файлов, которые накапливаются. Обработка изображений на сайте отдельно от компьютера захвата видео рекомендуется.
Использование программного обеспечения, представленного здесь для плавательного анализа имеет определенные ограничения. Во-первых, несмотря на то, что программы могут одновременно отслеживать несколько животных, если более чем пять животных совместно анализируются, существует повышенная вероятность, что животные будут плавать поперек друг друга в видеоизображений. Когда программа не может однозначно определить, какое животное, которое, он подвергает цензуре эти кадры данных. Хотя эта функция программы гарантирует, что данные для отдельных животных, имеют высокое качество, это ограничивает пропускную способность. Во-вторых, изображения должны быть достаточно чистыми, что свободна от пыли, грязи и бликов от света, так как связанные с ним сигналы также могут посрамить анализа изображения. Как отмечалось в разделе 2.1.1 протокола, очень низкотехнологичном инвестиций, которые могут значительно помочь захвата изображения путем устранения осложнений при колебаниях яп экологического освещения, чтобы покрыть площадь сцене с темной тканью, которая не позволяет окружающего света, чтобы достичь стадии. В-третьих, программа оптимизирована для животных на взрослой стадии. Молодые личинки плавают очень быстро и имеют небольшие тела, что увеличивает ошибку программы. В-четвертых, некоторые из программного обеспечения использует MATLAB, а при наличии обновления версии и / или обновления операционной системы, некоторые программные ссылки могут быть нарушены. В настоящее время программное обеспечение оптимизировано для использования на MATLAB 2015b и Mac OS версии 10.10, но мы ожидаем, что в скором времени опубликовать версию программного обеспечения, которое является более устойчивым к таким изменениям. И, наконец, файлы видеоданных могут стать большими быстро, и требуют места для хранения, которые будут выделены.
Таким образом, представленная здесь простая методика , которая может быть легко реализован с помощью любой лаборатории без больших инвестиций для создания видео C. Элеганс плавание для анализа CELEST. Особенности пакета программного обеспечения включают в себя обширную автоматизацию от отслеживания черезанализ, одновременное отслеживание нескольких животных, и использование математических основ (т.е. кривизны меры) для количественного определения большинства параметров локомоции. Программное обеспечение с открытым исходным кодом, с кодом и демок общедоступной , как описано в Restif и др. 8. Хотя программа имеет расширенный анализ компьютерного зрения для отслеживания, другие системы опубликованные отслеживания (например, Greenblum и др., 2014 38) совместимы с анализом параметров программного обеспечения , представленного здесь. Будущие усовершенствования будут направлены на превращение программного обеспечения в более надежный пакет , который не ограничивает использование для конкретных версий операционных систем , упомянутых выше (также указанных в таблице материалов).
The authors have nothing to disclose.
Развитие CELEST была поддержана NIH гранты R21AG027513 и U01AG045864. Данные и некоторые короткие видео представления адаптированы из Restif и др. (2014) 8, которые были опубликованы в соответствии с лицензией Creative Commons Attribution (CC BY) http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/~~HEAD=pobj. Мы благодарим Рикардо Laranjeiro рукописи помощи.
REAGENT | |||
N2 | Caenorhabditis Genetics Center (CGC) | C. elegans wild type (ancestral). | |
OP50 Escherichia coli | Caenorhabditis Genetics Center (CGC) | Biosafety Level: BSL-1. | |
OP50-1 Escherichia Coli | Caenorhabditis Genetics Center (CGC) | Streptomycin resistant strain of OP50. Biosafety Level: BSL-1. | |
Streptomycin sulfate salt | Sigma-Aldrich | S6501 | |
Printed Microscope Slides | Thermo Fisher Scientific | Gold Seal Fluorescent Antibody Microslides: 3032-002 | have two etched 10mm diameter circles delineated by white ceramic ink |
Nematode Growth Medium (NGM) | For 1L: 17g Agar, 3g NaCl, 2.5g Peptone, 1mL 1M CaCl2, 1mL 5mg/mL Cholesterol in ethanol, 25mL 1M KPO4 buffer, 1mL 1M MgSO4, H2O to 1 L. Sterilize by autoclaving. | Stiernagle, T. Maintenance of C. elegans. WormBook, 1-11, doi:10.1895/wormbook.1.101.1 (2006) | |
M9 buffer | For 1L: 3g KH2PO4, 6g Na2HPO4, 5g NaCl, 1mL 1 M MgSO4, H2O to 1 L. Sterilize by autoclaving. | Stiernagle, T. Maintenance of C. elegans. WormBook, 1-11, doi:10.1895/wormbook.1.101.1 (2006) | |
EQUIPMENT | |||
CeleST | Driscoll Lab, Rutgers University | C. elegans Swim Test | Open Source, see http://celestmod.github.io/CeleST/ and http://celest.mbb.rutgers.edu/ |
MATLAB | www.mathworks.com/downloads | MatLab version 2015b (best) | The CeleST version demonstrated here has best functionality with Mac OS 10.10 and MatLab 2015b. MATLAB 2015B introduced changes to how MATLAB handled graphics, including a new coding convention and syntax. These changes resolved an issue that couldn't be resolved elegantly (primarily because the internals of MATLAB really needed the major graphics overhaul implemented in MATLAB 2015B). For this reason, CeleST should always be run on MATLAB 2015B or later versions. However for users without access to MATLAB version 2015B or later (or MATLAB at all), we have created a CeleST program that doesn't need MATLAB on the computer at al. An installer is downloaded by the prospective user and then it installs itself onto the computer through a couple prompts like most programs. |
Mac OS | www.apple.com | Version 10.10 | Currently, CeleST has been ported to the major operating systems (Windows, Mac, and Linux). The current code can be run on any of the operating systems and there are versions for each operating system that don't even require users to have MATLAB to use CeleST (this version requires a large download). The Windows version has been tested the least and is most prone to bugs as such. Linux has been moderately tested. And Mac has been and continues to be tested extensively (primarily because it's the operating system in our lab). |
Stereomicroscope | Zeiss | Stemi 2000-C | |
Transmitted Light Base | Diagnostic Instruments | TLB 3.1 | |
Digital CCD Camera | QImaging | Rolera-XR Mono Fast 1394 (ROL-XR-F-M-12) | |
Digital Video Recording Software | Norpix | Streampix Version 3.17.2 |