Eine effiziente und einfache Methode für die computergestützte Analyse von Nematoden Schwimmverhalten in Flüssigkeit beschrieben. Das Verfahren erfordert keine Investitionen für C. elegans Laboratorien wenig. Die verwendete Hardware ist Standard, und der Computer-Software für die Verhaltensanalyse (CELEST) ist eine Open Source ein.
Sezieren die neuronalen und neuromuskuläre Schaltungen, die das Verhalten regulieren bleibt eine große Herausforderung in der Biologie. Der Nematode Caenorhabditis elegans hat sich als unschätzbar Modellorganismus zu sein zu helfen , dieser Herausforderung zu begegnen, aus technologischen Ansätzen inspirieren, den Bau des menschlichen Gehirns Connectome, um tatsächlich ein Licht auf die spezifischen molekularen Treiber von grundlegenden Funktionsmuster zu vergießen. Der größte Teil der Verhaltensstudien in C. elegans sind auf festen Substraten durchgeführt. In Flüssigkeit zeigen Tiere Verhaltensmuster, die Bewegung in einem Bereich von Geschwindigkeiten in 3D, sowie Teilkörperbewegungen, wie eine hintere curl ohne vordere Formänderung umfassen, die für die Quantifizierung neue Herausforderungen einzuführen. Die Schritte eines einfachen Verfahrens, und die Verwendung einer Software , die hochauflösende Analyse von C. elegans Schwimmverhalten ermöglicht, werden hier vorgestellt. Die Software namens CELEST, nutzt eine spezielle Computerprogramm, das verfolgtmehrere Tiere gleichzeitig und stellt neue Maßnahmen von C. elegans Fortbewegung in Flüssigkeit (Schwimmen). Die Maßnahmen werden vor allem in der Tierhaltung begründet und basiert auf Mathematik in Computer Vision und Mustererkennung verwendet, ohne Rechenanforderungen für Schwellen cut-offs. Das Software-Tool kann verwendet werden, um sowohl in der Hunderte von Tieren aus kombinierten Kleinserien Studien Gesamt Schwimmen Fähigkeiten beurteilen und neue Phänotypen sogar in gut charakterisierten genetischen Mutanten zu offenbaren. Die Herstellung von Proben für die Analyse mit CELEST ist einfach und Low-Tech, so dass breite Anpassung von der wissenschaftlichen Gemeinschaft. Die Nutzung der Rechen hier beschriebenen Ansatz sollte daher auf dem besseren Verständnis des Verhaltens und Verhaltensschaltungen in dem C. elegans – Modell beitragen.
Definieren, wie Genetik, Epigenetik, Erfahrung und Umwelt Einfluss Verhalten eine große Herausforderung in der modernen Biologie ist. Einfach, genetisch zugänglich Modelle, die rechnerisch verfolgt und gemessen werden können kritische Beiträge zu diesem Ziel leisten können. Die Nematoden Caenorhabditis elegans ist ein solches Modell. Der Zweck dieses Artikels ist es zu zeigen , wie C. elegans Lokomotion Schwimmen nachverfolgt werden kann und quantifizierten Informationen über acht neue Merkmale mit biologischer Relevanz zu extrahieren.
C. elegans hat eine relativ kurze Lebensdauer von ca. 2 – 3 W und einer Fortpflanzungszeit von etwa 4 d bei 20 ° C 1,2. Im Standard – Laborkulturen wird diese mikroskopisch kleinen Faden auf Petri – Platten , die Nematode Growth Medien (NGM) gezüchtet , die mit einer bakteriellen Nahrungsquelle 3,4 verteilt sind. WT N2 Tiere bewegen sich aktiv in elegant Sinuswellen auf Agar gefüllten Platten; sie Bewegung Ratte ändernes , wenn ( der Suche nach Nahrung) Roaming, Wohnung (Browsing), oder von einer Mahlzeit (inaktive Sättigung quiescence) Gewinnen 5. Impairment 6 oder im Alter von 7-12 können dramatisch verändern auch die Bewegung auf den Platten.
Gene, die Verhalten, Health oder Alterung modulieren, kann durch die Analyse C. elegans Bewegungsmuster oder Fortbewegung charakterisiert werden funktionell. Ein Ansatz Health zu messen , ist alterungs- Erwachsene in drei Kategorien klassifizieren (zB A, B, und C) entsprechend ihrer Fortbewegung auf Platten, mit intensiver körperlicher Aktivität ist Klasse A und Lähmung ist Klasse C 7,8,13. Obwohl eine solche qualitative Sortierung nützlich ist, Unterschiede in der körperlichen Fitness zu offenbaren, sind die Kategorien breit ohne klare Grenzen und damit ihre Scoring unterliegt Bias Experimentator.
Eine wachsende Zahl von Tracker haben die Objektivität, Raffinesse erhöht und Präzision der Analyse von C. elegans Bewegungauf festen Medien 14-18. C. elegans Fortbewegung auf Platten meist auf die Ebene beschränkt ist , in dem das Tier Kontakt mit der festen Oberfläche des Mediums bildet. (C. elegans kann auch Exploration induzieren , indem Sie den Kopf zu heben weg vom Rest des Körpers , die immer noch in Kontakt mit einer festen Oberfläche ist, die Positionierung des Körpers in mehreren Ebenen. Doch dieses Verhalten ungewöhnlich ist.) Wenn sie in flüssiger gesetzt, diese Nematoden initiiert eine wellen~~POS=TRUNC oder Schwimmen, die weitergehende dreidimensionale Bewegung verfügt, eine größere Bandbreite an Geschwindigkeit und Tiefe der Bewegung und eine erhöhte Inzidenz mit dem Alter der vorderen anders posterior bewegt, wie die Tiere auf festen Oberflächen verglichen. Als schnelle Analyse der körperlichen Fitness und Reaktion auf neue Umgebung kann ein Experimentator eines einzelnen Tieres in einen Flüssigkeitstropfen platzieren und sammle seine Frequenz der Körper biegt sich unter dem Binokular. Die Videoaufnahme kann Gegenwart und Zukunft Ritzungen des Schwimm Kraft der ErleichterungTier. Jedoch begrenzt die manuelle Ansatz die Anzahl der Funktionen, die erzielt werden können, und ist vollständig in einer Zeit, Scoring ein Tier gezwungen.
Locomotion in Flüssigkeit weniger ist als die Fortbewegung auf festen Medien untersucht. Tatsächlich gibt es einige Software – Optionen , die die Fortbewegung im Labor zu implementieren robust und einfach in flüssiger 19-24 zu messen. Die Software CELEST (C. elegans Swim Test) bietet Einfachheit in der Anwendung und mathematisch-basierte Maßnahmen , die 8 – Daten (Krümmungs scores) unmittelbar relevant für die Art der Bewegung liefern; (ausführliche Beschreibung von Merkmalen und Vorteilen in Restif et al. 8). Darüber hinaus ermöglicht Computeranalyse die Aufklärung der phänotypischen Eigenschaften, die für das menschliche Auge unmöglich zu punkten. Dabei werden Daten, die die Auflösung dieser Analyse Ansatz exemplarisch vorgestellt und ein einfaches Protokoll zu implementieren, um schwimmen Studien aufnehmen für nachfolgende CELEST Analyse beschrieben.
Die Verwendung von C. elegans als Modellsystem weiterhin aufgrund seiner genetischen Formbarkeit, experimentelle Lenkbarkeit und Anatomie kommentierte akribische Detail zu erhöhen. Zum Beispiel wird die neuronale Struktur und Konnektivität des C. elegans hermaphroditischen deutlich 34-36 kartiert, stark Untersuchungen von spezifischen neuronalen Schaltungen erleichtern , die bestimmte Verhaltensweisen steuern. 302 Neuronen bilden das Nervensystem des erwachsenen Hermaphroditen, die eine breite Palette von sensorischen Input in grundlegende Verhaltens Ausgänge wie Lokomotion verarbeiten. Die Struktur des komplexeren männlichen Nervensystem hat auch 37 beschrieben worden ist , so dass geschlechtsspezifische Schaltung angesprochen werden. 37
C. elegans Verhalten wurde auf Standard – Kulturplatten mit festen Medien ausführlich untersucht. Da WT C. elegans bewegt sich in vorhersehbarer Sinuswellen auf Agar gefüllten Platten, Abweichungen von derGesamtmuster kann durch Auge und erzielte manuell erfasst werden. Dieser Ansatz ist jedoch unter dem Kriterium des Experimentators und ist arbeitsintensiv. Hard- und Software – Tools entwickelt , zu verfolgen und zu messen C. elegans Fortbewegung auf festen Medien die Vorspannung Subjektivität entfernen und ermöglichen eine groß angelegte Studien, komplexere biologische Fragestellungen ermöglicht angesprochen werden. Die jüngste Verhaltensdatenbank durch das Labor erstellt Schafer 16 ist ein ausgezeichnetes Beispiel für die analytische Ausdehnung und Tiefe , die auf Platten mit einem Rechensystem für die Fortbewegung erreicht wurde.
Wenn WT C. elegans in Flüssigkeit gelegt wird, passt sich das Tier schnell seine Bewegung in die neue Umgebung, ein Bad zu initiieren. C. elegans Schwimmen einen größeren Bewegungsspiel nutzt als kriechende und unregelmäßiger 8 sein kann. Software wie CELEST soll die Lücke für eine detaillierte Analyse von C. elegans zu füllen Verhalten in flüssiger, permitting Quantifizierung von Bewegungs-assoziierten Parameter, die nicht ohne weiteres durch die un-Aided Auge gemessen werden, oder dass schneller als die manuelle Scoring durchgeführt werden kann. In 8 Fest h verarbeiten bis zu 200 Videos, ~ 1.000 Datensätze pro Tag ein individuelles könnte.
Die Software definiert Schwimmen Beurteilung Parameter, die als umfassende Fingerabdruck der körperlichen Fitness und Verhalten dienen. Darüber hinaus Verständnis der komplexen Facetten von C. elegans Verhalten in flüssiger und ihre zugrunde liegenden molekularen Mechanismen zu bereichern, kann diese Software verwendet werden , um mehrere Aspekte der Biologie einschließlich pharmakologischen Reaktionen, Altern und unterschiedliche Verhalten zu erforschen. Der hier präsentierte die Übersicht über die quantifizierten Veränderungen , die in der körperlichen Leistungsfähigkeit von C. elegans auftreten Erwachsene , wie sie im Alter von einem Beispiel für eine solche Anwendung der Software ist (für eine ausführlichere Darstellung siehe Restif et al. 8). Im Zusammenhang mit der Alterung verringerte sich einige gemessenen Parameter währendandere erhöht oder nicht konsequent war in Wildtyp verändern. Trends wurden zu einem großen Teil von der Rechen Profil der Langlebigkeit Mutanten bestätigt, und die relativen Profile von anmutigen und schlechte ager Kohorten gleichgeschlechtlicher Alter Populationen gehalten in Uniform Umweltbedingungen. Die hohe Auflösung der Software kann auch subtile Phänotypen zeigen bisher unbekannte in ausführlich charakterisiert Mutanten (zB Alter-1 (hx546) in Abbildung 1).
Es gibt einige besonders kritische Schritte des Protokolls beschrieben. eine konstante Temperaturumgebung zwischen der Schwimm Umgebung pflegen und die Dehnungsmeßplatte Kultur ist für Schwimmen Reproduzierbarkeit wichtig, so Experimentatoren sind große Mühe zu gehen, sehr ermutigt, um zufällige Temperaturschwankungen vermeiden. Schwimm Medien sollten wie die Platten bei der gleichen Temperatur sein. Ebenso wird sorgfältig auf die Tropfengröße für das Schwimmen helfen Reproduzierbarkeit gewährleisten. Schließlich ist es ratsam, in zu denkenVoraus über die Abladen der großen Video-Dateien, die sich ansammeln. Die Verarbeitung von Bildern auf einer Seite neben der Video-Capture-Computer wird empfohlen.
Die Verwendung der Software hier für swim Analyse vorgestellt hat bestimmte Einschränkungen. Erstens: Obwohl die Programme gleichzeitig mehrere Tiere verfolgen können, wenn mehr als fünf Tiere gemeinsam analysiert werden, besteht eine erhöhte Wahrscheinlichkeit, dass die Tiere übereinander in den Videobildern schwimmen. Wenn das Programm nicht eindeutig bestimmen, welches Tier war die, wie es jene Datenrahmen zensiert. Obwohl dieses Programm stellt sicher, dass Daten für einzelne Tiere von hoher Qualität sind, schränkt sie den Durchsatz. Zweitens sollten die Bilder ziemlich sauber sein, dh frei von Staub, Schmutz und Blendung durch Leuchten, als assoziierte Signale auch die Bildanalyse durcheinander bringen kann. Wie bereits in Abschnitt 2.1.1 Protokoll, ein sehr Low-Tech-Investitionen, die sich stark der Bildaufnahme durch die Beseitigung Komplikationen im Zusammenhang mit Schwankungen helfen kann in Umgebungsbeleuchtung ist die Bühnenbereich mit einem dunklen Tuch abdecken, die nicht Umgebungslicht erlaubt, um die Bühne zu erreichen. Drittens wird das Programm für die Tiere bei erwachsenen Stadium optimiert. Junge Larven schwimmen sehr schnell und haben kleine Körper, die Programmfehler erhöht. Viertens nutzt einige der Software MATLAB, und wenn es Versions-Upgrades und / oder Betriebssystem-Upgrades können einige Programmverknüpfungen gestört werden. Derzeit ist die Software für den Einsatz auf MATLAB 2015B und Mac OS Version 10.10 optimiert, aber wir erwarten, dass in Kürze eine Software-Version zu veröffentlichen, die robuster gegenüber solchen Veränderungen ist. Schließlich können die Videodatendateien groß werden schnell und Speicherplatz benötigen zugeteilt werden.
Zusammenfassend hier präsentiert ist eine einfache Methode , die von jedem Labor ohne große Investitionen leicht umgesetzt werden können für CELEST Analyse Schwimmen Videos von C. elegans zu erstellen. Funktionen des Softwarepakets gehören umfangreiche Automatisierung von Tracking durchAnalyse, simultanen Multi-Tier – Verfolgung und Verwendung von mathematischen Grundlagen (dh Krümmungsmaßnahmen) zur Quantifizierung der meisten Bewegungsparameter. Die Software ist Open Source, mit Code und Demos öffentlich zugänglich wie in Restif detailliert et al. 8. Obwohl die Programmanalyse Advanced Computer Vision für Tracking – Funktionen, anderen veröffentlichten Tracking – Systeme (zB Greenblum et al., 2014 38) sind kompatibel mit der Parameteranalyse der Software vorgestellt. Zukünftige Verbesserungen werden in Richtung Umwandlung der Software in ein robusteres Paket gerichtet werden, die Verwendung auf die spezifischen Versionen der Betriebssysteme nicht oben erwähnt beschränken (auch in der Tabelle der Materialien angegeben).
The authors have nothing to disclose.
CELEST Entwicklung von NIH gewährt R21AG027513 und U01AG045864 unterstützt wurde. Daten und einige kurze Videodarstellungen sind aus Restif et al angepasst. (2014) 8, die unter der Creative Commons Namensnennung (CC BY) Lizenz veröffentlicht wurden http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/. Wir danken Ricardo Laranjeiro für Manuskript Hilfe.
REAGENT | |||
N2 | Caenorhabditis Genetics Center (CGC) | C. elegans wild type (ancestral). | |
OP50 Escherichia coli | Caenorhabditis Genetics Center (CGC) | Biosafety Level: BSL-1. | |
OP50-1 Escherichia Coli | Caenorhabditis Genetics Center (CGC) | Streptomycin resistant strain of OP50. Biosafety Level: BSL-1. | |
Streptomycin sulfate salt | Sigma-Aldrich | S6501 | |
Printed Microscope Slides | Thermo Fisher Scientific | Gold Seal Fluorescent Antibody Microslides: 3032-002 | have two etched 10mm diameter circles delineated by white ceramic ink |
Nematode Growth Medium (NGM) | For 1L: 17g Agar, 3g NaCl, 2.5g Peptone, 1mL 1M CaCl2, 1mL 5mg/mL Cholesterol in ethanol, 25mL 1M KPO4 buffer, 1mL 1M MgSO4, H2O to 1 L. Sterilize by autoclaving. | Stiernagle, T. Maintenance of C. elegans. WormBook, 1-11, doi:10.1895/wormbook.1.101.1 (2006) | |
M9 buffer | For 1L: 3g KH2PO4, 6g Na2HPO4, 5g NaCl, 1mL 1 M MgSO4, H2O to 1 L. Sterilize by autoclaving. | Stiernagle, T. Maintenance of C. elegans. WormBook, 1-11, doi:10.1895/wormbook.1.101.1 (2006) | |
EQUIPMENT | |||
CeleST | Driscoll Lab, Rutgers University | C. elegans Swim Test | Open Source, see http://celestmod.github.io/CeleST/ and http://celest.mbb.rutgers.edu/ |
MATLAB | www.mathworks.com/downloads | MatLab version 2015b (best) | The CeleST version demonstrated here has best functionality with Mac OS 10.10 and MatLab 2015b. MATLAB 2015B introduced changes to how MATLAB handled graphics, including a new coding convention and syntax. These changes resolved an issue that couldn't be resolved elegantly (primarily because the internals of MATLAB really needed the major graphics overhaul implemented in MATLAB 2015B). For this reason, CeleST should always be run on MATLAB 2015B or later versions. However for users without access to MATLAB version 2015B or later (or MATLAB at all), we have created a CeleST program that doesn't need MATLAB on the computer at al. An installer is downloaded by the prospective user and then it installs itself onto the computer through a couple prompts like most programs. |
Mac OS | www.apple.com | Version 10.10 | Currently, CeleST has been ported to the major operating systems (Windows, Mac, and Linux). The current code can be run on any of the operating systems and there are versions for each operating system that don't even require users to have MATLAB to use CeleST (this version requires a large download). The Windows version has been tested the least and is most prone to bugs as such. Linux has been moderately tested. And Mac has been and continues to be tested extensively (primarily because it's the operating system in our lab). |
Stereomicroscope | Zeiss | Stemi 2000-C | |
Transmitted Light Base | Diagnostic Instruments | TLB 3.1 | |
Digital CCD Camera | QImaging | Rolera-XR Mono Fast 1394 (ROL-XR-F-M-12) | |
Digital Video Recording Software | Norpix | Streampix Version 3.17.2 |