Een efficiënte en eenvoudige methode voor het computer-gebaseerde analyse van nematode zwemmen gedrag in de vloeistof wordt beschreven. De methode vereist weinig tot geen investering voor C. elegans laboratoria. De gebruikte hardware is standaard, en de computer software voor de gedragsanalyse (celest) is een open source is.
Ontrafeling van de neuronale en neuromusculaire circuits die gedrag te reguleren blijft een grote uitdaging in de biologie. Het aaltje Caenorhabditis elegans heeft zich bewezen als een onschatbare modelorganisme in het helpen om deze uitdaging aan te pakken, van inspirerende technologische benaderingen, de bouw van het menselijk brein connectoom, om daadwerkelijk licht werpen op de specifieke moleculaire bestuurders van elementaire functionele patronen. Het grootste deel van de gedragsstudies in C. elegans zijn uitgevoerd op vaste substraten. In vloeibare, dieren vertonen gedragspatronen die beweging op verschillende snelheden in 3D, evenals gedeeltelijke lichaamsbewegingen, zoals een achterste krul zonder anterior vormverandering, die nieuwe uitdagingen voor kwantificering voeren omvatten. De stappen van een eenvoudige procedure, en het gebruik van een software die zorgt voor een hoge-resolutie analyse van C. elegans zwemmen gedrag, worden hier gepresenteerd. De software, genaamd Celest, maakt gebruik van een gespecialiseerd computerprogramma dat tracksmeerdere dieren gelijktijdig en voorziet in nieuwe maatregelen van C. elegans motoriek in vloeibare (zwemmen). De maatregelen zijn vooral geworteld in dierlijke houding en op basis van de wiskunde gebruikt in computer vision en patroonherkenning, zonder computationele eisen voor drempel cut-offs. Het computerprogramma kan worden gebruikt om zowel de algehele beoordeling zwemmen bekwaamheid in honderden dieren gecombineerde kleine partij proces, alsmede nieuwe fenotypes zelfs in goed gekarakteriseerde genetische mutanten onthullen. De voorbereiding van de monsters voor analyse met Celest is eenvoudig en low-tech, waardoor grote aanpassing door de wetenschappelijke gemeenschap. Gebruik van de rekenkundige benadering beschreven derhalve bijdragen tot een beter inzicht in het gedrag en gedragsproblemen circuits in de C. elegans model.
Het definiëren van hoe genetica, epigenetica, ervaring en milieu invloed gedrag is een belangrijke uitdaging in de moderne biologie. Eenvoudig, genetisch vatbaar modellen die computationeel kan worden gevolgd en gemeten kunnen kritische bijdragen in de richting van dit doel. Het aaltje Caenorhabditis elegans is een dergelijk model. Het doel van dit artikel is om aan te tonen hoe C. elegans zwemmen motoriek kunnen worden gevolgd en gekwantificeerd om informatie te halen over acht nieuwe kenmerken met biologische relevantie.
C. elegans heeft een relatief korte levensduur van ongeveer 2-3 w en reproductieve periode van ongeveer 4 dagen bij 20 ° C 1,2. In standaard laboratorium culturen, wordt dit microscopische nematode gekweekt op Petri platen die Nematode Growth Media (NGM) die verspreid met een bacteriële voedselbron 3,4. WT N2 dieren actief te bewegen in een elegante sinusvormige golven op-agar gevulde platen; ze veranderen beweging rates bij roaming (voedsel zoekende), woning (browsing), of die herstellen van een maaltijd (inactief verzadiging rust) 5. Impairment 6 of 7-12 kunnen ook drastisch veranderen beweging op platen.
Genen die gedrag moduleren, healthspan of veroudering, kan functioneel worden gekarakteriseerd door het analyseren van C. elegans bewegingspatronen of de motoriek. Een benadering voor healthspan meten is volwassenen ouder worden ingedeeld in drie categorieën (bijvoorbeeld A, B en C) volgens hun voortbeweging op platen met krachtige fysieke activiteit is klasse A en klasse C verlamming waarbij 7,8,13. Hoewel een dergelijke kwalitatieve sorteren is het nuttig om de verschillen in fysieke fitheid te onthullen, de categorieën zijn breed zonder duidelijke grenzen en zo hun scoring is onderhevig aan vertekening experimentator.
Een groeiend aantal trackers hebben de objectiviteit, verfijning verheven, en de precisie van de analyse van C. elegans bewegingop vaste media 14-18. C. elegans voortbeweging op platen wordt meestal beperkt tot het vlak waarin het dier contact met het oppervlak van de media maakt. (C. elegans kan ook exploratie induceren door het opheffen van het hoofd van de rest van het lichaam die nog in contact met een vast oppervlak, het positioneren van het lichaam in verschillende vlakken. Echter, dit gedrag is ongebruikelijk.) Bij plaatsing in vloeibare, deze nematode initieert een golvend beweging, of zwemmen, die meer uitgebreide dimensionale beweging, een groter bereik van de snelheid en de diepte van de beweging, en een verhoogde incidentie met de leeftijd van de anterior bewegen anders posterior beschikt in vergelijking met de dieren op vaste oppervlakken. Als een snelle analyse van de fysieke fitheid en de reactie op nieuwe omgeving, kan een onderzoeker een individueel dier te plaatsen in een vloeibare daling van het thuispubliek de frequentie van het lichaam bochten onder het ontleden scope. Video opname te kunnen huidige en toekomstige bezettingen van het zwembad kracht van het vergemakkelijkendier. Echter beperkt de handmatige benadering het aantal functies die kunnen worden gemaakt, en is volledig beperkt tot het maken van één dier tegelijk.
Locomotion in vloeistof is minder onderzocht dan beweging op vaste media. Inderdaad, er zijn maar weinig software-opties die robuust en eenvoudig te implementeren in het laboratorium om de motoriek in vloeibare 19-24 te meten zijn. De software Celest (C. elegans Swim Test) biedt eenvoud in gebruik en wiskundige-gebaseerde maatregelen die gegevens (kromming scores) leveren direct relevant zijn voor de aard van de beweging 8; (gedetailleerde beschrijving van de kenmerken en voordelen in Restif et al. 8). Bovendien computeranalyse maakt de opheldering van fenotypische kenmerken die onmogelijk het menselijk oog te scoren zijn. Hier, data dat de resolutie van deze analyse aanpak illustreren worden gepresenteerd en een eenvoudig te implementeren protocol te zwemmen proeven op te nemen voor verdere celest analyse wordt beschreven.
Het gebruik van C. elegans als een modelsysteem blijft toenemen als gevolg van de genetische maakbaarheid, experimentele tractability en anatomie geannoteerde om minutieuze details. Zo wordt de neuronale structuur en de connectiviteit van het C. elegans hermafrodiet duidelijk in kaart gebracht 34-36, aanzienlijk vergemakkelijken onderzoeken van specifieke neuronale circuits die bepaalde gedragingen te controleren. 302 neuronen vormen de volwassen hermafrodiet het zenuwstelsel, die een breed scala van zintuiglijke input in basic gedrags-uitgangen, zoals motoriek te verwerken. De structuur van de complexere mannelijke zenuwstelsel is ook beschreven 37, waardoor seksespecifiek schakelingen worden aangepakt. 37
C. elegans gedrag is uitgebreid bestudeerd standaard kweekplaten met vaste media. Aangezien WT C. elegans beweegt voorspelbare sinusvormige golven op agar-platen gevuld, afwijkingen van dealgemene patroon kan worden gedetecteerd door het oog en scoorde handmatig. Deze benadering is echter afhankelijk criterium de experimentator en is arbeidsintensief. Hardware en software tools die ontworpen zijn op te sporen en te meten C. elegans motoriek op vaste media verwijder de subjectiviteit vooringenomenheid en zorgen voor grootschalige studies, waardoor meer geavanceerde biologische vragen die moeten worden aangepakt. De recente gedrags-database die door de Schafer lab 16 is een uitstekend voorbeeld van de analytische uitbreiding en diepte die is bereikt met een computationeel systeem voor vervoer op platen.
Wanneer WT C. elegans wordt geplaatst in vloeistof, het dier snel aanpast haar ontwerpresolutie aan de nieuwe omgeving, het initiëren van een duik. C. elegans zwemmen maakt gebruik van een groter bereik van de beweging dan kruipen en kan onregelmatiger 8 zijn. Software zoals Celest is bedoeld om de kloof voor een gedetailleerde analyse van C. elegans te vullen gedrag in vloeibare, PermiVoorbereidingen kwantificering van motion-geassocieerde parameters die niet gemakkelijk worden gemeten door de VN-gesteunde oog, of dat kan sneller dan handmatige scoring worden bereikt. In 8 harde h kon een individu tot verwerken tot 200 video's, ~ 1000 records per dag.
De software definieert zwemmen beoordelen van parameters die dienen als een uitgebreide vingerafdruk van de fysieke fitheid en gedrag. In aanvulling op het verrijken van inzicht in de complexe aspecten van C. elegans gedrag in vloeibare en hun onderliggende moleculaire pathways, kan deze software worden gebruikt om meerdere aspecten van de biologie, waaronder farmacologische reacties, veroudering, en verschillend gedrag te verkennen. Hier gepresenteerde overzicht van de gekwantificeerde veranderingen die optreden in de fysieke prestaties van C. elegans volwassenen ze ouder is een voorbeeld van een dergelijke toepassing van de software (voor een nadere uiteenzetting Zie Restif et al. 8). In de context van veroudering, wat gemeten parameters afgenomen terwijlanderen verhoogd of niet consequent veranderen in wild type. Trends bevestigd grotendeels door de rekenkundige profiel van levensduur mutanten en de relatieve profielen sierlijke en slechte ager cohorten van dezelfde leeftijdsgroepen bewaard in uniform omgevingsomstandigheden. De hoge resolutie van de software kan ook zien subtiele fenotypen onbekende in uitgebreid gekarakteriseerd mutanten (bijvoorbeeld leeftijd-1 (hx546) in figuur 1).
Er zijn een aantal bijzonder kritische stappen van het beschreven protocol. Het handhaven van een constante temperatuur omgeving tussen het zwemmen milieu en de druk plaat cultuur is belangrijk voor zwemmen reproduceerbaarheid, zodat onderzoekers sterk worden aangemoedigd om te gaan naar grote moeite om willekeurige veranderingen in temperatuur te voorkomen. Swim media moet op dezelfde temperatuur als de platen. Ook zal aandacht voor de druppelgrootte voor het zwemmen te zorgen reproduceerbaarheid. Tot slot is het verstandig om na te denken invooraf over het lossen van de grote videobestanden die zich ophopen. Het verwerken van afbeeldingen op een site met uitzondering van de video-opname computer is aan te bevelen.
Het gebruik van de software hier gepresenteerde voor zwemt analyse heeft bepaalde beperkingen. Ten eerste, hoewel de programma's tegelijkertijd meerdere dieren kan volgen, als er meer dan vijf dieren gezamenlijk worden geanalyseerd, er een grotere kans dat de dieren zwemmen in elkaar in de videobeelden. Wanneer het programma niet ondubbelzinnig bepalen welk dier was dat zij censureert die gegevensframes. Hoewel dit programma functie zorgt ervoor dat gegevens voor individuele dieren zijn van hoge kwaliteit, beperkt het debiet. Ten tweede moet de afbeeldingen redelijk schoon zijn, die vrij is van stof, vlekken en schittering van verlichting, zoals bijbehorende signalen ook de beeldanalyse kan verwarren. Zoals vermeld in protocol punt 2.1.1, een zeer low-tech investeringen die sterk beeld vast te leggen kan helpen door het elimineren van complicaties met fluctuaties in milieu-verlichting is op het podium met een donkere doek die niet toestaat omgevingslicht naar het podium te bereiken dekken. Ten derde, wordt het programma geoptimaliseerd voor dieren die het volwassen stadium. Jonge larven zwemmen erg snel en hebben kleine lichamen, die fout in het programma vergroot. Ten vierde, een deel van de software maakt gebruik van MATLAB, en als er versie-upgrades en / of upgrades van het besturingssysteem, kunnen sommige programma koppelingen worden verstoord. Op dit moment is de software geoptimaliseerd voor gebruik op MATLAB 2015b en Mac OS-versie 10.10, maar we verwachten binnenkort een software-versie die meer bestand tegen dergelijke veranderingen te posten. Tenslotte kan de videobestanden grote snel geworden, en vereisen opslagruimte toe te wijzen.
Kortom, hier wordt gepresenteerd is een eenvoudige methode die gemakkelijk door een laboratorium kan worden uitgevoerd zonder veel investeringen video's van C. elegans zwemmen voor celest analyse te maken. Kenmerken van de software-pakket zijn onder andere vergaande automatisering van het volgen door middel vananalyse, simultane multi-dier volgen en gebruik van wiskundige basen (bijv kromming maatregelen) kwantificatie van de meeste beweging parameters. De software is open source, met code en demo's publiekelijk verkrijgbaar zoals beschreven in Restif et al. 8. Hoewel het programma is voorzien van geavanceerde computer vision analyse voor het bijhouden, andere gepubliceerd tracking systemen (bijvoorbeeld Greenblum et al., 2014 38) zijn compatibel met de parameter analyse van de software hier gepresenteerd. Toekomstige verbeteringen zullen worden gericht op het omzetten van de software in een robuuste behuizing die geen gebruik van de specifieke versie van de bovenstaande besturingssystemen (ook aangeduid in de Tabel Materials) niet beperkt.
The authors have nothing to disclose.
Celest ontwikkeling werd ondersteund door NIH subsidies R21AG027513 en U01AG045864. Gegevens en een aantal korte video voorstellingen worden aangepast van Restif et al. (2014) 8, die onder de Creative Commons Naamsvermelding (CC BY) licentie http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/ werden gepubliceerd. Wij danken Ricardo Laranjeiro voor manuscript hulp.
REAGENT | |||
N2 | Caenorhabditis Genetics Center (CGC) | C. elegans wild type (ancestral). | |
OP50 Escherichia coli | Caenorhabditis Genetics Center (CGC) | Biosafety Level: BSL-1. | |
OP50-1 Escherichia Coli | Caenorhabditis Genetics Center (CGC) | Streptomycin resistant strain of OP50. Biosafety Level: BSL-1. | |
Streptomycin sulfate salt | Sigma-Aldrich | S6501 | |
Printed Microscope Slides | Thermo Fisher Scientific | Gold Seal Fluorescent Antibody Microslides: 3032-002 | have two etched 10mm diameter circles delineated by white ceramic ink |
Nematode Growth Medium (NGM) | For 1L: 17g Agar, 3g NaCl, 2.5g Peptone, 1mL 1M CaCl2, 1mL 5mg/mL Cholesterol in ethanol, 25mL 1M KPO4 buffer, 1mL 1M MgSO4, H2O to 1 L. Sterilize by autoclaving. | Stiernagle, T. Maintenance of C. elegans. WormBook, 1-11, doi:10.1895/wormbook.1.101.1 (2006) | |
M9 buffer | For 1L: 3g KH2PO4, 6g Na2HPO4, 5g NaCl, 1mL 1 M MgSO4, H2O to 1 L. Sterilize by autoclaving. | Stiernagle, T. Maintenance of C. elegans. WormBook, 1-11, doi:10.1895/wormbook.1.101.1 (2006) | |
EQUIPMENT | |||
CeleST | Driscoll Lab, Rutgers University | C. elegans Swim Test | Open Source, see http://celestmod.github.io/CeleST/ and http://celest.mbb.rutgers.edu/ |
MATLAB | www.mathworks.com/downloads | MatLab version 2015b (best) | The CeleST version demonstrated here has best functionality with Mac OS 10.10 and MatLab 2015b. MATLAB 2015B introduced changes to how MATLAB handled graphics, including a new coding convention and syntax. These changes resolved an issue that couldn't be resolved elegantly (primarily because the internals of MATLAB really needed the major graphics overhaul implemented in MATLAB 2015B). For this reason, CeleST should always be run on MATLAB 2015B or later versions. However for users without access to MATLAB version 2015B or later (or MATLAB at all), we have created a CeleST program that doesn't need MATLAB on the computer at al. An installer is downloaded by the prospective user and then it installs itself onto the computer through a couple prompts like most programs. |
Mac OS | www.apple.com | Version 10.10 | Currently, CeleST has been ported to the major operating systems (Windows, Mac, and Linux). The current code can be run on any of the operating systems and there are versions for each operating system that don't even require users to have MATLAB to use CeleST (this version requires a large download). The Windows version has been tested the least and is most prone to bugs as such. Linux has been moderately tested. And Mac has been and continues to be tested extensively (primarily because it's the operating system in our lab). |
Stereomicroscope | Zeiss | Stemi 2000-C | |
Transmitted Light Base | Diagnostic Instruments | TLB 3.1 | |
Digital CCD Camera | QImaging | Rolera-XR Mono Fast 1394 (ROL-XR-F-M-12) | |
Digital Video Recording Software | Norpix | Streampix Version 3.17.2 |