En effektiv och enkel metod för att datorbaserad analys av nematod simbeteende i flytande beskrivs. Metoden kräver liten eller ingen investering för C. elegans laboratorier. Hårdvaran som används är standard, och programvara för beteendeanalys (Celest) är en öppen källkod en.
Dissekera neuronala och neuromuskulära kretsar som reglerar beteende fortfarande en stor utmaning i biologi. Nematoden Caenorhabditis elegans har visat sig vara en ovärderlig modellorganism för att hjälpa att ta itu med denna utmaning, från inspirerande tekniska metoder, bygga den mänskliga hjärnan connectome, faktiskt belysa de specifika molekylära förare av grundläggande funktionella mönster. Huvuddelen av de beteendestudier i C. elegans har utförts på fasta substrat. I flytande form, djur uppvisar beteendemönster som inkluderar rörelse i ett hastighetsområde i 3D, liksom partiella kroppsrörelser, såsom en bakre curl utan främre formförändring, som inför nya utmaningar för kvantifiering. Stegen i en enkel procedur och användning av en programvara som möjliggör hög upplösning analys av C. elegans simma beteende, presenteras här. Mjukvaran, som heter Celest, använder en specialiserad datorprogram som spårarflera djur samtidigt och ger nya åtgärder för C. elegans förflyttning i flytande (simning). Åtgärderna mestadels jordade i djur hållning och bygger på matematik som används inom datorseende och mönsterigenkänning, utan beräkningskraven för tröskel cut-off. Programverktyget kan användas för att både bedöma de samlade simning skicklighet i hundratals djur från blandade små serier försök och för att avslöja nya fenotyper även i väl karakteriserade genetiska mutanter. Framställningen av prover för analys med CELEST är enkel och låg-tech, vilket möjliggör bred anpassning av det vetenskapliga samfundet. Användning av beräknings metod som beskrivs här bör därför bidra till större förståelse för beteende och beteende kretsar i C. elegans modell.
Definiera hur genetik, epigenetik, erfarenhet och miljö påverkar beteendet är en stor utmaning i modern biologi. Enkla, genetiskt mottagliga modeller som kan beräknings spåras och mäts kan göra kritiska bidrag mot detta mål. Nematoden Caenorhabditis elegans är en sådan modell. Syftet med denna artikel är att visa hur C. elegans simning förflyttning kan spåras och kvantifieras för att extrahera information om åtta nya funktioner med biologisk relevans.
C. elegans har en relativt kort livslängd av ca 2-3 w och en reproduktiv period av cirka 4 d vid 20 ° C 1,2. I standardlaboratoriekulturer, är denna mikroskopiska nematod odlas på petriskålar innehållande Nematode Growth Media (NGM) som är spridda med en bakteriell födokälla 3,4. WT N2 djur rör sig aktivt i eleganta sinusvågor på agar-fyllda plattor; de ändrar rörelse råttaes vid roaming (mat sökande), bostad (surfar), eller återhämta sig från en måltid (inaktiv mättnad inaktivitet) 5. Njurfunktion 6 eller ålder 7-12 kan också dramatiskt förändra rörelse på plattor.
Gener som modulerar beteende, healthspan eller åldrande, kan funktionellt karaktäriseras genom att analysera C. elegans rörelsemönster eller rörelse. Ett sätt att mäta healthspan är att klassificera åldrande vuxna i tre kategorier (t.ex. A, B och C) enligt deras förflyttning på plattor, med kraftig fysisk aktivitet är klass A och förlamning är klass C 7,8,13. Även om en sådan kvalitativ sortering är användbar för att avslöja skillnader i fysisk kondition, kategorierna är breda utan tydliga gränser och därmed deras poäng är föremål för försöksledaren partiskhet.
Ett växande antal trackers har förhöjda objektivitet, förfining och precisionen hos analysen av C. elegans rörelsepå fasta medier 14-18. C. elegans förflyttning på plattor är till största delen begränsad till det plan i vilket djuret kommer i kontakt med den fasta ytan av medierna. (C. elegans kan också framkalla utforskning genom att lyfta huvudet från resten av kroppen som fortfarande är i kontakt med en fast yta, placera kroppen i flera plan. Det är dock ovanligt detta beteende.) När den placeras i flytande form, detta nematod initierar en undulatory rörelse, eller simning, som har mer omfattande dimensionell rörelse, ett större utbud av hastighet och djup rörelse och en ökad incidens med åldern av främre rör sig annorlunda än bakre jämfört med djur på fasta ytor. Som en snabb analys av fysisk kondition och svar på nya miljö, kan en försöks placera ett enskilt djur i en vätskedroppe och göra dess frekvens av kropps böjar under dissekera omfattning. Videoinspelning kan underlätta nuvarande och framtida skåror i simning kraft avdjur. Men begränsar den manuella tillvägagångssätt antal funktioner som kan görs, och är helt begränsad till att ha dödat ett djur i taget.
Locomotion i vätska har mindre utforskat än förflyttning på fasta medier. I själva verket finns det få programvara alternativ som är robust och enkel att implementera i laboratoriet för att mäta förflyttning i flytande 19-24. Programvaran Celest (C. elegans Swim Test) erbjuder lättanvända och matematiska baserade åtgärder som levererar data (krökning poäng) är direkt relevanta för den typ av motion 8; (detaljerad beskrivning av särdragen och fördelarna i Restif et al. 8). Dessutom möjliggör beräknings analys klarlägga fenotypiska egenskaper som är omöjliga för det mänskliga ögat att göra mål. Här är data som exemplifierar upplösningen av denna analys tillvägagångssätt presenteras och en enkel att implementera protokoll för att spela simma försök för efterföljande celest analys beskrivs.
Användningen av C. elegans som modellsystem fortsätter att öka på grund av dess genetiska formbarhet, experimentell spårbarhet och anatomi kommenterade till minsta detalj. Till exempel, är den neuronala strukturen och anslutning av C. elegans hermafrodit tydligt kartlagt 34-36, kraftigt underlätta undersökningar av specifika neuronala kretsar som styr speciella beteenden. 302 neuroner utgör den vuxna hermafrodit nervsystem, vilket förfarande ett brett spektrum av sensoriska input till grundläggande beteende utgångar som förflyttning. Strukturen för mer komplexa manliga nervsystemet har också beskrivits 37, möjliggör könsspecifika kretsar som måste lösas. 37
C. elegans beteende har studerats omfattande på standardiserade odlingsplattor innehållande fast media. Sedan WT C. elegans rör sig i förutsägbara sinusvågor på agar-fyllda plattor, avvikelser frånövergripande mönstret kan detekteras med ögat och scored manuellt. Detta tillvägagångssätt är emellertid föremål för den som utför experimentet kriterium och är arbetsintensiv. Hårdvaru- och mjukvaruverktyg som syftar till att spåra och mäta C. elegans förflyttning på fasta medier bort subjektivitet partiskhet och möjliggöra storskaliga studier, vilket möjliggör mer sofistikerade biologiska frågor som skall behandlas. Den senaste tidens beteende databas som skapats av Schafer lab 16 är ett utmärkt exempel på den analytiska förlängning och djup som har uppnåtts med en beräkningssystemet för transport på plattor.
När WT C. elegans är placerad i vätska, anpassar djuret snabbt sin rörelse till den nya miljön, initiera ett dopp. C. elegans simning använder ett större utbud av rörelse än krypa och kan vara mer oregelbunden 8. Program som Celest är avsett att fylla gapet för detaljerad analys av C. elegans beteende i vätska, Permimma kvantifiering av rörelserelaterade parametrar som inte är lätt mätt med FN-understödda ögat, eller som kan åstadkommas snabbare än manuell scoring. I åtta hård h en individ kan hantera upp till 200 filmer, ~ 1000 poster per dag.
Programvaran definierar simning bedöma parametrar som fungerar som en omfattande fingeravtryck av fysisk kondition och beteende. Förutom att berika förståelsen av de komplexa aspekterna av C. elegans beteende i flytande och deras bakomliggande molekylära vägar, kan detta program användas för att undersöka flera aspekter av biologi inklusive farmakologiska svaren, åldrande och distinkt beteende. Här presenteras en översikt över de kvantifierade förändringar som sker i den fysiska utförandet av C. elegans vuxna när de blir äldre är ett exempel på en sådan tillämpning av programmet (för en mer detaljerad redogörelse, se et al. Restif 8). I samband med åldrande, minskade vissa uppmätta parametrar samtidigtandra ökade eller inte konsekvent förändras i vildtypen. Trender bekräftades till stor del av beräknings profil livslängd mutanter, och de relativa profilerna för graciösa och dåliga Ager kohorter av samma ålderspopulationer hålls i enhetliga miljöförhållanden. Den höga upplösningen av programvaran kan också avslöja subtila fenotyper tidigare okänd i stor utsträckning kännetecknas mutanter (t.ex. ålders en (hx546) i figur 1).
Det finns några särskilt kritiska stegen i protokollet beskrivs. Att upprätthålla en konstant temperatur miljö mellan simma miljö och stammen plattan kulturen är viktig för simma reproducerbarhet, så praktiker är mycket uppmuntras att gå till stora ansträngningar för att undvika slumpvisa temperaturförändringar. Swim mediet bör hållas vid samma temperatur som plattorna. På samma sätt kommer noga att droppstorleken för simma bidra till reproducerbarhet. Slutligen är det klokt att tänka iavancera om avlastning av stora videofiler som ackumuleras. Behandling av bilder på en webbplats bortsett från videoinspelning datorn rekommenderas.
Användningen av programvaran presenteras här för simma analys har vissa begränsningar. Först, även om programmen kan samtidigt spåra flera djur, om mer än fem djur gemensamt analyseras, finns det en ökad risk att djuren kommer att simma över varandra i videobilder. När programmet kan inte entydigt avgöra vilka djur var som det censurerar dessa dataramar. Även om detta program funktionen ser till att data för enskilda djur är av hög kvalitet, men det begränsar genomströmningen. För det andra bör bilderna vara ganska ren, som är fri från damm, smuts och reflexer från lampor, som tillhörande signaler kan också förbrylla bildanalysen. Som nämnts i protokollet avsnitt 2.1.1, en mycket låg-tech investering som i hög grad kan bidra till bildfångst genom att eliminera komplikationer med fluktuationer in miljö belysning är att täcka scenområdet med en mörk duk som inte tillåter omgivande ljus att nå scenen. För det tredje, är programmet är optimerat för djur vid vuxen skede. Unga larver simma mycket snabbt och har små kroppar, vilket ökar programfel. Fjärde, en del av programvaran utnyttjar MATLAB, och när det finns versionsuppgraderingar och / eller uppgraderingar av operativsystem, kan vissa program länkar störas. För närvarande är programmet optimerad för användning på MATLAB 2015b och Mac OS version 10.10, men vi förväntar oss snart att skicka en version som är mer robust mot sådana förändringar. Slutligen kan video datafiler bli stor snabbt och kräver utrymme ska tilldelas.
Sammanfattningsvis är presenteras här en enkel metod som lätt kan implementeras på alla laboratorier utan större investeringar för att skapa videor av C. elegans simning för Celest analys. Dragen av programpaketet inkluderar omfattande automatisering från att spåra genomanalys, samtidigt flera djur spårning och användning av matematiska baser (dvs, krökning åtgärder) för kvantifiering av de flesta locomotion parametrar. Programvaran är öppen källkod, med kod och demos tillgängliga för allmänheten som beskrivs i Restif et al. 8. Även om programmet har avancerad datorseende analys för att spåra andra publicerade tracking system (t.ex. Greenblum et al., 2014 38) är förenliga med parametern analys av programvaran som presenteras här. Framtida förbättringar kommer att riktas mot att omvandla programvaran till en mer robust paket som inte begränsar användningen av de särskilda versioner av operativsystemen ovan (även anges i tabellen of Materials).
The authors have nothing to disclose.
Celest utveckling stöddes av NIH bidrag R21AG027513 och U01AG045864. Data och några korta videorepresentationer anpassas från Restif et al. (2014) 8, som publicerades under Creative Commons Attribution (CC BY) licens http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/. Vi tackar Ricardo Laranjeiro för manuskript hjälp.
REAGENT | |||
N2 | Caenorhabditis Genetics Center (CGC) | C. elegans wild type (ancestral). | |
OP50 Escherichia coli | Caenorhabditis Genetics Center (CGC) | Biosafety Level: BSL-1. | |
OP50-1 Escherichia Coli | Caenorhabditis Genetics Center (CGC) | Streptomycin resistant strain of OP50. Biosafety Level: BSL-1. | |
Streptomycin sulfate salt | Sigma-Aldrich | S6501 | |
Printed Microscope Slides | Thermo Fisher Scientific | Gold Seal Fluorescent Antibody Microslides: 3032-002 | have two etched 10mm diameter circles delineated by white ceramic ink |
Nematode Growth Medium (NGM) | For 1L: 17g Agar, 3g NaCl, 2.5g Peptone, 1mL 1M CaCl2, 1mL 5mg/mL Cholesterol in ethanol, 25mL 1M KPO4 buffer, 1mL 1M MgSO4, H2O to 1 L. Sterilize by autoclaving. | Stiernagle, T. Maintenance of C. elegans. WormBook, 1-11, doi:10.1895/wormbook.1.101.1 (2006) | |
M9 buffer | For 1L: 3g KH2PO4, 6g Na2HPO4, 5g NaCl, 1mL 1 M MgSO4, H2O to 1 L. Sterilize by autoclaving. | Stiernagle, T. Maintenance of C. elegans. WormBook, 1-11, doi:10.1895/wormbook.1.101.1 (2006) | |
EQUIPMENT | |||
CeleST | Driscoll Lab, Rutgers University | C. elegans Swim Test | Open Source, see http://celestmod.github.io/CeleST/ and http://celest.mbb.rutgers.edu/ |
MATLAB | www.mathworks.com/downloads | MatLab version 2015b (best) | The CeleST version demonstrated here has best functionality with Mac OS 10.10 and MatLab 2015b. MATLAB 2015B introduced changes to how MATLAB handled graphics, including a new coding convention and syntax. These changes resolved an issue that couldn't be resolved elegantly (primarily because the internals of MATLAB really needed the major graphics overhaul implemented in MATLAB 2015B). For this reason, CeleST should always be run on MATLAB 2015B or later versions. However for users without access to MATLAB version 2015B or later (or MATLAB at all), we have created a CeleST program that doesn't need MATLAB on the computer at al. An installer is downloaded by the prospective user and then it installs itself onto the computer through a couple prompts like most programs. |
Mac OS | www.apple.com | Version 10.10 | Currently, CeleST has been ported to the major operating systems (Windows, Mac, and Linux). The current code can be run on any of the operating systems and there are versions for each operating system that don't even require users to have MATLAB to use CeleST (this version requires a large download). The Windows version has been tested the least and is most prone to bugs as such. Linux has been moderately tested. And Mac has been and continues to be tested extensively (primarily because it's the operating system in our lab). |
Stereomicroscope | Zeiss | Stemi 2000-C | |
Transmitted Light Base | Diagnostic Instruments | TLB 3.1 | |
Digital CCD Camera | QImaging | Rolera-XR Mono Fast 1394 (ROL-XR-F-M-12) | |
Digital Video Recording Software | Norpix | Streampix Version 3.17.2 |