הנדסה גנטית של שמרים לא קונבנציונליים עבור Biofuel מתחדשת והפקה ביוכימיים
Summary
We herein report methods on the molecular genetic manipulation of the Yarrowia lipolytica Po1g strain for improved gene deletion efficiency. The resulting engineered Y. lipolytica strains have potential applications in biofuel and biochemical production.
Abstract
Yarrowia lipolytica הוא מין שמרים שאינם פתוגניים, דימורפית ו אירובית בהחלט. בשל התכונות הפיזיולוגיות הייחודיות שלה מאפיינים מטבוליים, שמרים הלא השיגרתי הזה הוא לא רק מודל טוב ללימוד של הטבע הבסיסי של בידול פטרייתי אבל הוא גם פלטפורמה מיקרוביאלי מבטיחה לייצור ביוכימיים יישומים ביוטכנולוגיים שונים, הדורשים מניפולציות גנטיות נרחבות. עם זאת, מניפולציות גנטיות של י ' lipolytica היה מוגבל בשל העדר מערכת טרנספורמציה גנטית יעילה ויציבה כמו גם שיעור גבוה מאוד של רקומבינציה שאינו הומולוגי שניתן לייחס בעיקר גן KU70. כאן אנו מדווחים פרוטוקול קל ומהיר עבור השינוי הגנטי היעיל למחיקת גני י lipolytica Po1g. פרוטוקול ראשית, עבור השינוי היעיל של ה- DNA אקסוגני לתוך י ' lipolytica Po1g הוקמה. SecoND, כדי להשיג את השיעור ההומולוגי פעמים המוצלבות המשופר למחיקה נוספת של גני המטרה, גן KU70 נמחק על ידי הפיכת קלטת שיבוש נושאת 1 נשק הומולוגית kb. שלישית, כדי להדגים את יעילות מחיקת גן המשופרת לאחר המחיקה של גן KU70 מחקנו בנפרד 11 גני מטרת קידוד dehydrogenase אלכוהול מונואמין אלכוהול באמצעות אותם ההליכים על זן הפלטפורמה בנוקאאוט KU70. היה נראה כי השיעור הומולוגי מדויק גדילה בצורה ניכרת מפחות מ -0.5% למחיקה של גן KU70 ב Po1g ל -33% -71% עבור מחיקת הגן היחידה של 11 גני יעד Po1g KU70 Δ. פלסמיד בשכפול הדנ"א נושא את סמן התנגדות B hygromycin ומערכת Cre / LoxP נבנה, ואת גן סמן בחירה זני בנוקאאוט שמרים בסופו של דבר הוסר על ידי ביטוי של recombinase Cre כדי להקל סבבים רבים של targeמניפולציות גנטיות טד. מוטציות מחיקת גן יחיד וכתוצאה מכך יש יישומים פוטנציאליים דלק ביולוגי וייצור ביוכימיים.
Introduction
בניגוד שמר אפייה, Yarrowia lipolytica, גידול שמרים בלתי שיגרתי, יכול לגדול בצורה של שמרים או תפטיר בתגובה לשינויי 1,2 תנאים סביבתיים. לפיכך, שמרים דימורפית זה יכול לשמש כמודל טוב ללימוד של בידול פטרייתי, morphogenesis ו 3,4,5 הטקסונומיה. זה נחשב בדרך כלל כמין שמרים בטוח (GRAS), שנמצא בשימוש נרחב כדי לייצר מגוון רחב של תוספי מזון כגון חומצות אורגניות, polyalcohols, תרכובות הארומה, מתחלבים פעילי שטח 6,7,8,9. זהו aerobe מחייבים וכן שמרים oleaginous ידועים מסוגל צבירת שומנים באופן טבעי לסכומים גבוהים, כלומר, עד 70% של תא יבש משקל 10. זה גם יכול לנצל קשת רחבה של מקורות פחמן לצמיחה, כולל סוגים שונים של שאריות לבזבז משאבים כיסודות הזנה 11,12,13. כל תכונות ייחודיות אלה הופכים י lipolytica מאוד אטרקטיבי עבוריישומים ביוטכנולוגיים שונים.
למרות רצף הגנום כולו של י ' lipolytica כבר פורסם 14,15, מניפולציה גנטית של השמרים הלא השיגרתי הזה היא יותר מורכבת מאשר מיני שמרים אחרים. ראשית, טרנספורמציה של מינים שמרים זה הוא הרבה פחות יעיל בשל העדר של 16,17 מערכת טרנספורמציה גנטית יציב ויעיל. שנית, אינטגרציה הגנומי מייגעת של קלטות ביטוי ליניארי משמשת בדרך כלל את הביטוי של גנים של עניין כמו אין מערכת פלסמיד episomal הטבעי כבר נמצאה שמרים זה 18. שלישית, דור-outs הדפיקה הגנטי ולהפיל-ins מוגבל בגלל ההתמקדות בגנים יעילה באמצעות רקומבינציה הומולוגי מדויק בשמרים זה הנו נמוכים ביותר אירועי האינטגרציה להתרחש באמצעות הצטרפותו קצה שאינו הומולוגי (NHEJ) 19.
במחקר זה, אנו מדווחים על פרוטוקול טרנספורמציה אופטימיזציה עבור י lipolytica </em> זן Po1g, אשר קל, מהיר, יעיל לשחזור. כדי לשפר את התדירות הומולוגית מדויק, מחקנו את גן KU70, אשר מקודד אנזים מפתח בנתיב NHEJ. באמצעות פרוטוקול טרנספורמציה אופטימיזציה והפיכת קלטת בנוקאאוט ליניארי המכילה איגוף אזורי הומולוגיה של 1 קילו, גן KU70 של י ' lipolytica Po1g נמחק בהצלחה. חוסנו של המתודולוגיה המחיקה הגן הזה אז הודגם על ידי מיקוד dehydrogenase אלכוהול וגנים מונואמין אלכוהול זן Δ KU70 Po1g. היה נראה כי זן מחיקת KU70 הציג יעילות גבוהה באופן משמעותי של גן בתיווך הומולוגי מיקוד מזו של זן Po1g wild-type. בנוסף, פלסמיד ביטוי בשכפול הדנ"א Cre נושא את סמן התנגדות B hygromycin נבנה לבצע הצלת סמן. הצלת הסמן מקלה סבבים רבים של גן המיקוד ב הדואר המתקבל מוטנטים מחיקת גן. מלבד מחיקת גן, הפרוטוקול שלנו לטרנספורמציה הגנטי מחיקת גן המתואר כאן ניתן ליישם להכניס גני לוקוסים ספציפיים, וכדי להציג מוטציות ספציפיות לאתר לתוך י ' הגנום lipolytica.
Protocol
Representative Results
Discussion
המטרה שלנו עבור מחקר זה היא לאפשר לדור מהיר ויעיל של נוקאאוט גנטי ממוקד י lipolytica Po1g זן. מספר שיקולים צורך לטפל כדי להשיג זאת. ראשית, יעילות שינוי גבוה נדרשת. לפיכך, פרוטוקול טרנספורמציה כימית יעיל ונוח עבור י lipolytica Po1g זן תואר במחקר זה. השימוש-4000 PEG מהווה גו?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
אנו בתודה להכיר תמיכת המימון מהסוכנות להגנת הסביבה הלאומית של סינגפור (ETRP 1,201,102), תכנית המחקר התחרותית של הקרן הלאומית למחקר של סינגפור (NRF-CRP5-2009-03), הסוכנות למדע, טכנולוגיה ומחקר של סינגפור ( 1324004108), גלובל מו"פ פרויקט תכנית, משרד כלכלת ידע, הרפובליקה של קוריאה (N0000677), סוכנות הפחתת איום הביטחון (DTRA, HDTRA1-13-1-0037) ואת הביולוגיה הסינטתית היוזמת של האוניברסיטה הלאומית של סינגפור ( DPRT / 943/09/14).
Materials
| Reagent/Material | |||
| Oligonucleotide primers | Integrated DNA Technologies | 25 nmole DNA oligos | |
| Y. lipolytica strain Po1g | Yeastern Biotech | leucine auxotrophic derivative of the wild-type strain W29 (ATCC 20460) | |
| Vector pYLEX1 | Yeastern Biotech | FYY203-5MG | Y. lipolytica expression vector |
| E. coli TOP10 | Invitrogen | For cloning and propagation of plasmids | |
| pGEM-T vector | Promega | A3600 | TA cloning vector |
| QIAprep Spin Miniprep Kit | Qiagen | 27106 | For plasmid isolation |
| Wizard SV Gel and PCR Clean-Up System |
Promega | A9282 | Extract DNA fragments from agarose gels and purify PCR products from an amplification reaction |
| The iProof high-fidelity DNA polymerase |
Bio-Rad | 172-5302 | High-fidelity DNA polymerase |
| BamHI | New England Biolabs | R0136S | Restriction enzyme |
| BglII | New England Biolabs | R0144L | Restriction enzyme |
| KpnI | New England Biolabs | R0142S | Restriction enzyme |
| NdeI | New England Biolabs | R0111S | Restriction enzyme |
| NotI | New England Biolabs | R0189L | Restriction enzyme |
| PmlI | New England Biolabs | R0532S | Restriction enzyme |
| PstI | New England Biolabs | R0140S | Restriction enzyme |
| SacII | New England Biolabs | R0157S | Restriction enzyme |
| SalI | New England Biolabs | R0138S | Restriction enzyme |
| XhoI | New England Biolabs | R0146L | Restriction enzyme |
| T4 DNA ligase | New England Biolabs | M0202L | |
| Taq DNA polymerase | Bio-Rad | M0267L | |
| Ampicillin | Gibco-Life Technologies | 11593-027 | Antibiotics |
| Hygromycin B | PAA | P21-014 | Antibiotics |
| GeneRuler 1 kb DNA ladder | Thermo Scientific | SM0312 | 1 kb DNA ladder |
| PEG4000 | Sigma | 95904-F | |
| Tris | Promega | H5135 | |
| EDTA | Bio-Rad | 161-0729 | |
| Salmon Sperm DNA | Invitrogen | 15-632-011 | |
| Lithium Acetate | Sigma | ||
| Acetic acid | Sigma | ||
| Glass beads (425-600 µm) | Sigma | G8772 | |
| RNAse A | Thermo Scientific | EN0531 | |
| DNA Loading Dye | Thermo Scientific | R0611 | |
| Bacto Yeast Extract | BD | 212750 | |
| Bacto Peptone | BD | 211677 | |
| D-Glucose | 1st Base | BIO-1101 | |
| YNB without amino acids | Sigma | Y0626 | |
| DO Supplement-Leu | Clontech | 630414 | |
| Glycerol | Sigma | G5516 | |
| Difco LB Broth | BD | 244620 | |
| Difco LB Agar | BD | 244520 | |
| Bacto Agar | BD | 214010 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| PCR machine | Biorad | T100 Thermal Cycler | |
| Water bath | Memmert | WNB 14 | |
| Stationary/Shaking Incubator | Yihder | LM-570RD | |
| Thermo-shaker | Allsheng | MS-100 | |
| Micro centrifuge | Eppendorf | 5424R | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5810R | |
| Spectrophotometer | Eppendorf | BioPhotometer plus | |
| Gel imager | GE | Amersham Imager 600 | |
References
- Jiménez-Bremont, J. F., Rodrìguez-Hernández, A. A., Rodrìguez-Kessler, M., J, R. u. i. z. -. H. e. r. r. e. r. a. . Development and dimorphism of the yeast Yarrowia lipolytica. Dimorphic fungi: Their importance as models for differentiation and fungal pathogenesis. , 58-66 (2012).
- Coelho, M., Amaral, P., Belo, I., Méndez-Vilas, A. . Yarrowia lipolytica: an industrial workhorse. Current research, technology and education topics in applied microbiology and microbial biotechnology. , 930-940 (2010).
- Martinez-Vazquez, A., et al. Identification of the transcription factor Znc1p, which regulates the yeast-to-hypha transition in the dimorphic yeast Yarrowia lipolytica. Plos One. 8 (6), e66790 (2013).
- Richard, M., Quijano, R. R., Bezzate, S., Bordon-Pallier, F., Gaillardin, C. Tagging morphogenetic genes by insertional mutagenesis in the yeast Yarrowia lipolytica. J. Bacteriol. 183 (10), 3098-3107 (2001).
- Flores, C. L., Martìnez-Costa, O. H., Sánchez, V., Gancedo, C., Aragòn, J. J. The dimorphic yeast Yarrowia lipolytica possesses an atypical phosphofructokinase: characterization of the enzyme and its encoding gene. Microbiology. 151 (5), 1465-1474 (2005).
- Domìnguez, &. #. 1. 9. 3. ;., et al. Non-conventional yeasts as hosts for heterologous protein production. Int. Microbiol. 1 (2), 131-142 (1998).
- Zinjarde, S. S. Food-related applications of Yarrowia lipolytica. Food Chem. 152, 1-10 (2014).
- Finogenova, T., Morgunov, I., Kamzolova, S., Chernyavskaya, O. Organic acid production by the yeast Yarrowia lipolytica: a review of prospects. Appl. Biochem. Micro+. 41 (5), 418-425 (2005).
- Groguenin, A., et al. Genetic engineering of the β-oxidation pathway in the yeast Yarrowia lipolytica to increase the production of aroma compounds. J. Mol. Catal. B-Enzym. 28 (2), 75-79 (2004).
- Meng, X., et al. Biodiesel production from oleaginous microorganisms. Renew. Energ. 34 (1), 1-5 (2009).
- Papanikolaou, S., Aggelis, G. Lipid production by Yarrowia lipolytica growing on industrial glycerol in a single-stage continuous culture. Bioresource Technol. 82 (1), 43-49 (2002).
- Tai, M., Stephanopoulos, G. Engineering the push and pull of lipid biosynthesis in oleaginous yeast Yarrowia lipolytica for biofuel production. Metab. Eng. 15, 1-9 (2013).
- Liu, H. H., Ji, X. J., Huang, H. Biotechnological applications of Yarrowia lipolytica: Past, present and future. Biotechnol. Adv. 33 (8), 1522-1546 (2015).
- Liu, L., Alper, H. S. Draft genome sequence of the oleaginous yeast Yarrowia lipolytica PO1f, a commonly used metabolic engineering host. Genome Announc. 2 (4), e00652-e00614 (2014).
- Dujon, B., et al. Genome evolution in yeasts. Nature. 430 (6995), 35-44 (2004).
- Chen, D. C., Beckerich, J. M., Gaillardin, C. One-step transformation of the dimorphic yeast Yarrowia lipolytica. Appl. Microbial. Biotechnol. 48 (2), 232-235 (1997).
- Wang, J. H., Hung, W., Tsai, S. H. High efficiency transformation by electroporation of Yarrowia lipolytica. J. Microbiol. 49 (3), 469-472 (2011).
- Matsuoka, M., et al. Analysis of regions essential for the function of chromosomal replicator sequences from Yarrowia lipolytica. Mol. Gen. Genet. 237 (3), 327-333 (1993).
- Kretzschmar, A., et al. Increased homologous integration frequency in Yarrowia lipolytica strains defective in non-homologous end-joining. Curr. Genet. 59 (1-2), 63-72 (2013).
- Lorenz, T. C. Polymerase Chain Reaction: Basic Protocol Plus Troubleshooting and Optimization Strategies. J. Vis. Exp. (63), e3998 (2012).
- Kobs, G. Cloning blunt-end DNA fragments into the pGEM-T Vector Systems. Promega Notes. 62, 15-18 (1997).
- Sanders, E. R. Aseptic laboratory techniques: plating methods. J. Vis. Exp. (63), e3064 (2012).
- Hegemann, J. H., Heick, S. B. Delete and repeat: a comprehensive toolkit for sequential gene knockout in the budding yeast Saccharomyces cerevisiae. Methods Mol. Biol. 765, 189-206 (2011).
- Yamane, T., Sakai, H., Nagahama, K., Ogawa, T., Matsuoka, M. Dissection of centromeric DNA from yeast Yarrowia lipolytica and identification of protein-binding site required for plasmid transmission. J. Biosci. Bioeng. 105 (6), 571-578 (2008).
- McGinnis, S., Madden, T. L. BLAST: at the core of a powerful and diverse set of sequence analysis tools. Nucleic Acids Res. 32 ((Web Server issue)), W20-W25 (2004).
- Madzak, C., Tréton, B., Blanchin-Roland, S. Strong hybrid promoters and integrative expression/secretion vectors for quasi-constitutive expression of heterologous proteins in the yeast Yarrowia lipolytica. J. Mol. Microbiol. Biotechnol. 2 (2), 207-216 (2000).
- Nicaud, J. M., Le Clainche, A., Le Dall, M. T., Wang, H., Gaillardin, C. Yarrowia lipolytica, a yeast model for the genetic studies of hydroxy fatty acids biotransformation into lactones. J. Mol. Catal. B-Enzym. 5 (1), 175-181 (1998).
