Génie génétique d'une levure Unconventional for Renewable Biofuel and Production Biochemical
Summary
We herein report methods on the molecular genetic manipulation of the Yarrowia lipolytica Po1g strain for improved gene deletion efficiency. The resulting engineered Y. lipolytica strains have potential applications in biofuel and biochemical production.
Abstract
Yarrowia lipolytica est une espèce de levure non pathogènes, dimorphes et strictement aérobies. En raison de ses caractéristiques physiologiques distinctifs et caractéristiques métaboliques, cette levure non conventionnelle est non seulement un bon modèle pour l'étude de la nature fondamentale de la différenciation fongique, mais est également une plate-forme microbienne prometteuse pour la production biochimique et diverses applications biotechnologiques, qui nécessitent de nombreuses manipulations génétiques. Cependant, les manipulations génétiques de Y. lipolytica ont été limités en raison de l'absence d'un système de transformation génétique efficace et stable, ainsi que des taux très élevés de recombinaison non homologue qui peut être principalement attribuée au gène KU70. Nous rapportons ici un protocole simple et rapide pour la transformation génétique efficace et pour la suppression du gène en Y. lipolytica Po1g. Tout d' abord, un protocole pour la transformation efficace de l' ADN exogène dans Y. lipolytica Po1g a été créé. Second, pour atteindre le double croisement taux de recombinaison homologue amélioré pour deletion supplémentaire de gènes cibles, le gène KU70 a été supprimée par la transformation d' une cassette de disruption 1 kb portant homologie bras. Troisièmement, mettre en évidence le gène suppression efficacité accrue après la suppression du gène KU70, nous avons supprimé individuellement 11 gènes cibles codant pour l' alcool déshydrogénase et l' alcool oxydase en utilisant les mêmes procédures sur la souche KU70 de plate – forme de KO. On a observé que le taux de recombinaison homologue précise sensiblement augmenté de moins de 0,5% pour la suppression du gène dans KU70 Po1g à 33% -71% pour la suppression d' un gène unique des 11 gènes cibles dans KU70 Po1g Δ. Un plasmide réplicatif portant le marqueur de résistance à l'hygromycine B et le système Cre / loxP a été construit et le gène marqueur de sélection dans les souches de levure knock-out a finalement été éliminé par l'expression de la recombinase Cre pour faciliter des cycles multiples de targemanipulations génétiques ted. Les mutants de délétion d'un gène unique résultant ont des applications potentielles dans les biocarburants et la production biochimique.
Introduction
Contrairement à Saccharomyces cerevisiae, Yarrowia lipolytica, une levure non conventionnelle, peut se développer sous la forme de levure ou mycélium en réponse aux changements des conditions environnementales 1,2. Ainsi, cette levure dimorphique peut être utilisé comme un bon modèle pour l'étude de la différenciation fongique, la morphogenèse et la taxonomie 3,4,5. Il est généralement considéré comme un coffre – fort (GRAS) des espèces de levures, qui est largement utilisé pour produire une variété d'additifs alimentaires , tels que des acides organiques, des polyalcools, des composés aromatiques, des émulsifiants et des agents tensio – actifs 6,7,8,9. Il est un aérobique de obligatoire et une levure oléagineuse bien connu capable d'accumuler naturellement les lipides à des quantités élevées, soit jusqu'à 70% de poids sec des cellules 10. Elle peut aussi utiliser un large éventail de sources de carbone pour la croissance, y compris les différents types de résidus dans le gaspillage de ressources que les nutriments 11,12,13. Toutes ces caractéristiques uniques font Y. lipolytica très attractif pour lesdiverses applications biotechnologiques.
Bien que la totalité de la séquence du génome de Y. lipolytica a été publiée 14,15, manipulation génétique de cette levure non conventionnelle est plus complexe que d' autres espèces de levure. Tout d' abord, la transformation de cette espèce de levure est beaucoup moins efficace en raison de l'absence d'un système de transformation génétique 16,17 stable et efficace. En second lieu , l' intégration génomique laborieuse des cassettes d'expression linéaires est couramment utilisé pour l'expression de gènes d'intérêt car aucun système de plasmide épisomique naturel a été trouvée dans cette levure 18. Troisièmement, la génération de knock-outs génétiques et knock-ins sont limitées parce que le gène efficacité du ciblage par recombinaison homologue précis dans cette levure est faible et la plupart des événements d'intégration se produit à travers l' extrémité non homologue de jonction (NHEJ) 19.
Dans cette étude, nous présentons un protocole de transformation optimisée pour Y. lipolytica </em> souche Po1g, ce qui est facile, rapide, efficace et reproductible. Pour améliorer la fréquence de recombinaison homologue précise, nous avons supprimé le gène KU70, qui code pour une enzyme clé dans la voie NHEJ. En utilisant le protocole de transformation optimisée et la transformation d' une cassette de knock-out linéaire contenant flanquant régions d'homologie de 1 kb du gène de la KU70 Y. lipolytica Po1g a été supprimé. La robustesse de cette méthode de suppression du gène a ensuite été démontrée en ciblant l' alcool déshydrogénase et les gènes de l' alcool oxydase dans la souche Po1g KU70 Δ. On a observé que la souche de deletion KU70 présentait une efficacité nettement plus élevée du gène de la recombinaison médiée par ciblage homologue à celle de la souche Po1g de type sauvage. En outre, une expression réplicatif Cre plasmide portant le marqueur de résistance à l'hygromycine B a été construit pour réaliser le marqueur de sauvetage. Le sauvetage de marqueur facilite plusieurs tours de ciblage de gènes dans ee a obtenu des mutants de deletion de gène. En plus de la suppression des gènes, notre protocole pour la transformation génétique et la suppression du gène décrit ici peut être utilisé pour insérer des gènes à des loci spécifiques et d'introduire des mutations spécifiques au site en Y. lipolytica génome.
Protocol
Representative Results
Discussion
Notre objectif pour cette étude est de permettre la génération rapide et efficace de KO de gènes ciblés dans le Y. lipolytica souche Po1g. Plusieurs considérations doivent être abordées pour atteindre cet objectif. Tout d'abord, une grande efficacité de transformation est nécessaire. Ainsi, un protocole de transformation chimique efficace et commode pour le Y. souche lipolytica Po1g a été décrite dans cette étude. L'utilisation de PEG-4000 est un facteur critique…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Nous reconnaissons avec gratitude le soutien financier de l'Agence nationale de l'environnement de Singapour (ETRP 1.201.102), le Programme de recherche concurrentielle de la National Research Foundation de Singapour (NRF-CRP5-2009-03), l'Agence pour la science, la technologie et la recherche de Singapour ( 1324004108), global R & D Program Project, le Ministère de l'économie du savoir, la République de Corée (N0000677), la Defense Threat Reduction Agency (DTRA, HDTRA1-13-1-0037) et la biologie synthétique Initiative de l'Université nationale de Singapour ( DPRT / 943/09/14).
Materials
| Reagent/Material | |||
| Oligonucleotide primers | Integrated DNA Technologies | 25 nmole DNA oligos | |
| Y. lipolytica strain Po1g | Yeastern Biotech | leucine auxotrophic derivative of the wild-type strain W29 (ATCC 20460) | |
| Vector pYLEX1 | Yeastern Biotech | FYY203-5MG | Y. lipolytica expression vector |
| E. coli TOP10 | Invitrogen | For cloning and propagation of plasmids | |
| pGEM-T vector | Promega | A3600 | TA cloning vector |
| QIAprep Spin Miniprep Kit | Qiagen | 27106 | For plasmid isolation |
| Wizard SV Gel and PCR Clean-Up System |
Promega | A9282 | Extract DNA fragments from agarose gels and purify PCR products from an amplification reaction |
| The iProof high-fidelity DNA polymerase |
Bio-Rad | 172-5302 | High-fidelity DNA polymerase |
| BamHI | New England Biolabs | R0136S | Restriction enzyme |
| BglII | New England Biolabs | R0144L | Restriction enzyme |
| KpnI | New England Biolabs | R0142S | Restriction enzyme |
| NdeI | New England Biolabs | R0111S | Restriction enzyme |
| NotI | New England Biolabs | R0189L | Restriction enzyme |
| PmlI | New England Biolabs | R0532S | Restriction enzyme |
| PstI | New England Biolabs | R0140S | Restriction enzyme |
| SacII | New England Biolabs | R0157S | Restriction enzyme |
| SalI | New England Biolabs | R0138S | Restriction enzyme |
| XhoI | New England Biolabs | R0146L | Restriction enzyme |
| T4 DNA ligase | New England Biolabs | M0202L | |
| Taq DNA polymerase | Bio-Rad | M0267L | |
| Ampicillin | Gibco-Life Technologies | 11593-027 | Antibiotics |
| Hygromycin B | PAA | P21-014 | Antibiotics |
| GeneRuler 1 kb DNA ladder | Thermo Scientific | SM0312 | 1 kb DNA ladder |
| PEG4000 | Sigma | 95904-F | |
| Tris | Promega | H5135 | |
| EDTA | Bio-Rad | 161-0729 | |
| Salmon Sperm DNA | Invitrogen | 15-632-011 | |
| Lithium Acetate | Sigma | ||
| Acetic acid | Sigma | ||
| Glass beads (425-600 µm) | Sigma | G8772 | |
| RNAse A | Thermo Scientific | EN0531 | |
| DNA Loading Dye | Thermo Scientific | R0611 | |
| Bacto Yeast Extract | BD | 212750 | |
| Bacto Peptone | BD | 211677 | |
| D-Glucose | 1st Base | BIO-1101 | |
| YNB without amino acids | Sigma | Y0626 | |
| DO Supplement-Leu | Clontech | 630414 | |
| Glycerol | Sigma | G5516 | |
| Difco LB Broth | BD | 244620 | |
| Difco LB Agar | BD | 244520 | |
| Bacto Agar | BD | 214010 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| PCR machine | Biorad | T100 Thermal Cycler | |
| Water bath | Memmert | WNB 14 | |
| Stationary/Shaking Incubator | Yihder | LM-570RD | |
| Thermo-shaker | Allsheng | MS-100 | |
| Micro centrifuge | Eppendorf | 5424R | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5810R | |
| Spectrophotometer | Eppendorf | BioPhotometer plus | |
| Gel imager | GE | Amersham Imager 600 | |
References
- Jiménez-Bremont, J. F., Rodrìguez-Hernández, A. A., Rodrìguez-Kessler, M., J, R. u. i. z. -. H. e. r. r. e. r. a. . Development and dimorphism of the yeast Yarrowia lipolytica. Dimorphic fungi: Their importance as models for differentiation and fungal pathogenesis. , 58-66 (2012).
- Coelho, M., Amaral, P., Belo, I., Méndez-Vilas, A. . Yarrowia lipolytica: an industrial workhorse. Current research, technology and education topics in applied microbiology and microbial biotechnology. , 930-940 (2010).
- Martinez-Vazquez, A., et al. Identification of the transcription factor Znc1p, which regulates the yeast-to-hypha transition in the dimorphic yeast Yarrowia lipolytica. Plos One. 8 (6), e66790 (2013).
- Richard, M., Quijano, R. R., Bezzate, S., Bordon-Pallier, F., Gaillardin, C. Tagging morphogenetic genes by insertional mutagenesis in the yeast Yarrowia lipolytica. J. Bacteriol. 183 (10), 3098-3107 (2001).
- Flores, C. L., Martìnez-Costa, O. H., Sánchez, V., Gancedo, C., Aragòn, J. J. The dimorphic yeast Yarrowia lipolytica possesses an atypical phosphofructokinase: characterization of the enzyme and its encoding gene. Microbiology. 151 (5), 1465-1474 (2005).
- Domìnguez, &. #. 1. 9. 3. ;., et al. Non-conventional yeasts as hosts for heterologous protein production. Int. Microbiol. 1 (2), 131-142 (1998).
- Zinjarde, S. S. Food-related applications of Yarrowia lipolytica. Food Chem. 152, 1-10 (2014).
- Finogenova, T., Morgunov, I., Kamzolova, S., Chernyavskaya, O. Organic acid production by the yeast Yarrowia lipolytica: a review of prospects. Appl. Biochem. Micro+. 41 (5), 418-425 (2005).
- Groguenin, A., et al. Genetic engineering of the β-oxidation pathway in the yeast Yarrowia lipolytica to increase the production of aroma compounds. J. Mol. Catal. B-Enzym. 28 (2), 75-79 (2004).
- Meng, X., et al. Biodiesel production from oleaginous microorganisms. Renew. Energ. 34 (1), 1-5 (2009).
- Papanikolaou, S., Aggelis, G. Lipid production by Yarrowia lipolytica growing on industrial glycerol in a single-stage continuous culture. Bioresource Technol. 82 (1), 43-49 (2002).
- Tai, M., Stephanopoulos, G. Engineering the push and pull of lipid biosynthesis in oleaginous yeast Yarrowia lipolytica for biofuel production. Metab. Eng. 15, 1-9 (2013).
- Liu, H. H., Ji, X. J., Huang, H. Biotechnological applications of Yarrowia lipolytica: Past, present and future. Biotechnol. Adv. 33 (8), 1522-1546 (2015).
- Liu, L., Alper, H. S. Draft genome sequence of the oleaginous yeast Yarrowia lipolytica PO1f, a commonly used metabolic engineering host. Genome Announc. 2 (4), e00652-e00614 (2014).
- Dujon, B., et al. Genome evolution in yeasts. Nature. 430 (6995), 35-44 (2004).
- Chen, D. C., Beckerich, J. M., Gaillardin, C. One-step transformation of the dimorphic yeast Yarrowia lipolytica. Appl. Microbial. Biotechnol. 48 (2), 232-235 (1997).
- Wang, J. H., Hung, W., Tsai, S. H. High efficiency transformation by electroporation of Yarrowia lipolytica. J. Microbiol. 49 (3), 469-472 (2011).
- Matsuoka, M., et al. Analysis of regions essential for the function of chromosomal replicator sequences from Yarrowia lipolytica. Mol. Gen. Genet. 237 (3), 327-333 (1993).
- Kretzschmar, A., et al. Increased homologous integration frequency in Yarrowia lipolytica strains defective in non-homologous end-joining. Curr. Genet. 59 (1-2), 63-72 (2013).
- Lorenz, T. C. Polymerase Chain Reaction: Basic Protocol Plus Troubleshooting and Optimization Strategies. J. Vis. Exp. (63), e3998 (2012).
- Kobs, G. Cloning blunt-end DNA fragments into the pGEM-T Vector Systems. Promega Notes. 62, 15-18 (1997).
- Sanders, E. R. Aseptic laboratory techniques: plating methods. J. Vis. Exp. (63), e3064 (2012).
- Hegemann, J. H., Heick, S. B. Delete and repeat: a comprehensive toolkit for sequential gene knockout in the budding yeast Saccharomyces cerevisiae. Methods Mol. Biol. 765, 189-206 (2011).
- Yamane, T., Sakai, H., Nagahama, K., Ogawa, T., Matsuoka, M. Dissection of centromeric DNA from yeast Yarrowia lipolytica and identification of protein-binding site required for plasmid transmission. J. Biosci. Bioeng. 105 (6), 571-578 (2008).
- McGinnis, S., Madden, T. L. BLAST: at the core of a powerful and diverse set of sequence analysis tools. Nucleic Acids Res. 32 ((Web Server issue)), W20-W25 (2004).
- Madzak, C., Tréton, B., Blanchin-Roland, S. Strong hybrid promoters and integrative expression/secretion vectors for quasi-constitutive expression of heterologous proteins in the yeast Yarrowia lipolytica. J. Mol. Microbiol. Biotechnol. 2 (2), 207-216 (2000).
- Nicaud, J. M., Le Clainche, A., Le Dall, M. T., Wang, H., Gaillardin, C. Yarrowia lipolytica, a yeast model for the genetic studies of hydroxy fatty acids biotransformation into lactones. J. Mol. Catal. B-Enzym. 5 (1), 175-181 (1998).
