Summary

Генетическая инженерия нетрадиционный дрожжей по возобновляемым источникам биотоплива и биохимической производства

Published: September 20, 2016
doi:

Summary

We herein report methods on the molecular genetic manipulation of the Yarrowia lipolytica Po1g strain for improved gene deletion efficiency. The resulting engineered Y. lipolytica strains have potential applications in biofuel and biochemical production.

Abstract

Yarrowia lipolytica является непатогенные, диморфные и строго аэробные виды дрожжей. Благодаря своим отличительным физиологических особенностей и метаболических характеристик, этот нетрадиционный дрожжей является не только хорошей моделью для изучения фундаментальной природы грибковой дифференциации, но и является перспективным микробная платформой для биохимического производства и различных биотехнологических применений, требующих обширных генетических манипуляций. Тем не менее, генетические манипуляции Y. lipolytica были ограничены в связи с отсутствием эффективной и стабильной генетической трансформации системы, а также очень высокие показатели не-гомологичной рекомбинации , которые могут быть в основном отнесены к гену Ku70. Здесь мы сообщаем простой и быстрый протокол для эффективной генетической трансформации и делеции гена в Y. lipolytica Po1g. Во- первых, это протокол для эффективной трансформации экзогенной ДНК в Y. lipolytica Po1g был создан. Secoго, для достижения повышенной скорости гомологичной рекомбинации двойной кроссовер для дальнейшего удаления генов – мишеней, ген Ku70 был удален путем преобразования кассеты с разрывом , несущий 1 кб гомологий руки. В- третьих, чтобы продемонстрировать эффективность повышенную делеции гена после удаления гена Ku70, мы индивидуально удалены 11 целевых генов , кодирующих алкогольдегидрогеназы и алкогольоксидазы , используя те же процедуры на штамм Ku70 Нокаут платформы. Было отмечено, что скорость точной гомологической рекомбинации существенно увеличилась с менее чем 0,5%, для удаления гена Ku70 в Po1g до 33% -71% для одного делеции гена из 11 генов – мишеней в Po1g Ku70 А. Репликативной плазмиду, несущую маркер устойчивости к гигромицину B и система Cre / LoxP была построена, и ген селекции маркера в штаммах дрожжей нокаутных был в конечном счете удалены путем экспрессии Cre рекомбиназой для облегчения проведения множества раундов щитомTed генетические манипуляции. Полученные мутанты с делецией одного гена имеют потенциальное применение в биотопливе и биохимического производства.

Introduction

В отличие от Saccharomyces CEREVISIAE, Yarrowia lipolytica, нетрадиционным дрожжей, может расти в виде дрожжей или мицелия в ответ на изменения условий окружающей среды 1,2. Таким образом, этот диморфизм дрожжи могут быть использованы в качестве хорошей модели для изучения грибкового дифференцировки, формообразования и систематики 3,4,5. Это , как правило , считается безопасным (GRAS) видов дрожжей, которые широко используются для производства различных пищевых добавок , таких как органические кислоты, многоатомные, ароматические соединения, эмульгаторы и поверхностно -активные вещества 6,7,8,9. Это облигатные аэробной и хорошо известный маслянистую дрожжи способны естественным образом накапливать липиды в больших количествах, то есть, вплоть до 70% от сухого веса 10 клеток. Он также может использовать широкий спектр источников углерода для роста, в том числе различные виды остатков в ресурсах отходов в качестве питательных веществ , 11,12,13. Все эти уникальные особенности делают Y. lipolytica очень привлекательным дляразличные биотехнологические приложения.

Несмотря на то, всю последовательность генома Y. lipolytica опубликованных 14,15, генетические манипуляции этого нетрадиционного дрожжей является более сложным , чем у других видов дрожжей. Во- первых, преобразование этих дрожжей вида значительно менее эффективен из – за отсутствия стабильной и эффективной генетической трансформации системы 16,17. Во- вторых, кропотливое геномная интегрирование линейных кассет экспрессии обычно используется для экспрессии генов , представляющих интерес , как ни одна система плазмида природные эписомная не найдено в этих дрожжей 18. В- третьих, поколение генетических нокауты и постучать модули ограничены , потому что ген ориентации эффективность с помощью точной гомологичной рекомбинации в этих дрожжей является низким , и большинство событий интеграции происходят через негомологичной конец соединительной (NHEJ) 19.

В данном исследовании мы сообщаем оптимизированный протокол преобразования для Y. lipolytica </EM> Po1g штамм, который легко, быстро, эффективно и воспроизводимым. Для повышения частоты точной гомологической рекомбинации, мы удалили ген Ku70, который кодирует ключевой фермент в пути NHEJ. Используя оптимизированный протокол преобразования и преобразования линейного нокаутирующий кассету , содержащую фланговые области гомологии в 1 кб, ген Ku70 из Y. lipolytica Po1g был успешно удален. Надежность этой методики удаления гена затем продемонстрирована путем пристреливать алкогольдегидрогеназы и гены алкогольоксидазы в штамм Po1g Ku70 Д. Было отмечено , что удаление штамма Ku70 проявляли значительно более высокую эффективность гомологичной рекомбинации генов-опосредованной ориентации , чем у дикого типа Po1g штамма. Кроме того, замещающий Плазмиду экспрессии Cre несущий маркер устойчивости к гигромицину B был построен для выполнения маркера спасение. Маркер спасательных облегчает несколько раундов гена адресности-гое получены мутанты делеции гена. Помимо делеции гена, наш протокол для генетической трансформации и делеции гена , описанного здесь , могут быть применены для вставки генов в специфические локусы, а также ввести сайт-специфические мутации в Y. lipolytica генома.

Protocol

1. Генерация Y. lipolytica Ku70 Удаление Штамм Строительство кассеты с разрывом Примечание: смотри таблицу 1 для всех используемых праймеров в полимеразной цепной реакции (ПЦР) усилений. Дизайн праймеров 20 для ПЦР – амплификации экспрессии LEU2 кассету …

Representative Results

Линеаризованная Ю.В. Выражение lipolytica вектор был вставлен в док – платформу PBR в геноме Y. lipolytica штамм Po1g путем выполнения одной рекомбинации кроссовера 27. Используя быструю процедуру химического превращения , установленный в данном исследовании, ли?…

Discussion

Наша цель данного исследования заключается в обеспечении быстрого и эффективного формирования целевых нокауты генов в Y. lipolytica Po1g штамм. Несколько соображений необходимо решить для достижения этой цели. Во-первых, требуется высокая эффективность преобразования. Таким образ?…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Мы выражаем глубокую признательность за финансовую поддержку со стороны Национального агентства по окружающей среде Сингапура (ПОПК 1201102), Конкурентный Программа исследований Национального исследовательского фонда Сингапура (NRF-CRP5-2009-03), Агентства по науке, технологиям и исследованиям Сингапура ( 1324004108), Global R & D Программа проекта, Министерство экономики знаний, Республика Корея (N0000677), Агентство по уменьшению угрозы обороны (DTRA, HDTRA1-13-1-0037) и Синтетическая биология Инициатива Национального университета Сингапура ( DPRT / 943/09/14).

Materials

Reagent/Material
Oligonucleotide primers Integrated DNA Technologies 25 nmole  DNA oligos
Y. lipolytica strain Po1g Yeastern Biotech leucine auxotrophic derivative of the wild-type strain W29 (ATCC 20460)
Vector pYLEX1 Yeastern Biotech FYY203-5MG Y. lipolytica expression vector 
E. coli TOP10  Invitrogen For cloning and propagation of plasmids
pGEM-T vector  Promega A3600 TA cloning vector
QIAprep Spin Miniprep Kit Qiagen 27106 For plasmid isolation
Wizard SV Gel and
PCR Clean-Up System
Promega A9282 Extract DNA fragments from agarose gels
and purify PCR products from an amplification reaction
The iProof high-fidelity
DNA polymerase
Bio-Rad 172-5302 High-fidelity DNA polymerase
BamHI  New England Biolabs R0136S Restriction enzyme
BglII  New England Biolabs R0144L Restriction enzyme
KpnI New England Biolabs R0142S Restriction enzyme
NdeI  New England Biolabs R0111S Restriction enzyme
NotI New England Biolabs R0189L Restriction enzyme
PmlI New England Biolabs R0532S Restriction enzyme
PstI  New England Biolabs R0140S Restriction enzyme
SacII New England Biolabs R0157S Restriction enzyme
SalI New England Biolabs R0138S Restriction enzyme
XhoI New England Biolabs R0146L Restriction enzyme
T4 DNA ligase New England Biolabs M0202L
Taq DNA polymerase  Bio-Rad M0267L
Ampicillin Gibco-Life Technologies 11593-027 Antibiotics
Hygromycin B PAA P21-014 Antibiotics
GeneRuler 1 kb DNA ladder Thermo Scientific SM0312 1 kb DNA ladder
PEG4000 Sigma 95904-F
Tris Promega H5135
EDTA Bio-Rad 161-0729
Salmon Sperm DNA Invitrogen 15-632-011
Lithium Acetate Sigma
Acetic acid Sigma
Glass beads (425-600 µm) Sigma G8772
RNAse A Thermo Scientific EN0531
DNA Loading Dye Thermo Scientific R0611
Bacto Yeast Extract BD 212750
Bacto Peptone BD 211677
D-Glucose 1st Base BIO-1101
YNB without amino acids Sigma Y0626
DO Supplement-Leu Clontech 630414
Glycerol Sigma G5516
Difco LB Broth BD 244620
Difco LB Agar BD 244520
Bacto Agar BD 214010
Name Company Catalog Number Comments
Equipment
PCR machine Biorad T100 Thermal Cycler
Water bath Memmert WNB 14
Stationary/Shaking Incubator Yihder LM-570RD
Thermo-shaker Allsheng MS-100
Micro centrifuge Eppendorf 5424R
Centrifuge Eppendorf 5810R
Spectrophotometer Eppendorf  BioPhotometer plus
Gel imager GE Amersham Imager 600

References

  1. Jiménez-Bremont, J. F., Rodrìguez-Hernández, A. A., Rodrìguez-Kessler, M., J, R. u. i. z. -. H. e. r. r. e. r. a. . Development and dimorphism of the yeast Yarrowia lipolytica. Dimorphic fungi: Their importance as models for differentiation and fungal pathogenesis. , 58-66 (2012).
  2. Coelho, M., Amaral, P., Belo, I., Méndez-Vilas, A. . Yarrowia lipolytica: an industrial workhorse. Current research, technology and education topics in applied microbiology and microbial biotechnology. , 930-940 (2010).
  3. Martinez-Vazquez, A., et al. Identification of the transcription factor Znc1p, which regulates the yeast-to-hypha transition in the dimorphic yeast Yarrowia lipolytica. Plos One. 8 (6), e66790 (2013).
  4. Richard, M., Quijano, R. R., Bezzate, S., Bordon-Pallier, F., Gaillardin, C. Tagging morphogenetic genes by insertional mutagenesis in the yeast Yarrowia lipolytica. J. Bacteriol. 183 (10), 3098-3107 (2001).
  5. Flores, C. L., Martìnez-Costa, O. H., Sánchez, V., Gancedo, C., Aragòn, J. J. The dimorphic yeast Yarrowia lipolytica possesses an atypical phosphofructokinase: characterization of the enzyme and its encoding gene. Microbiology. 151 (5), 1465-1474 (2005).
  6. Domìnguez, &. #. 1. 9. 3. ;., et al. Non-conventional yeasts as hosts for heterologous protein production. Int. Microbiol. 1 (2), 131-142 (1998).
  7. Zinjarde, S. S. Food-related applications of Yarrowia lipolytica. Food Chem. 152, 1-10 (2014).
  8. Finogenova, T., Morgunov, I., Kamzolova, S., Chernyavskaya, O. Organic acid production by the yeast Yarrowia lipolytica: a review of prospects. Appl. Biochem. Micro+. 41 (5), 418-425 (2005).
  9. Groguenin, A., et al. Genetic engineering of the β-oxidation pathway in the yeast Yarrowia lipolytica to increase the production of aroma compounds. J. Mol. Catal. B-Enzym. 28 (2), 75-79 (2004).
  10. Meng, X., et al. Biodiesel production from oleaginous microorganisms. Renew. Energ. 34 (1), 1-5 (2009).
  11. Papanikolaou, S., Aggelis, G. Lipid production by Yarrowia lipolytica growing on industrial glycerol in a single-stage continuous culture. Bioresource Technol. 82 (1), 43-49 (2002).
  12. Tai, M., Stephanopoulos, G. Engineering the push and pull of lipid biosynthesis in oleaginous yeast Yarrowia lipolytica for biofuel production. Metab. Eng. 15, 1-9 (2013).
  13. Liu, H. H., Ji, X. J., Huang, H. Biotechnological applications of Yarrowia lipolytica: Past, present and future. Biotechnol. Adv. 33 (8), 1522-1546 (2015).
  14. Liu, L., Alper, H. S. Draft genome sequence of the oleaginous yeast Yarrowia lipolytica PO1f, a commonly used metabolic engineering host. Genome Announc. 2 (4), e00652-e00614 (2014).
  15. Dujon, B., et al. Genome evolution in yeasts. Nature. 430 (6995), 35-44 (2004).
  16. Chen, D. C., Beckerich, J. M., Gaillardin, C. One-step transformation of the dimorphic yeast Yarrowia lipolytica. Appl. Microbial. Biotechnol. 48 (2), 232-235 (1997).
  17. Wang, J. H., Hung, W., Tsai, S. H. High efficiency transformation by electroporation of Yarrowia lipolytica. J. Microbiol. 49 (3), 469-472 (2011).
  18. Matsuoka, M., et al. Analysis of regions essential for the function of chromosomal replicator sequences from Yarrowia lipolytica. Mol. Gen. Genet. 237 (3), 327-333 (1993).
  19. Kretzschmar, A., et al. Increased homologous integration frequency in Yarrowia lipolytica strains defective in non-homologous end-joining. Curr. Genet. 59 (1-2), 63-72 (2013).
  20. Lorenz, T. C. Polymerase Chain Reaction: Basic Protocol Plus Troubleshooting and Optimization Strategies. J. Vis. Exp. (63), e3998 (2012).
  21. Kobs, G. Cloning blunt-end DNA fragments into the pGEM-T Vector Systems. Promega Notes. 62, 15-18 (1997).
  22. Sanders, E. R. Aseptic laboratory techniques: plating methods. J. Vis. Exp. (63), e3064 (2012).
  23. Hegemann, J. H., Heick, S. B. Delete and repeat: a comprehensive toolkit for sequential gene knockout in the budding yeast Saccharomyces cerevisiae. Methods Mol. Biol. 765, 189-206 (2011).
  24. Yamane, T., Sakai, H., Nagahama, K., Ogawa, T., Matsuoka, M. Dissection of centromeric DNA from yeast Yarrowia lipolytica and identification of protein-binding site required for plasmid transmission. J. Biosci. Bioeng. 105 (6), 571-578 (2008).
  25. McGinnis, S., Madden, T. L. BLAST: at the core of a powerful and diverse set of sequence analysis tools. Nucleic Acids Res. 32 ((Web Server issue)), W20-W25 (2004).
  26. Madzak, C., Tréton, B., Blanchin-Roland, S. Strong hybrid promoters and integrative expression/secretion vectors for quasi-constitutive expression of heterologous proteins in the yeast Yarrowia lipolytica. J. Mol. Microbiol. Biotechnol. 2 (2), 207-216 (2000).
  27. Nicaud, J. M., Le Clainche, A., Le Dall, M. T., Wang, H., Gaillardin, C. Yarrowia lipolytica, a yeast model for the genetic studies of hydroxy fatty acids biotransformation into lactones. J. Mol. Catal. B-Enzym. 5 (1), 175-181 (1998).

Play Video

Cite This Article
Yu, A., Pratomo, N., Ng, T., Ling, H., Cho, H., Leong, S. S. J., Chang, M. W. Genetic Engineering of an Unconventional Yeast for Renewable Biofuel and Biochemical Production. J. Vis. Exp. (115), e54371, doi:10.3791/54371 (2016).

View Video