الهندسة الوراثية من الخميرة غير تقليدية للالمتجددة الوقود الحيوي وإنتاج البيوكيميائية
Summary
We herein report methods on the molecular genetic manipulation of the Yarrowia lipolytica Po1g strain for improved gene deletion efficiency. The resulting engineered Y. lipolytica strains have potential applications in biofuel and biochemical production.
Abstract
Yarrowia lipolytica هو غير المسببة للأمراض، ديمبرافيك والهوائية بدقة أنواع من الخميرة. ونظرا لميزاته الفسيولوجية وخصائص التمثيل الغذائي، وهذا الخميرة غير تقليدية ليست سوى نموذج جيد لدراسة الطبيعة الأساسية للتمايز الفطرية ولكن هي أيضا منصة الميكروبية واعدة للإنتاج والكيمياء الحيوية ومختلف تطبيقات التكنولوجيا الحيوية، والتي تتطلب التلاعب الجيني واسعة النطاق. ومع ذلك، التلاعب الجيني من Y. وقد lipolytica محدود نظرا لعدم وجود نظام التحول الجيني فعال ومستقر وكذلك معدلات عالية جدا من إعادة التركيب غير المتجانس التي يمكن أن تعزى أساسا إلى الجين KU70. هنا، ونحن التقرير بروتوكول السهل والسريع للتحول الوراثي كفاءة وللحذف الجينات في Y. lipolytica Po1g. الأول، وهو بروتوكول للتحول كفاءة من الحمض النووي الخارجية إلى Y. تأسست lipolytica Po1g. سيكوالثانية، لتحقيق تعزيز المزدوج كروس معدل إعادة التركيب مثلي لمزيد من الحذف من الجينات المستهدفة، تم حذف هذا الجين KU70 عن طريق تحويل شريط كاسيت اختلال تحمل 1 الأسلحة كيلوبايت التماثل. ثالثا، للتدليل على تعزيز كفاءة الجينات الحذف بعد الحذف من الجينات KU70، حذفنا فردي 11 الجينات المستهدفة ترميز نازعة الكحول وأوكسيديز الكحول باستخدام نفس الإجراءات على سلالة KU70 خروج المغلوب منصة. ولوحظ أن معدل إعادة التركيب مثلي الدقيق ازداد كثيرا من أقل من 0.5٪ للحذف من الجين KU70 في Po1g إلى 33٪ -71٪ لحذف جين واحد من الجينات المستهدفة 11 في Po1g KU70 Δ. شيد البلازميد تنسخي تحمل علامة مقاومة هيغروميسين B ونظام لجنة المساواة العرقية / LoxP، والجين اختيار علامة في سلالات خروج المغلوب الخميرة أزيل في نهاية المطاف عن طريق التعبير عن لجنة المساواة العرقية recombinase لتسهيل جولات متعددة من المستهدفينالتلاعب الجيني تيد. ينتج عن ذلك من المسوخ الحذف جين واحد لها تطبيقات محتملة في الوقود الحيوي وإنتاج والكيمياء الحيوية.
Introduction
وخلافا لخميرة الخباز، Yarrowia lipolytica، والخميرة غير تقليدية، يمكن أن تنمو في شكل الخميرة او mycelium في استجابة للتغيرات في الظروف 1،2 البيئي. وهكذا، وهذا الخميرة ديمبرافيك يمكن استخدامها كنموذج جيد لدراسة التمايز الفطري، التشكل و3،4،5 التصنيف. ويعتبر بشكل عام على أنها آمنة وأنواع من الخميرة (غرا)، والذي يستخدم على نطاق واسع لإنتاج مجموعة متنوعة من المضافات الغذائية مثل الأحماض العضوية، polyalcohols، مركبات رائحة، والمستحلبات والسطحي 6،7،8،9. وهو الميكروب الهوائي تلزم والخميرة الزيتية المعروفة قادرة على تراكم الدهون بشكل طبيعي في كميات عالية، أي ما يصل إلى 70٪ من الوزن الجاف خلية 10. ويمكن أيضا الاستفادة من مجموعة واسعة من مصادر الكربون للنمو، بما في ذلك أنواع مختلفة من المخلفات في الموارد النفايات والمواد الغذائية 11،12،13. كل هذه الميزات الفريدة جعل Y. lipolytica جذابة للغاية للالعديد من التطبيقات في مجال التكنولوجيا الأحيائية.
على الرغم من أن تسلسل الجينوم الكامل للY. وقد تم نشر lipolytica 14،15، والتلاعب الجيني لهذه الخميرة غير تقليدية هو أكثر تعقيدا من الأنواع الخميرة الأخرى. أولا، تحول هذا أنواع من الخميرة هو أقل كفاءة بكثير نظرا لعدم وجود نظام التحول الجيني 16،17 مستقرة وفعالة. ثانيا، يتم استخدام التكامل الجيني شاقة من أشرطة التعبير الخطية عادة للتعبير عن الجينات ذات الاهتمام كما تم العثور على أي نظام البلازميد episomal الطبيعي في هذه الخميرة 18. الثالث، وتوليد الوراثية تدق الرافضة واضعا الإضافية تقتصر لأن استهداف الجينات الكفاءة عبر إعادة التركيب مثلي دقيق في هذه الخميرة منخفضة وتحدث معظم أحداث التكامل من خلال نهاية غير المتجانسة الانضمام (NHEJ) 19.
في هذه الدراسة، ونحن الإبلاغ عن بروتوكول التحول الأمثل لY. lipolytica </م> Po1g سلالة، والتي من السهل وسريعة وفعالة وقابلة للتكرار. لتعزيز وتيرة إعادة التركيب مثلي الدقيق، أن حذف هذا الجين KU70، الذي يشفر إنزيم أساسي في مسار NHEJ. باستخدام بروتوكول التحول الأمثل وتحويل شريط كاسيت خروج المغلوب الخطية التي تحتوي المرافقة المناطق تناظر من 1 كيلو بايت، الجين KU70 من Y. تم حذف lipolytica Po1g بنجاح. وبعد ذلك أثبتت متانة هذه المنهجية حذف الجينات من خلال استهداف نازعة الكحول والجينات الكحول أوكسيديز في سلالة Po1g KU70 Δ. ولوحظ أن حذف سلالة KU70 أظهرت كفاءة أعلى بكثير من مثلي الجينات بوساطة إعادة التركيب تستهدف من ذلك من البرية من نوع Po1g سلالة. وبالإضافة إلى ذلك، تم إنشاء لجنة المساواة العرقية التعبير البلازميد تنسخي تحمل علامة مقاومة هيغروميسين B في عملية إنقاذ علامة. إنقاذ علامة يسهل جولات متعددة من استهداف الجينات في اله الحصول على طفرات الحذف الجينات. وبالاضافة الى حذف الجينات، لدينا بروتوكول للتحول الوراثي والجينات الحذف الموصوفة هنا يمكن تطبيقها على إدراج الجينات إلى مواضع محددة، وإدخال طفرات في مواقع محددة في Y. lipolytica الجينوم.
Protocol
Representative Results
Discussion
وهدفنا في هذه الدراسة هو تمكين جيل سريع وفعال بالضربة القاضية جين المستهدفة في Y. lipolytica Po1g سلالة وتحتاج العديد من الاعتبارات التي يتعين معالجتها لتحقيق هذا. أولا، لا بد من كفاءة تحويل عالية. وهكذا، فإن بروتوكول التحول الكيميائي فعالة ومريحة للY. وقد وصف?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
نحن الامتنان الدعم بتمويل من وكالة البيئة الوطنية في سنغافورة (برنامج التعليم والتدريب 1201102)، وبرنامج البحوث التنافسية للمؤسسة القومي للبحوث في سنغافورة (جبهة الخلاص الوطني، CRP5-2009-03)، وكالة للعلوم والتكنولوجيا والبحوث في سنغافورة ( 1324004108)، العالمية R & D برنامج مشروع، وزارة اقتصاد المعرفة، وجمهورية كوريا (N0000677)، وكالة خفض التهديد الدفاعي (اثناء اجتماع السلطة، HDTRA1-13-1-0037) وعلم الأحياء الاصطناعية مبادرة من الجامعة الوطنية في سنغافورة ( DPRT / 943/09/14).
Materials
| Reagent/Material | |||
| Oligonucleotide primers | Integrated DNA Technologies | 25 nmole DNA oligos | |
| Y. lipolytica strain Po1g | Yeastern Biotech | leucine auxotrophic derivative of the wild-type strain W29 (ATCC 20460) | |
| Vector pYLEX1 | Yeastern Biotech | FYY203-5MG | Y. lipolytica expression vector |
| E. coli TOP10 | Invitrogen | For cloning and propagation of plasmids | |
| pGEM-T vector | Promega | A3600 | TA cloning vector |
| QIAprep Spin Miniprep Kit | Qiagen | 27106 | For plasmid isolation |
| Wizard SV Gel and PCR Clean-Up System |
Promega | A9282 | Extract DNA fragments from agarose gels and purify PCR products from an amplification reaction |
| The iProof high-fidelity DNA polymerase |
Bio-Rad | 172-5302 | High-fidelity DNA polymerase |
| BamHI | New England Biolabs | R0136S | Restriction enzyme |
| BglII | New England Biolabs | R0144L | Restriction enzyme |
| KpnI | New England Biolabs | R0142S | Restriction enzyme |
| NdeI | New England Biolabs | R0111S | Restriction enzyme |
| NotI | New England Biolabs | R0189L | Restriction enzyme |
| PmlI | New England Biolabs | R0532S | Restriction enzyme |
| PstI | New England Biolabs | R0140S | Restriction enzyme |
| SacII | New England Biolabs | R0157S | Restriction enzyme |
| SalI | New England Biolabs | R0138S | Restriction enzyme |
| XhoI | New England Biolabs | R0146L | Restriction enzyme |
| T4 DNA ligase | New England Biolabs | M0202L | |
| Taq DNA polymerase | Bio-Rad | M0267L | |
| Ampicillin | Gibco-Life Technologies | 11593-027 | Antibiotics |
| Hygromycin B | PAA | P21-014 | Antibiotics |
| GeneRuler 1 kb DNA ladder | Thermo Scientific | SM0312 | 1 kb DNA ladder |
| PEG4000 | Sigma | 95904-F | |
| Tris | Promega | H5135 | |
| EDTA | Bio-Rad | 161-0729 | |
| Salmon Sperm DNA | Invitrogen | 15-632-011 | |
| Lithium Acetate | Sigma | ||
| Acetic acid | Sigma | ||
| Glass beads (425-600 µm) | Sigma | G8772 | |
| RNAse A | Thermo Scientific | EN0531 | |
| DNA Loading Dye | Thermo Scientific | R0611 | |
| Bacto Yeast Extract | BD | 212750 | |
| Bacto Peptone | BD | 211677 | |
| D-Glucose | 1st Base | BIO-1101 | |
| YNB without amino acids | Sigma | Y0626 | |
| DO Supplement-Leu | Clontech | 630414 | |
| Glycerol | Sigma | G5516 | |
| Difco LB Broth | BD | 244620 | |
| Difco LB Agar | BD | 244520 | |
| Bacto Agar | BD | 214010 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| PCR machine | Biorad | T100 Thermal Cycler | |
| Water bath | Memmert | WNB 14 | |
| Stationary/Shaking Incubator | Yihder | LM-570RD | |
| Thermo-shaker | Allsheng | MS-100 | |
| Micro centrifuge | Eppendorf | 5424R | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5810R | |
| Spectrophotometer | Eppendorf | BioPhotometer plus | |
| Gel imager | GE | Amersham Imager 600 | |
References
- Jiménez-Bremont, J. F., Rodrìguez-Hernández, A. A., Rodrìguez-Kessler, M., J, R. u. i. z. -. H. e. r. r. e. r. a. . Development and dimorphism of the yeast Yarrowia lipolytica. Dimorphic fungi: Their importance as models for differentiation and fungal pathogenesis. , 58-66 (2012).
- Coelho, M., Amaral, P., Belo, I., Méndez-Vilas, A. . Yarrowia lipolytica: an industrial workhorse. Current research, technology and education topics in applied microbiology and microbial biotechnology. , 930-940 (2010).
- Martinez-Vazquez, A., et al. Identification of the transcription factor Znc1p, which regulates the yeast-to-hypha transition in the dimorphic yeast Yarrowia lipolytica. Plos One. 8 (6), e66790 (2013).
- Richard, M., Quijano, R. R., Bezzate, S., Bordon-Pallier, F., Gaillardin, C. Tagging morphogenetic genes by insertional mutagenesis in the yeast Yarrowia lipolytica. J. Bacteriol. 183 (10), 3098-3107 (2001).
- Flores, C. L., Martìnez-Costa, O. H., Sánchez, V., Gancedo, C., Aragòn, J. J. The dimorphic yeast Yarrowia lipolytica possesses an atypical phosphofructokinase: characterization of the enzyme and its encoding gene. Microbiology. 151 (5), 1465-1474 (2005).
- Domìnguez, &. #. 1. 9. 3. ;., et al. Non-conventional yeasts as hosts for heterologous protein production. Int. Microbiol. 1 (2), 131-142 (1998).
- Zinjarde, S. S. Food-related applications of Yarrowia lipolytica. Food Chem. 152, 1-10 (2014).
- Finogenova, T., Morgunov, I., Kamzolova, S., Chernyavskaya, O. Organic acid production by the yeast Yarrowia lipolytica: a review of prospects. Appl. Biochem. Micro+. 41 (5), 418-425 (2005).
- Groguenin, A., et al. Genetic engineering of the β-oxidation pathway in the yeast Yarrowia lipolytica to increase the production of aroma compounds. J. Mol. Catal. B-Enzym. 28 (2), 75-79 (2004).
- Meng, X., et al. Biodiesel production from oleaginous microorganisms. Renew. Energ. 34 (1), 1-5 (2009).
- Papanikolaou, S., Aggelis, G. Lipid production by Yarrowia lipolytica growing on industrial glycerol in a single-stage continuous culture. Bioresource Technol. 82 (1), 43-49 (2002).
- Tai, M., Stephanopoulos, G. Engineering the push and pull of lipid biosynthesis in oleaginous yeast Yarrowia lipolytica for biofuel production. Metab. Eng. 15, 1-9 (2013).
- Liu, H. H., Ji, X. J., Huang, H. Biotechnological applications of Yarrowia lipolytica: Past, present and future. Biotechnol. Adv. 33 (8), 1522-1546 (2015).
- Liu, L., Alper, H. S. Draft genome sequence of the oleaginous yeast Yarrowia lipolytica PO1f, a commonly used metabolic engineering host. Genome Announc. 2 (4), e00652-e00614 (2014).
- Dujon, B., et al. Genome evolution in yeasts. Nature. 430 (6995), 35-44 (2004).
- Chen, D. C., Beckerich, J. M., Gaillardin, C. One-step transformation of the dimorphic yeast Yarrowia lipolytica. Appl. Microbial. Biotechnol. 48 (2), 232-235 (1997).
- Wang, J. H., Hung, W., Tsai, S. H. High efficiency transformation by electroporation of Yarrowia lipolytica. J. Microbiol. 49 (3), 469-472 (2011).
- Matsuoka, M., et al. Analysis of regions essential for the function of chromosomal replicator sequences from Yarrowia lipolytica. Mol. Gen. Genet. 237 (3), 327-333 (1993).
- Kretzschmar, A., et al. Increased homologous integration frequency in Yarrowia lipolytica strains defective in non-homologous end-joining. Curr. Genet. 59 (1-2), 63-72 (2013).
- Lorenz, T. C. Polymerase Chain Reaction: Basic Protocol Plus Troubleshooting and Optimization Strategies. J. Vis. Exp. (63), e3998 (2012).
- Kobs, G. Cloning blunt-end DNA fragments into the pGEM-T Vector Systems. Promega Notes. 62, 15-18 (1997).
- Sanders, E. R. Aseptic laboratory techniques: plating methods. J. Vis. Exp. (63), e3064 (2012).
- Hegemann, J. H., Heick, S. B. Delete and repeat: a comprehensive toolkit for sequential gene knockout in the budding yeast Saccharomyces cerevisiae. Methods Mol. Biol. 765, 189-206 (2011).
- Yamane, T., Sakai, H., Nagahama, K., Ogawa, T., Matsuoka, M. Dissection of centromeric DNA from yeast Yarrowia lipolytica and identification of protein-binding site required for plasmid transmission. J. Biosci. Bioeng. 105 (6), 571-578 (2008).
- McGinnis, S., Madden, T. L. BLAST: at the core of a powerful and diverse set of sequence analysis tools. Nucleic Acids Res. 32 ((Web Server issue)), W20-W25 (2004).
- Madzak, C., Tréton, B., Blanchin-Roland, S. Strong hybrid promoters and integrative expression/secretion vectors for quasi-constitutive expression of heterologous proteins in the yeast Yarrowia lipolytica. J. Mol. Microbiol. Biotechnol. 2 (2), 207-216 (2000).
- Nicaud, J. M., Le Clainche, A., Le Dall, M. T., Wang, H., Gaillardin, C. Yarrowia lipolytica, a yeast model for the genetic studies of hydroxy fatty acids biotransformation into lactones. J. Mol. Catal. B-Enzym. 5 (1), 175-181 (1998).
