Genetische manipulatie van een onconventionele Gist voor duurzame biobrandstoffen en biochemische Production

Ai-Qun Yu; Nina Pratomo; Tee-Kheang Ng; Hua Ling; Han-Saem Cho; Susanna Su Jan Leong; Matthew Wook Chang

doi:10.3791/54371

Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.

Methodenartikel

Genetische manipulatie van een onconventionele Gist voor duurzame biobrandstoffen en biochemische Production

14.7K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/54371

⸱

20 september 2016

Ai-Qun Yu¹^,² , Nina Pratomo¹^,² , Tee-Kheang Ng¹^,² , Hua Ling¹^,² , Han-Saem Cho¹^,² , Susanna Su Jan Leong¹^,²^,³ , Matthew Wook Chang¹^,²

¹Department of Biochemistry, Yong Loo Lin School of Medicine, National University of Singapore, ²NUS Synthetic Biology for Clinical and Technological Innovation (SynCTI), Life Sciences Institute, National University of Singapore, ³Food Science and Chemical Engineering, Singapore Institute of Technology

In dit artikel

Samenvatting

Wij rapporteren hier methoden over de moleculair-genetische manipulatie van de Yarrowia lipolytica Po1g stam voor verbeterde gendeletie-efficiëntie. De resulterende gemanipuleerde Y. lipolytica stammen hebben potentiële toepassingen in biobrandstof en biochemische productie.

Samenvatting

Yarrowia lipolytica is een niet-pathogeen, dimorphe en strikt aerobe gistsoorten. Door zijn onderscheidende fysiologische functies en metabole eigenschappen, onconventionele gist niet alleen een goed model voor de studie van het fundamentele karakter van schimmel differentiatie, maar ook een veelbelovende microbiële platform voor biochemische productie en diverse biotechnologische toepassingen, die een uitgebreide genetische manipulaties vereisen. Echter, genetische manipulaties Y. lipolytica zijn beperkt door het ontbreken van een efficiënte en stabiele genetische transformatie systeem en zeer hoge niet-homologe recombinatie die hoofdzakelijk kan worden toegeschreven aan de Ku70 gen. Hier melden wij een gemakkelijke en snelle protocol voor de efficiënte genetische transformatie en voor gen-deletie in Y. lipolytica Po1g. Ten eerste, een protocol voor de efficiënte transformatie van exogeen DNA in Y. lipolytica Po1g werd opgericht. Second, de verbeterde double-crossover homologe recombinatie rate te bereiken voor verdere verwijdering van target-genen, werd de Ku70 gen verwijderd door het transformeren van een verstoring cassette uitvoeren 1 kb homologie armen. Ten derde, de verbeterde gendeletie efficiency met weglating van de Ku70 gen aan te tonen, we individueel verwijderd 11 doelwit genen die coderen voor alcohol dehydrogenase en alcohol oxidase met dezelfde procedures op het Ku70 knockout platform stam. Waargenomen werd dat de snelheid van precieze homologe recombinatie aanzienlijk gestegen van minder dan 0,5% voor verwijdering van de Ku70 gen in Po1g tot 33% -71% van de enkel gen schrapping van de 11 target genen in Po1g Ku70 Δ. Een replicatieve plasmide dat het hygromycine B resistentie marker en het Cre / LoxP systeem werd gebouwd, en de selectie marker-gen in de gist knockout stammen werd uiteindelijk verwijderd door expressie van Cre recombinase om meerdere rondes van targe vergemakkelijkented genetische manipulaties. De resulterende single-gen deletiemutanten hebben potentiële toepassingen in biobrandstoffen en biochemische productie.

Inleiding

Unlike Saccharomyces cerevisiae, Yarrowia lipolytica, een onconventionele gist kan groeien in de vorm van gist of mycelium in reactie op veranderingen in de omgevingscondities ^1,2. Aldus kan deze dimorfe gist gebruikt als een goed model voor de studie van schimmels differentiatie, morfogenese en taxonomie ^3,4,5. Het wordt algemeen beschouwd als veilig (GRAS) gistsoort, die op grote schaal wordt gebruikt om een verscheidenheid van additieven producten zoals organische zuren, polyalcoholen, aroma stoffen, emulgatoren en oppervlakteactieve ^6,7,8,9. Het is een obligaat aërobe en bekende oliehoudende gist kan natuurlijk a....