Genetische manipulatie van een onconventionele Gist voor duurzame biobrandstoffen en biochemische Production
Summary
We herein report methods on the molecular genetic manipulation of the Yarrowia lipolytica Po1g strain for improved gene deletion efficiency. The resulting engineered Y. lipolytica strains have potential applications in biofuel and biochemical production.
Abstract
Yarrowia lipolytica is een niet-pathogeen, dimorphe en strikt aerobe gistsoorten. Door zijn onderscheidende fysiologische functies en metabole eigenschappen, onconventionele gist niet alleen een goed model voor de studie van het fundamentele karakter van schimmel differentiatie, maar ook een veelbelovende microbiële platform voor biochemische productie en diverse biotechnologische toepassingen, die een uitgebreide genetische manipulaties vereisen. Echter, genetische manipulaties Y. lipolytica zijn beperkt door het ontbreken van een efficiënte en stabiele genetische transformatie systeem en zeer hoge niet-homologe recombinatie die hoofdzakelijk kan worden toegeschreven aan de Ku70 gen. Hier melden wij een gemakkelijke en snelle protocol voor de efficiënte genetische transformatie en voor gen-deletie in Y. lipolytica Po1g. Ten eerste, een protocol voor de efficiënte transformatie van exogeen DNA in Y. lipolytica Po1g werd opgericht. Second, de verbeterde double-crossover homologe recombinatie rate te bereiken voor verdere verwijdering van target-genen, werd de Ku70 gen verwijderd door het transformeren van een verstoring cassette uitvoeren 1 kb homologie armen. Ten derde, de verbeterde gendeletie efficiency met weglating van de Ku70 gen aan te tonen, we individueel verwijderd 11 doelwit genen die coderen voor alcohol dehydrogenase en alcohol oxidase met dezelfde procedures op het Ku70 knockout platform stam. Waargenomen werd dat de snelheid van precieze homologe recombinatie aanzienlijk gestegen van minder dan 0,5% voor verwijdering van de Ku70 gen in Po1g tot 33% -71% van de enkel gen schrapping van de 11 target genen in Po1g Ku70 Δ. Een replicatieve plasmide dat het hygromycine B resistentie marker en het Cre / LoxP systeem werd gebouwd, en de selectie marker-gen in de gist knockout stammen werd uiteindelijk verwijderd door expressie van Cre recombinase om meerdere rondes van targe vergemakkelijkented genetische manipulaties. De resulterende single-gen deletiemutanten hebben potentiële toepassingen in biobrandstoffen en biochemische productie.
Introduction
Unlike Saccharomyces cerevisiae, Yarrowia lipolytica, een onconventionele gist kan groeien in de vorm van gist of mycelium in reactie op veranderingen in de omgevingscondities 1,2. Aldus kan deze dimorfe gist gebruikt als een goed model voor de studie van schimmels differentiatie, morfogenese en taxonomie 3,4,5. Het wordt algemeen beschouwd als veilig (GRAS) gistsoort, die op grote schaal wordt gebruikt om een verscheidenheid van additieven producten zoals organische zuren, polyalcoholen, aroma stoffen, emulgatoren en oppervlakteactieve 6,7,8,9. Het is een obligaat aërobe en bekende oliehoudende gist kan natuurlijk accumuleren lipiden in grote hoeveelheden, dat wil zeggen tot 70% van de cel drooggewicht 10. Het kan ook gebruik maken van een breed spectrum van koolstofbronnen voor groei, met inbegrip van verschillende soorten vervuiling in afgewerkte middelen als voedingsstoffen 11,12,13. Al deze unieke functies maken Y. lipolytica zeer aantrekkelijkdiverse biotechnologische toepassingen.
Hoewel de gehele genoomsequentie van de Y. lipolytica is gepubliceerd 14,15, genetische manipulatie van deze onconventionele gist is complexer dan andere gistsoorten. Eerste, transformatie van deze gistsoorten veel minder efficiënt door het ontbreken van een stabiele en efficiënte genetische transformatie systeem 16,17. Ten tweede, is bewerkelijk genomische integratie van lineaire expressiecassettes gebruikt voor de expressie van genen van belang geen natuurlijke episomaal plasmide systeem is in deze gist 18. Ten derde, generatie van genetische knock-outs en knock-ins zijn beperkt, omdat de gene targeting efficiency via nauwkeurige homologe recombinatie in deze gist is laag en de meeste integratie evenementen plaatsvinden via niet-homologe end-joining (NHEJ) 19.
In deze studie, melden wij een geoptimaliseerd transformatie protocol voor de Y. lipolytica </em> Po1g stam, die gemakkelijk, snel, efficiënt en reproduceerbaar. Om de frequentie van homologe recombinatie precieze, verwijderd we Ku70 gen, dat een sleutelenzym in de route NHEJ codeert. Met de geoptimaliseerde transformatieprotocol en transformeren van een lineaire knockout cassette die flankerende gebieden van homologie 1 kb, de Ku70 gen van Y. lipolytica Po1g werd succesvol verwijderd. De robuustheid van dit gen deletie methodiek werd vervolgens aangetoond door zich te richten alcohol dehydrogenase en alcohol oxidase genen in de Po1g Ku70 Δ stam. Waargenomen werd dat de Ku70 deletie stam vertoonde een aanzienlijk hogere efficiëntie van homologe recombinatie bemiddelde gerichte mutagenese dan die van de wildtype stam Po1g. Bovendien, een replicatief Cre expressie plasmide dat het hygromycine B resistentie marker werd geconstrueerd om marker rescue voeren. De marker rescue faciliteert meerdere ronden van gen-targeting in the verkregen gen deletiemutanten. Naast gendeletie, kan ons protocol voor genetische transformatie en gendeletie beschreven worden toegepast om genen op specifieke loci voegen, en plaatsspecifieke mutaties te introduceren in de Y. lipolytica genoom.
Protocol
Representative Results
Discussion
De doelstelling van dit onderzoek is om snel en efficiënt genereren van gerichte gen knockouts schakelen in de Y. lipolytica Po1g stam. Verschillende overwegingen moeten worden aangepakt om dit te bereiken. Eerst wordt een hoge transformatie-efficiëntie nodig. Aldus wordt een efficiënte en geschikte chemische transformatie protocol voor Y. lipolytica Po1g stam werd beschreven in deze studie. Het gebruik van PEG-4000 is een kritische factor voor de succesvolle transformatie van deze stam. Ge…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wij dankbaar erkennen de financiële steun van de National Environment Agency van Singapore (ETRP 1.201.102), de Competitive Research Program van de National Research Foundation van Singapore (NRF-CRP5-2009-03), het Agentschap voor Wetenschap, Technologie en Onderzoek van Singapore ( 1324004108), Global R & D Project Program, het ministerie van kenniseconomie, de Republiek Korea (N0000677), het Defense Threat Reduction Agency (DTRA, HDTRA1-13-1-0037) en de Synthetische Biologie initiatief van de National University of Singapore ( DPRT / 943/09/14).
Materials
| Reagent/Material | |||
| Oligonucleotide primers | Integrated DNA Technologies | 25 nmole DNA oligos | |
| Y. lipolytica strain Po1g | Yeastern Biotech | leucine auxotrophic derivative of the wild-type strain W29 (ATCC 20460) | |
| Vector pYLEX1 | Yeastern Biotech | FYY203-5MG | Y. lipolytica expression vector |
| E. coli TOP10 | Invitrogen | For cloning and propagation of plasmids | |
| pGEM-T vector | Promega | A3600 | TA cloning vector |
| QIAprep Spin Miniprep Kit | Qiagen | 27106 | For plasmid isolation |
| Wizard SV Gel and PCR Clean-Up System |
Promega | A9282 | Extract DNA fragments from agarose gels and purify PCR products from an amplification reaction |
| The iProof high-fidelity DNA polymerase |
Bio-Rad | 172-5302 | High-fidelity DNA polymerase |
| BamHI | New England Biolabs | R0136S | Restriction enzyme |
| BglII | New England Biolabs | R0144L | Restriction enzyme |
| KpnI | New England Biolabs | R0142S | Restriction enzyme |
| NdeI | New England Biolabs | R0111S | Restriction enzyme |
| NotI | New England Biolabs | R0189L | Restriction enzyme |
| PmlI | New England Biolabs | R0532S | Restriction enzyme |
| PstI | New England Biolabs | R0140S | Restriction enzyme |
| SacII | New England Biolabs | R0157S | Restriction enzyme |
| SalI | New England Biolabs | R0138S | Restriction enzyme |
| XhoI | New England Biolabs | R0146L | Restriction enzyme |
| T4 DNA ligase | New England Biolabs | M0202L | |
| Taq DNA polymerase | Bio-Rad | M0267L | |
| Ampicillin | Gibco-Life Technologies | 11593-027 | Antibiotics |
| Hygromycin B | PAA | P21-014 | Antibiotics |
| GeneRuler 1 kb DNA ladder | Thermo Scientific | SM0312 | 1 kb DNA ladder |
| PEG4000 | Sigma | 95904-F | |
| Tris | Promega | H5135 | |
| EDTA | Bio-Rad | 161-0729 | |
| Salmon Sperm DNA | Invitrogen | 15-632-011 | |
| Lithium Acetate | Sigma | ||
| Acetic acid | Sigma | ||
| Glass beads (425-600 µm) | Sigma | G8772 | |
| RNAse A | Thermo Scientific | EN0531 | |
| DNA Loading Dye | Thermo Scientific | R0611 | |
| Bacto Yeast Extract | BD | 212750 | |
| Bacto Peptone | BD | 211677 | |
| D-Glucose | 1st Base | BIO-1101 | |
| YNB without amino acids | Sigma | Y0626 | |
| DO Supplement-Leu | Clontech | 630414 | |
| Glycerol | Sigma | G5516 | |
| Difco LB Broth | BD | 244620 | |
| Difco LB Agar | BD | 244520 | |
| Bacto Agar | BD | 214010 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| PCR machine | Biorad | T100 Thermal Cycler | |
| Water bath | Memmert | WNB 14 | |
| Stationary/Shaking Incubator | Yihder | LM-570RD | |
| Thermo-shaker | Allsheng | MS-100 | |
| Micro centrifuge | Eppendorf | 5424R | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5810R | |
| Spectrophotometer | Eppendorf | BioPhotometer plus | |
| Gel imager | GE | Amersham Imager 600 | |
References
- Jiménez-Bremont, J. F., Rodrìguez-Hernández, A. A., Rodrìguez-Kessler, M., J, R. u. i. z. -. H. e. r. r. e. r. a. . Development and dimorphism of the yeast Yarrowia lipolytica. Dimorphic fungi: Their importance as models for differentiation and fungal pathogenesis. , 58-66 (2012).
- Coelho, M., Amaral, P., Belo, I., Méndez-Vilas, A. . Yarrowia lipolytica: an industrial workhorse. Current research, technology and education topics in applied microbiology and microbial biotechnology. , 930-940 (2010).
- Martinez-Vazquez, A., et al. Identification of the transcription factor Znc1p, which regulates the yeast-to-hypha transition in the dimorphic yeast Yarrowia lipolytica. Plos One. 8 (6), e66790 (2013).
- Richard, M., Quijano, R. R., Bezzate, S., Bordon-Pallier, F., Gaillardin, C. Tagging morphogenetic genes by insertional mutagenesis in the yeast Yarrowia lipolytica. J. Bacteriol. 183 (10), 3098-3107 (2001).
- Flores, C. L., Martìnez-Costa, O. H., Sánchez, V., Gancedo, C., Aragòn, J. J. The dimorphic yeast Yarrowia lipolytica possesses an atypical phosphofructokinase: characterization of the enzyme and its encoding gene. Microbiology. 151 (5), 1465-1474 (2005).
- Domìnguez, &. #. 1. 9. 3. ;., et al. Non-conventional yeasts as hosts for heterologous protein production. Int. Microbiol. 1 (2), 131-142 (1998).
- Zinjarde, S. S. Food-related applications of Yarrowia lipolytica. Food Chem. 152, 1-10 (2014).
- Finogenova, T., Morgunov, I., Kamzolova, S., Chernyavskaya, O. Organic acid production by the yeast Yarrowia lipolytica: a review of prospects. Appl. Biochem. Micro+. 41 (5), 418-425 (2005).
- Groguenin, A., et al. Genetic engineering of the β-oxidation pathway in the yeast Yarrowia lipolytica to increase the production of aroma compounds. J. Mol. Catal. B-Enzym. 28 (2), 75-79 (2004).
- Meng, X., et al. Biodiesel production from oleaginous microorganisms. Renew. Energ. 34 (1), 1-5 (2009).
- Papanikolaou, S., Aggelis, G. Lipid production by Yarrowia lipolytica growing on industrial glycerol in a single-stage continuous culture. Bioresource Technol. 82 (1), 43-49 (2002).
- Tai, M., Stephanopoulos, G. Engineering the push and pull of lipid biosynthesis in oleaginous yeast Yarrowia lipolytica for biofuel production. Metab. Eng. 15, 1-9 (2013).
- Liu, H. H., Ji, X. J., Huang, H. Biotechnological applications of Yarrowia lipolytica: Past, present and future. Biotechnol. Adv. 33 (8), 1522-1546 (2015).
- Liu, L., Alper, H. S. Draft genome sequence of the oleaginous yeast Yarrowia lipolytica PO1f, a commonly used metabolic engineering host. Genome Announc. 2 (4), e00652-e00614 (2014).
- Dujon, B., et al. Genome evolution in yeasts. Nature. 430 (6995), 35-44 (2004).
- Chen, D. C., Beckerich, J. M., Gaillardin, C. One-step transformation of the dimorphic yeast Yarrowia lipolytica. Appl. Microbial. Biotechnol. 48 (2), 232-235 (1997).
- Wang, J. H., Hung, W., Tsai, S. H. High efficiency transformation by electroporation of Yarrowia lipolytica. J. Microbiol. 49 (3), 469-472 (2011).
- Matsuoka, M., et al. Analysis of regions essential for the function of chromosomal replicator sequences from Yarrowia lipolytica. Mol. Gen. Genet. 237 (3), 327-333 (1993).
- Kretzschmar, A., et al. Increased homologous integration frequency in Yarrowia lipolytica strains defective in non-homologous end-joining. Curr. Genet. 59 (1-2), 63-72 (2013).
- Lorenz, T. C. Polymerase Chain Reaction: Basic Protocol Plus Troubleshooting and Optimization Strategies. J. Vis. Exp. (63), e3998 (2012).
- Kobs, G. Cloning blunt-end DNA fragments into the pGEM-T Vector Systems. Promega Notes. 62, 15-18 (1997).
- Sanders, E. R. Aseptic laboratory techniques: plating methods. J. Vis. Exp. (63), e3064 (2012).
- Hegemann, J. H., Heick, S. B. Delete and repeat: a comprehensive toolkit for sequential gene knockout in the budding yeast Saccharomyces cerevisiae. Methods Mol. Biol. 765, 189-206 (2011).
- Yamane, T., Sakai, H., Nagahama, K., Ogawa, T., Matsuoka, M. Dissection of centromeric DNA from yeast Yarrowia lipolytica and identification of protein-binding site required for plasmid transmission. J. Biosci. Bioeng. 105 (6), 571-578 (2008).
- McGinnis, S., Madden, T. L. BLAST: at the core of a powerful and diverse set of sequence analysis tools. Nucleic Acids Res. 32 ((Web Server issue)), W20-W25 (2004).
- Madzak, C., Tréton, B., Blanchin-Roland, S. Strong hybrid promoters and integrative expression/secretion vectors for quasi-constitutive expression of heterologous proteins in the yeast Yarrowia lipolytica. J. Mol. Microbiol. Biotechnol. 2 (2), 207-216 (2000).
- Nicaud, J. M., Le Clainche, A., Le Dall, M. T., Wang, H., Gaillardin, C. Yarrowia lipolytica, a yeast model for the genetic studies of hydroxy fatty acids biotransformation into lactones. J. Mol. Catal. B-Enzym. 5 (1), 175-181 (1998).
