Genetic Engineering af en utraditionel Gær for Vedvarende Biobrændsel og biokemisk Produktion
Summary
We herein report methods on the molecular genetic manipulation of the Yarrowia lipolytica Po1g strain for improved gene deletion efficiency. The resulting engineered Y. lipolytica strains have potential applications in biofuel and biochemical production.
Abstract
Yarrowia lipolytica er et non-patogene, dimorfe og strengt aerobe gærarter. På grund af dens særlige fysiologiske funktioner og metaboliske egenskaber, denne ukonventionelle gær er ikke kun en god model for studiet af den grundlæggende karakter af svampe differentiering, men er også en lovende mikrobiel platform for biokemisk produktion og forskellige bioteknologiske applikationer, som kræver omfattende genetiske manipulationer. Dog, genetiske manipulationer af Y. lipolytica har været begrænset på grund af manglen på en effektiv og stabil genetisk transformation system samt meget høje ikke-homolog rekombination, der kan primært henføres til Ku70 genet. Her rapporterer vi en nem og hurtig protokol til effektiv genetisk transformation og for gendeletion i Y. lipolytica Po1g. Først en protokol til effektiv omdannelse af exogent DNA i Y. lipolytica Po1g blev etableret. Second, for at opnå den forbedrede dobbelt-crossover homolog rekombination sats for yderligere deletion af målgener blev Ku70-genet deleteret ved at transformere en afbrydelse kassette transporterer 1 kb homologiarme. For det tredje, at demonstrere den forbedrede gendeletion effektivitet efter sletning af Ku70 genet, vi individuelt slettet 11 mål gener, der koder alkoholdehydrogenase og alkohol oxidase med de samme procedurer på Ku70 knockout platform stamme. Det blev observeret, at hastigheden af præcise homolog rekombination steg betydeligt fra mindre end 0,5% til sletning af Ku70 genet i Po1g til 33% -71% for enkelt gen sletning af de 11 målgener i Po1g Ku70 Δ. En replikative plasmid, der bærer hygromycin B-resistens markør og Cre / LoxP system blev konstrueret, og selektionsmarkørgen i gæren knockout-stammer blev til sidst fjernet ved ekspression af Cre-rekombinase at lette multiple runder af udsigt til rentenedsættelserted genetiske manipulationer. De resulterende single-gen-deletionsmutanter har potentielle anvendelser i biobrændsel og biokemisk produktion.
Introduction
I modsætning til Saccharomyces cerevisiae, Yarrowia lipolytica, en utraditionel gær, kan vokse i form af gær eller mycelium som følge af ændringer i miljøforhold 1,2. Dette kan således dimorfe gær anvendes som en god model for studiet af fungal differentiering, morphogenese og taksonomi 3,4,5. Det er generelt betragtes som en sikker (GRAS) gær arter, som er almindeligt anvendt til at producere en lang række tilsætningsstoffer såsom organiske syrer, polyalkoholer, aromastoffer, emulgatorer og overfladeaktive 6,7,8,9. Det er en obligat aerob og en velkendt olieagtig gær i stand til naturligt at akkumulere lipider ved høje mængder, dvs. op til 70% af celletørvægt 10. Det kan også anvende et bredt spektrum af carbonkilder til vækst, herunder forskellige former for rester i affaldsprodukter ressourcer som næringsstoffer 11,12,13. Alle disse unikke funktioner gør Y. lipolytica meget attraktivt forforskellige bioteknologiske applikationer.
Selvom hele genomet sekvens af Y. lipolytica er offentliggjort 14,15, genetisk manipulation af denne ukonventionelle gær er mere komplekse end andre gærarter. Første, transformation af denne gærart er langt mindre effektive på grund af fraværet af en stabil og effektiv genetisk transformationssystem 16,17. For det andet er besværlig genomisk integration af lineære ekspressionskassetter almindeligvis anvendes til ekspression af gener af interesse som ingen naturlig episomalt plasmid er blevet fundet i denne gær 18. For det tredje generation af genetiske knock-outs og knock-ins er begrænset, fordi det gen targeting effektivitet via nøjagtig homolog rekombination i denne gær er lav, og de fleste integration begivenheder ske gennem non-homolog ende sammenføjning (NHEJ) 19.
I denne undersøgelse rapporterer vi en optimeret transformation protokol for Y. lipolytica </em> Po1g stamme, som er let, hurtig, effektiv og reproducerbar. At øge frekvensen af præcise homolog rekombination, vi slettede Ku70 genet, der koder for et nøgleenzym i NHEJ pathway. Ved at bruge den optimerede transformation protokol og transformation af en lineær knockout kassette indeholdende flankerende homologiregioner af 1 kb, den Ku70 genet fra Y. lipolytica Po1g blev slettet. Robustheden af denne gendeletion metode blev derefter påvist ved at målrette alkoholdehydrogenase og alkoholoxidase-gener i Po1g Ku70 Δ-stamme. Det blev observeret, at Ku70 deletion-stammen udviste en betydeligt højere virkningsgrad af homolog rekombination-medieret gen-targeting end vildtype-Po1g stamme. Desuden blev et replikativt Cre ekspressionsplasmid bærer hygromycin B-resistens markør fremstillet således, at markør redning. Markøren redning letter multiple runder af genmålretning i the opnåede gen-deletionsmutanter. Udover gendeletion, kan vores protokol for genetisk transformation og gendeletion beskrevet her anvendes til at indsætte gener til specifikke loci, og indføre stedsspecifikke mutationer i Y. lipolytica-genomet.
Protocol
Representative Results
Discussion
Vores mål for denne undersøgelse er at give hurtig og effektiv generation af målrettede gen knockouts i Y. lipolytica Po1g stamme. Flere overvejelser skal løses for at opnå dette. Først en høj transformationseffektivitet påkrævet. Således en effektiv og bekvem kemisk omdannelse protokol for Y. lipolytica Po1g stamme blev beskrevet i denne undersøgelse. Anvendelsen af PEG-4000 er en kritisk faktor for vellykket transformation af denne stamme. Ingen transformanter blev opnået f…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi takker finansieringen støtte fra National Environment Agency of Singapore (ETRP 1.201.102), den konkurrencedygtig forskning Program for National Research Foundation of Singapore (NRF-CRP5-2009-03), agenturet for Videnskab, Teknologi og forskning Singapore ( 1324004108), Global R & D-projekt Program, Ministeriet for videnøkonomien, Republikken Korea (N0000677), Defense Threat Reduction Agency (DTRA, HDTRA1-13-1-0037) og syntetisk biologi initiativ fra National University of Singapore ( DPRT / 943/09/14).
Materials
| Reagent/Material | |||
| Oligonucleotide primers | Integrated DNA Technologies | 25 nmole DNA oligos | |
| Y. lipolytica strain Po1g | Yeastern Biotech | leucine auxotrophic derivative of the wild-type strain W29 (ATCC 20460) | |
| Vector pYLEX1 | Yeastern Biotech | FYY203-5MG | Y. lipolytica expression vector |
| E. coli TOP10 | Invitrogen | For cloning and propagation of plasmids | |
| pGEM-T vector | Promega | A3600 | TA cloning vector |
| QIAprep Spin Miniprep Kit | Qiagen | 27106 | For plasmid isolation |
| Wizard SV Gel and PCR Clean-Up System |
Promega | A9282 | Extract DNA fragments from agarose gels and purify PCR products from an amplification reaction |
| The iProof high-fidelity DNA polymerase |
Bio-Rad | 172-5302 | High-fidelity DNA polymerase |
| BamHI | New England Biolabs | R0136S | Restriction enzyme |
| BglII | New England Biolabs | R0144L | Restriction enzyme |
| KpnI | New England Biolabs | R0142S | Restriction enzyme |
| NdeI | New England Biolabs | R0111S | Restriction enzyme |
| NotI | New England Biolabs | R0189L | Restriction enzyme |
| PmlI | New England Biolabs | R0532S | Restriction enzyme |
| PstI | New England Biolabs | R0140S | Restriction enzyme |
| SacII | New England Biolabs | R0157S | Restriction enzyme |
| SalI | New England Biolabs | R0138S | Restriction enzyme |
| XhoI | New England Biolabs | R0146L | Restriction enzyme |
| T4 DNA ligase | New England Biolabs | M0202L | |
| Taq DNA polymerase | Bio-Rad | M0267L | |
| Ampicillin | Gibco-Life Technologies | 11593-027 | Antibiotics |
| Hygromycin B | PAA | P21-014 | Antibiotics |
| GeneRuler 1 kb DNA ladder | Thermo Scientific | SM0312 | 1 kb DNA ladder |
| PEG4000 | Sigma | 95904-F | |
| Tris | Promega | H5135 | |
| EDTA | Bio-Rad | 161-0729 | |
| Salmon Sperm DNA | Invitrogen | 15-632-011 | |
| Lithium Acetate | Sigma | ||
| Acetic acid | Sigma | ||
| Glass beads (425-600 µm) | Sigma | G8772 | |
| RNAse A | Thermo Scientific | EN0531 | |
| DNA Loading Dye | Thermo Scientific | R0611 | |
| Bacto Yeast Extract | BD | 212750 | |
| Bacto Peptone | BD | 211677 | |
| D-Glucose | 1st Base | BIO-1101 | |
| YNB without amino acids | Sigma | Y0626 | |
| DO Supplement-Leu | Clontech | 630414 | |
| Glycerol | Sigma | G5516 | |
| Difco LB Broth | BD | 244620 | |
| Difco LB Agar | BD | 244520 | |
| Bacto Agar | BD | 214010 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| PCR machine | Biorad | T100 Thermal Cycler | |
| Water bath | Memmert | WNB 14 | |
| Stationary/Shaking Incubator | Yihder | LM-570RD | |
| Thermo-shaker | Allsheng | MS-100 | |
| Micro centrifuge | Eppendorf | 5424R | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5810R | |
| Spectrophotometer | Eppendorf | BioPhotometer plus | |
| Gel imager | GE | Amersham Imager 600 | |
References
- Jiménez-Bremont, J. F., Rodrìguez-Hernández, A. A., Rodrìguez-Kessler, M., J, R. u. i. z. -. H. e. r. r. e. r. a. . Development and dimorphism of the yeast Yarrowia lipolytica. Dimorphic fungi: Their importance as models for differentiation and fungal pathogenesis. , 58-66 (2012).
- Coelho, M., Amaral, P., Belo, I., Méndez-Vilas, A. . Yarrowia lipolytica: an industrial workhorse. Current research, technology and education topics in applied microbiology and microbial biotechnology. , 930-940 (2010).
- Martinez-Vazquez, A., et al. Identification of the transcription factor Znc1p, which regulates the yeast-to-hypha transition in the dimorphic yeast Yarrowia lipolytica. Plos One. 8 (6), e66790 (2013).
- Richard, M., Quijano, R. R., Bezzate, S., Bordon-Pallier, F., Gaillardin, C. Tagging morphogenetic genes by insertional mutagenesis in the yeast Yarrowia lipolytica. J. Bacteriol. 183 (10), 3098-3107 (2001).
- Flores, C. L., Martìnez-Costa, O. H., Sánchez, V., Gancedo, C., Aragòn, J. J. The dimorphic yeast Yarrowia lipolytica possesses an atypical phosphofructokinase: characterization of the enzyme and its encoding gene. Microbiology. 151 (5), 1465-1474 (2005).
- Domìnguez, &. #. 1. 9. 3. ;., et al. Non-conventional yeasts as hosts for heterologous protein production. Int. Microbiol. 1 (2), 131-142 (1998).
- Zinjarde, S. S. Food-related applications of Yarrowia lipolytica. Food Chem. 152, 1-10 (2014).
- Finogenova, T., Morgunov, I., Kamzolova, S., Chernyavskaya, O. Organic acid production by the yeast Yarrowia lipolytica: a review of prospects. Appl. Biochem. Micro+. 41 (5), 418-425 (2005).
- Groguenin, A., et al. Genetic engineering of the β-oxidation pathway in the yeast Yarrowia lipolytica to increase the production of aroma compounds. J. Mol. Catal. B-Enzym. 28 (2), 75-79 (2004).
- Meng, X., et al. Biodiesel production from oleaginous microorganisms. Renew. Energ. 34 (1), 1-5 (2009).
- Papanikolaou, S., Aggelis, G. Lipid production by Yarrowia lipolytica growing on industrial glycerol in a single-stage continuous culture. Bioresource Technol. 82 (1), 43-49 (2002).
- Tai, M., Stephanopoulos, G. Engineering the push and pull of lipid biosynthesis in oleaginous yeast Yarrowia lipolytica for biofuel production. Metab. Eng. 15, 1-9 (2013).
- Liu, H. H., Ji, X. J., Huang, H. Biotechnological applications of Yarrowia lipolytica: Past, present and future. Biotechnol. Adv. 33 (8), 1522-1546 (2015).
- Liu, L., Alper, H. S. Draft genome sequence of the oleaginous yeast Yarrowia lipolytica PO1f, a commonly used metabolic engineering host. Genome Announc. 2 (4), e00652-e00614 (2014).
- Dujon, B., et al. Genome evolution in yeasts. Nature. 430 (6995), 35-44 (2004).
- Chen, D. C., Beckerich, J. M., Gaillardin, C. One-step transformation of the dimorphic yeast Yarrowia lipolytica. Appl. Microbial. Biotechnol. 48 (2), 232-235 (1997).
- Wang, J. H., Hung, W., Tsai, S. H. High efficiency transformation by electroporation of Yarrowia lipolytica. J. Microbiol. 49 (3), 469-472 (2011).
- Matsuoka, M., et al. Analysis of regions essential for the function of chromosomal replicator sequences from Yarrowia lipolytica. Mol. Gen. Genet. 237 (3), 327-333 (1993).
- Kretzschmar, A., et al. Increased homologous integration frequency in Yarrowia lipolytica strains defective in non-homologous end-joining. Curr. Genet. 59 (1-2), 63-72 (2013).
- Lorenz, T. C. Polymerase Chain Reaction: Basic Protocol Plus Troubleshooting and Optimization Strategies. J. Vis. Exp. (63), e3998 (2012).
- Kobs, G. Cloning blunt-end DNA fragments into the pGEM-T Vector Systems. Promega Notes. 62, 15-18 (1997).
- Sanders, E. R. Aseptic laboratory techniques: plating methods. J. Vis. Exp. (63), e3064 (2012).
- Hegemann, J. H., Heick, S. B. Delete and repeat: a comprehensive toolkit for sequential gene knockout in the budding yeast Saccharomyces cerevisiae. Methods Mol. Biol. 765, 189-206 (2011).
- Yamane, T., Sakai, H., Nagahama, K., Ogawa, T., Matsuoka, M. Dissection of centromeric DNA from yeast Yarrowia lipolytica and identification of protein-binding site required for plasmid transmission. J. Biosci. Bioeng. 105 (6), 571-578 (2008).
- McGinnis, S., Madden, T. L. BLAST: at the core of a powerful and diverse set of sequence analysis tools. Nucleic Acids Res. 32 ((Web Server issue)), W20-W25 (2004).
- Madzak, C., Tréton, B., Blanchin-Roland, S. Strong hybrid promoters and integrative expression/secretion vectors for quasi-constitutive expression of heterologous proteins in the yeast Yarrowia lipolytica. J. Mol. Microbiol. Biotechnol. 2 (2), 207-216 (2000).
- Nicaud, J. M., Le Clainche, A., Le Dall, M. T., Wang, H., Gaillardin, C. Yarrowia lipolytica, a yeast model for the genetic studies of hydroxy fatty acids biotransformation into lactones. J. Mol. Catal. B-Enzym. 5 (1), 175-181 (1998).
