Genetic Engineering av en ukonvensjonell gjær for fornybar Biodrivstoff og biokjemiske Produksjon

Summary

We herein report methods on the molecular genetic manipulation of the Yarrowia lipolytica Po1g strain for improved gene deletion efficiency. The resulting engineered Y. lipolytica strains have potential applications in biofuel and biochemical production.

Abstract

Yarrowia lipolytica er en ikke-patogene, dimorfe og strengt aerobe gjær arter. På grunn av sin karakteristiske fysiologiske funksjoner og metabolske egenskaper, er denne ukonvensjonelle gjær ikke bare en god modell for studiet av den grunnleggende natur av sopp differensiering, men er også en lovende mikrobiell plattform for biokjemisk produksjon og forskjellige bioteknologiske anvendelser som krever omfattende genetiske manipulasjoner. Men, genetiske manipulasjoner av Y. lipolytica har vært begrenset på grunn av mangel på en effektiv og stabil genetisk transformasjon system samt svært høy forekomst av ikke-homolog rekombinasjon som kan hovedsakelig tilskrives KU70 genet. Her rapporterer vi en enkel og hurtig protokoll for effektiv genetisk transformasjon og for genet delesjon i Y. lipolytica Po1g. Først, en protokoll for effektiv omforming av eksogent DNA inn i Y. lipolytica Po1g ble etablert. Second, for å oppnå forbedret dobbel-crossover homolog rekombinasjon hastighet for ytterligere sletting av målgener ble KU70 genet slettet ved å transformere et avbrudd kassett bærer 1 kb homologi armer. Tredje, for å demonstrere den forbedrede genet sletting effektivitet etter sletting av KU70 genet, vi individuelt slettet 11 mål gener som koder alkohol dehydrogenase og alkoholoksidase bruke de samme prosedyrer på belastningen KU70 knockout-plattformen. Det ble observert at frekvensen av homolog rekombinasjon nøyaktig økt betraktelig, fra mindre enn 0,5% for sletting av KU70 genet i Po1g til 33% -71% for enkelt gen sletting av de 11 målgener i Po1g KU70 Δ. En replikative plasmid som bærer hygromycin B resistens markør og den Cre / loxP-systemet ble konstruert, og den seleksjonsmarkør-genet i gjær knockout-stammer ble til slutt fjernet ved ekspresjon av Cre rekombinase for å legge til rette for av flere runder med TARGEted genetiske manipulasjoner. De resulterende single-genet sletting mutanter har potensielle bruksområder i biobrensel og biokjemisk produksjon.

Introduction

I motsetning til Saccharomyces cerevisiae, Yarrowia lipolytica, en ukonvensjonell gjær, kan vokse i form av gjær eller mycel i respons på endringer i miljøforhold ^1,2. Således kan dette dimorf gjær benyttes som en god modell for studiet av sopp differensiering, morfogenese og taksonomi ^3,4,5. Det er generelt ansett som en trygg (GRAS) gjær arter, som er mye brukt til å produsere en rekke tilsetningsstoffer som for eksempel organiske syrer, polyalkoholer aroma forbindelser, emulgatorer og tensider ^6,7,8,9. Det er en obligat aerob og en velkjent oljeaktige gjær er i stand til å akkumulere naturlig lipider ved høye mengder, dvs. opp til 70% av celletørrvekt ^10. Det kan også benytte et bredt spekter av karbonkilder for vekst, inkludert forskjellige typer rester i avfalls ressurser som næringsstoffer ^11,12,13. Alle disse unike egenskapene gjør Y. lipolytica svært attraktive forulike bioteknologiske applikasjoner.

Selv om hele genomsekvens av Y. lipolytica har blitt publisert ^14,15, genetisk manipulering av denne ukonvensjonelle gjær er mer komplisert enn andre gjærarter. For det første transformasjon av denne gjærarter er mye mindre effektiv på grunn av fraværet av en stabil og effektiv genetiske transformasjonssystem ^16,17. For det andre er arbeidskrevende genomisk integrering av lineære ekspresjonskassetter som vanligvis anvendes for ekspresjon av gener av interesse som ikke naturlig episomale plasmid-systemet har blitt funnet i denne gjær ^18. Tredje, generering av genetiske knock-outs og knock-ins er begrenset fordi genet targeting effektivitet via nøyaktig homolog rekombinasjon i denne gjæren er lav og de fleste integrering hendelser oppstår gjennom ikke-homolog ende bli (NHEJ) ^19.

I denne studien rapporterer vi en optimalisert transformasjon protokoll for Y. lipolytica </em> Po1g-stamme, som er enkel, rask, effektiv og reproduserbar. For å øke frekvensen av homolog rekombinasjon nøyaktig, slettet vi den KU70-genet, som koder for et viktig enzym i reaksjonsveien NHEJ. Ved hjelp av optimalisert transformasjon protokollen og transformere en lineær knockout kassett som inneholder flankerer homologi regioner av 1 kb, den KU70 gen av Y. lipolytica Po1g ble slettet. Robustheten dette genet sletting metodikken ble deretter demonstrert ved å målrette alkohol dehydrogenase og alkohol oksidase gener i Po1g KU70 Δ belastning. Det ble observert at den KU70 stammen slettingen oppviste en betydelig høyere virkningsgrad av homolog rekombinasjon-formidlet gen-targeting enn den til villtype-Po1g belastning. I tillegg ble en replikativ Cre-ekspresjonsplasmid som bærer hygromycin B resistens markør konstruert for å utføre markør redning. Markøren redning forenkler flere runder med genet målretting i the fått genet sletting mutanter. Foruten genet sletting, kan vår protokoll for genetisk transformasjon og genet sletting beskrevet her brukes for å sette inn gener til bestemte loci, og å innføre stedsspesifikke mutasjoner inn i Y. lipolytica genom.

Protocol

1. generasjon Y. lipolytica KU70 Sletting Strain Byggingen av avbrudd kassett NB: Se tabell 1 for alle primerne anvendt i polymerase kjedereaksjon (PCR) amplifikasjoner. Design primere 20 for PCR amplifisere LEU2 ekspresjonskassetten (se tabell 1) fra en Y. lipolytica ekspresjonsvektor og innføre loxP-seter i 5'- og 3'-endene av den LEU2 kassetten med en lang forover primer (# 1, tabell 1…

Representative Results

Det lineariserte Y. lipolytica ekspresjonsvektor ble innsatt i pBR forankringsplattform i genomet av Y. lipolytica Po1g belastningen ved å utføre en enkelt crossover rekombinasjon 27. Ved hjelp av rask kjemisk transformasjon prosedyre etablert i denne studien, det lineariserte Y. lipolytica ekspresjonsvektor ble vellykket transformert inn i villtype-stamme Po1g ved en transformasjonseffektivitet på> 100 cfu / ug DNA. En knockout kassett flanker…

Discussion

Vårt mål for denne studien er å muliggjøre rask og effektiv generasjon av målrettede genet knockouts i Y. lipolytica Po1g belastning. Flere hensyn må tas opp for å oppnå dette. Først er en høy transformasjon effektivitet som kreves. Således, en effektiv og enkel kjemisk transformasjon protokoll for Y. lipolytica Po1g stamme ble beskrevet i denne studien. Bruken av PEG-4000 er en kritisk faktor for vellykket transformasjon av denne stammen. Det er ingen transformanter ble oppnådd fo…

Materials

Reagent/Material
Oligonucleotide primers	Integrated DNA Technologies		25 nmole  DNA oligos
Y. lipolytica strain Po1g	Yeastern Biotech		leucine auxotrophic derivative of the wild-type strain W29 (ATCC 20460)
Vector pYLEX1	Yeastern Biotech	FYY203-5MG	Y. lipolytica expression vector
E. coli TOP10	Invitrogen		For cloning and propagation of plasmids
pGEM-T vector	Promega	A3600	TA cloning vector
QIAprep Spin Miniprep Kit	Qiagen	27106	For plasmid isolation
Wizard SV Gel and PCR Clean-Up System	Promega	A9282	Extract DNA fragments from agarose gels and purify PCR products from an amplification reaction
The iProof high-fidelity DNA polymerase	Bio-Rad	172-5302	High-fidelity DNA polymerase
BamHI	New England Biolabs	R0136S	Restriction enzyme
BglII	New England Biolabs	R0144L	Restriction enzyme
KpnI	New England Biolabs	R0142S	Restriction enzyme
NdeI	New England Biolabs	R0111S	Restriction enzyme
NotI	New England Biolabs	R0189L	Restriction enzyme
PmlI	New England Biolabs	R0532S	Restriction enzyme
PstI	New England Biolabs	R0140S	Restriction enzyme
SacII	New England Biolabs	R0157S	Restriction enzyme
SalI	New England Biolabs	R0138S	Restriction enzyme
XhoI	New England Biolabs	R0146L	Restriction enzyme
T4 DNA ligase	New England Biolabs	M0202L
Taq DNA polymerase	Bio-Rad	M0267L
Ampicillin	Gibco-Life Technologies	11593-027	Antibiotics
Hygromycin B	PAA	P21-014	Antibiotics
GeneRuler 1 kb DNA ladder	Thermo Scientific	SM0312	1 kb DNA ladder
PEG4000	Sigma	95904-F
Tris	Promega	H5135
EDTA	Bio-Rad	161-0729
Salmon Sperm DNA	Invitrogen	15-632-011
Lithium Acetate	Sigma
Acetic acid	Sigma
Glass beads (425-600 µm)	Sigma	G8772
RNAse A	Thermo Scientific	EN0531
DNA Loading Dye	Thermo Scientific	R0611
Bacto Yeast Extract	BD	212750
Bacto Peptone	BD	211677
D-Glucose	1st Base	BIO-1101
YNB without amino acids	Sigma	Y0626
DO Supplement-Leu	Clontech	630414
Glycerol	Sigma	G5516
Difco LB Broth	BD	244620
Difco LB Agar	BD	244520
Bacto Agar	BD	214010
Name	Company	Catalog Number	Comments
Equipment
PCR machine	Biorad	T100 Thermal Cycler
Water bath	Memmert	WNB 14
Stationary/Shaking Incubator	Yihder	LM-570RD
Thermo-shaker	Allsheng	MS-100
Micro centrifuge	Eppendorf	5424R
Centrifuge	Eppendorf	5810R
Spectrophotometer	Eppendorf	BioPhotometer plus
Gel imager	GE	Amersham Imager 600