We herein report methods on the molecular genetic manipulation of the Yarrowia lipolytica Po1g strain for improved gene deletion efficiency. The resulting engineered Y. lipolytica strains have potential applications in biofuel and biochemical production.
Yarrowia lipolytica er en ikke-patogene, dimorfe og strengt aerobe gjær arter. På grunn av sin karakteristiske fysiologiske funksjoner og metabolske egenskaper, er denne ukonvensjonelle gjær ikke bare en god modell for studiet av den grunnleggende natur av sopp differensiering, men er også en lovende mikrobiell plattform for biokjemisk produksjon og forskjellige bioteknologiske anvendelser som krever omfattende genetiske manipulasjoner. Men, genetiske manipulasjoner av Y. lipolytica har vært begrenset på grunn av mangel på en effektiv og stabil genetisk transformasjon system samt svært høy forekomst av ikke-homolog rekombinasjon som kan hovedsakelig tilskrives KU70 genet. Her rapporterer vi en enkel og hurtig protokoll for effektiv genetisk transformasjon og for genet delesjon i Y. lipolytica Po1g. Først, en protokoll for effektiv omforming av eksogent DNA inn i Y. lipolytica Po1g ble etablert. Second, for å oppnå forbedret dobbel-crossover homolog rekombinasjon hastighet for ytterligere sletting av målgener ble KU70 genet slettet ved å transformere et avbrudd kassett bærer 1 kb homologi armer. Tredje, for å demonstrere den forbedrede genet sletting effektivitet etter sletting av KU70 genet, vi individuelt slettet 11 mål gener som koder alkohol dehydrogenase og alkoholoksidase bruke de samme prosedyrer på belastningen KU70 knockout-plattformen. Det ble observert at frekvensen av homolog rekombinasjon nøyaktig økt betraktelig, fra mindre enn 0,5% for sletting av KU70 genet i Po1g til 33% -71% for enkelt gen sletting av de 11 målgener i Po1g KU70 Δ. En replikative plasmid som bærer hygromycin B resistens markør og den Cre / loxP-systemet ble konstruert, og den seleksjonsmarkør-genet i gjær knockout-stammer ble til slutt fjernet ved ekspresjon av Cre rekombinase for å legge til rette for av flere runder med TARGEted genetiske manipulasjoner. De resulterende single-genet sletting mutanter har potensielle bruksområder i biobrensel og biokjemisk produksjon.
I motsetning til Saccharomyces cerevisiae, Yarrowia lipolytica, en ukonvensjonell gjær, kan vokse i form av gjær eller mycel i respons på endringer i miljøforhold 1,2. Således kan dette dimorf gjær benyttes som en god modell for studiet av sopp differensiering, morfogenese og taksonomi 3,4,5. Det er generelt ansett som en trygg (GRAS) gjær arter, som er mye brukt til å produsere en rekke tilsetningsstoffer som for eksempel organiske syrer, polyalkoholer aroma forbindelser, emulgatorer og tensider 6,7,8,9. Det er en obligat aerob og en velkjent oljeaktige gjær er i stand til å akkumulere naturlig lipider ved høye mengder, dvs. opp til 70% av celletørrvekt 10. Det kan også benytte et bredt spekter av karbonkilder for vekst, inkludert forskjellige typer rester i avfalls ressurser som næringsstoffer 11,12,13. Alle disse unike egenskapene gjør Y. lipolytica svært attraktive forulike bioteknologiske applikasjoner.
Selv om hele genomsekvens av Y. lipolytica har blitt publisert 14,15, genetisk manipulering av denne ukonvensjonelle gjær er mer komplisert enn andre gjærarter. For det første transformasjon av denne gjærarter er mye mindre effektiv på grunn av fraværet av en stabil og effektiv genetiske transformasjonssystem 16,17. For det andre er arbeidskrevende genomisk integrering av lineære ekspresjonskassetter som vanligvis anvendes for ekspresjon av gener av interesse som ikke naturlig episomale plasmid-systemet har blitt funnet i denne gjær 18. Tredje, generering av genetiske knock-outs og knock-ins er begrenset fordi genet targeting effektivitet via nøyaktig homolog rekombinasjon i denne gjæren er lav og de fleste integrering hendelser oppstår gjennom ikke-homolog ende bli (NHEJ) 19.
I denne studien rapporterer vi en optimalisert transformasjon protokoll for Y. lipolytica </em> Po1g-stamme, som er enkel, rask, effektiv og reproduserbar. For å øke frekvensen av homolog rekombinasjon nøyaktig, slettet vi den KU70-genet, som koder for et viktig enzym i reaksjonsveien NHEJ. Ved hjelp av optimalisert transformasjon protokollen og transformere en lineær knockout kassett som inneholder flankerer homologi regioner av 1 kb, den KU70 gen av Y. lipolytica Po1g ble slettet. Robustheten dette genet sletting metodikken ble deretter demonstrert ved å målrette alkohol dehydrogenase og alkohol oksidase gener i Po1g KU70 Δ belastning. Det ble observert at den KU70 stammen slettingen oppviste en betydelig høyere virkningsgrad av homolog rekombinasjon-formidlet gen-targeting enn den til villtype-Po1g belastning. I tillegg ble en replikativ Cre-ekspresjonsplasmid som bærer hygromycin B resistens markør konstruert for å utføre markør redning. Markøren redning forenkler flere runder med genet målretting i the fått genet sletting mutanter. Foruten genet sletting, kan vår protokoll for genetisk transformasjon og genet sletting beskrevet her brukes for å sette inn gener til bestemte loci, og å innføre stedsspesifikke mutasjoner inn i Y. lipolytica genom.
Vårt mål for denne studien er å muliggjøre rask og effektiv generasjon av målrettede genet knockouts i Y. lipolytica Po1g belastning. Flere hensyn må tas opp for å oppnå dette. Først er en høy transformasjon effektivitet som kreves. Således, en effektiv og enkel kjemisk transformasjon protokoll for Y. lipolytica Po1g stamme ble beskrevet i denne studien. Bruken av PEG-4000 er en kritisk faktor for vellykket transformasjon av denne stammen. Det er ingen transformanter ble oppnådd fo…
The authors have nothing to disclose.
Vi erkjenner takknemlig finansieringen støtte fra National Environment Agency of Singapore (ETRP 1.201.102), Konkurranse Research Program av National Research Foundation of Singapore (NRF-CRP5-2009-03), Direktoratet for Science, Technology and Research of Singapore ( 1324004108) Global FoU-prosjektet Program, Ministry of Knowledge Economy, republikken Korea (N0000677), Defense Threat Reduction Agency (DTRA, HDTRA1-13-1-0037) og Syntetisk biologi Initiative av National University of Singapore ( DPRT / 943/09/14).
Reagent/Material | |||
Oligonucleotide primers | Integrated DNA Technologies | 25 nmole DNA oligos | |
Y. lipolytica strain Po1g | Yeastern Biotech | leucine auxotrophic derivative of the wild-type strain W29 (ATCC 20460) | |
Vector pYLEX1 | Yeastern Biotech | FYY203-5MG | Y. lipolytica expression vector |
E. coli TOP10 | Invitrogen | For cloning and propagation of plasmids | |
pGEM-T vector | Promega | A3600 | TA cloning vector |
QIAprep Spin Miniprep Kit | Qiagen | 27106 | For plasmid isolation |
Wizard SV Gel and PCR Clean-Up System |
Promega | A9282 | Extract DNA fragments from agarose gels and purify PCR products from an amplification reaction |
The iProof high-fidelity DNA polymerase |
Bio-Rad | 172-5302 | High-fidelity DNA polymerase |
BamHI | New England Biolabs | R0136S | Restriction enzyme |
BglII | New England Biolabs | R0144L | Restriction enzyme |
KpnI | New England Biolabs | R0142S | Restriction enzyme |
NdeI | New England Biolabs | R0111S | Restriction enzyme |
NotI | New England Biolabs | R0189L | Restriction enzyme |
PmlI | New England Biolabs | R0532S | Restriction enzyme |
PstI | New England Biolabs | R0140S | Restriction enzyme |
SacII | New England Biolabs | R0157S | Restriction enzyme |
SalI | New England Biolabs | R0138S | Restriction enzyme |
XhoI | New England Biolabs | R0146L | Restriction enzyme |
T4 DNA ligase | New England Biolabs | M0202L | |
Taq DNA polymerase | Bio-Rad | M0267L | |
Ampicillin | Gibco-Life Technologies | 11593-027 | Antibiotics |
Hygromycin B | PAA | P21-014 | Antibiotics |
GeneRuler 1 kb DNA ladder | Thermo Scientific | SM0312 | 1 kb DNA ladder |
PEG4000 | Sigma | 95904-F | |
Tris | Promega | H5135 | |
EDTA | Bio-Rad | 161-0729 | |
Salmon Sperm DNA | Invitrogen | 15-632-011 | |
Lithium Acetate | Sigma | ||
Acetic acid | Sigma | ||
Glass beads (425-600 µm) | Sigma | G8772 | |
RNAse A | Thermo Scientific | EN0531 | |
DNA Loading Dye | Thermo Scientific | R0611 | |
Bacto Yeast Extract | BD | 212750 | |
Bacto Peptone | BD | 211677 | |
D-Glucose | 1st Base | BIO-1101 | |
YNB without amino acids | Sigma | Y0626 | |
DO Supplement-Leu | Clontech | 630414 | |
Glycerol | Sigma | G5516 | |
Difco LB Broth | BD | 244620 | |
Difco LB Agar | BD | 244520 | |
Bacto Agar | BD | 214010 | |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Equipment | |||
PCR machine | Biorad | T100 Thermal Cycler | |
Water bath | Memmert | WNB 14 | |
Stationary/Shaking Incubator | Yihder | LM-570RD | |
Thermo-shaker | Allsheng | MS-100 | |
Micro centrifuge | Eppendorf | 5424R | |
Centrifuge | Eppendorf | 5810R | |
Spectrophotometer | Eppendorf | BioPhotometer plus | |
Gel imager | GE | Amersham Imager 600 |