Conception de dispositifs microfluidiques pour étudier les réponses cellulaires Sous simple ou Coexistence chimique / électrique / Shear Stress Stimuli
Summary
Micro-fabricated devices integrated with fluidic components provide an in vitro platform for cell studies mimicking the in vivo micro-environment. We developed polymethylmethacrylate-based microfluidic chips for studying cellular responses under single or coexisting chemical/electrical/shear stress stimuli.
Abstract
Les dispositifs microfluidiques sont capables de créer un micro-environnement précis et contrôlable cellulaire du pH, température, concentration de sel, et d'autres stimuli physiques ou chimiques. Ils ont été couramment utilisés pour les études in vitro de cellules en fournissant in vivo comme un cadre. Surtout, comment les cellules réponse aux gradients chimiques, les champs électriques et les contraintes de cisaillement a attiré beaucoup d'intérêts étant donné que ces phénomènes sont importants dans la compréhension des propriétés et des fonctions cellulaires. Ces puces microfluidiques peuvent être constitués de substrats de verre, des plaquettes de silicium, les huiles polydiméthylsiloxanes (PDMS), les polymères polyméthacrylate de méthyle (PMMA), ou des substrats polyéthylènetéréphtalate (PET) substrats. Parmi ces matériaux, les substrats PMMA sont pas cher et peuvent être facilement traitées par ablation laser et l'écriture. Bien que quelques dispositifs microfluidiques ont été conçus et fabriqués pour générer multiple, coexistant stimuli chimiques et électriques, aucun d'entre eux a été considéréassez efficace dans la réduction des répétitions expérimentales, notamment à des fins de dépistage. Dans ce rapport, nous décrivons notre conception et la fabrication de deux puces microfluidiques à base de PMMA-pour étudier les réponses cellulaires, dans la production d'espèces réactives de l'oxygène et de la migration, sous chimiques / électriques / cisaillement stimuli de stress simples ou coexistant. La première puce génère cinq concentrations relatives de 0, 1/8, 1/2, 8/7 et 1 dans les zones de culture, conjointement avec un gradient de contrainte de cisaillement produite à l'intérieur de chacun de ces domaines. La seconde puce génère les mêmes concentrations relatives, mais avec cinq différentes forces de champ électrique créé dans chaque zone de culture. Ces dispositifs fournissent non seulement des cellules avec un micro-environnement contrôlable précise, mais aussi augmenter considérablement le débit expérimental.
Introduction
In vivo dans les cellules sont entourées par une variété de biomolécules , y compris la matrice extracellulaire (ECM), des glucides, des lipides et d' autres cellules. Ils fonctionnaliser en réagissant aux micro-environnement stimuli tels que les interactions avec l'ECM et les réponses aux gradients chimiques de divers facteurs de croissance. Traditionnellement, les études in vitro de cellules sont réalisées dans des boîtes de culture cellulaire dans lesquels la consommation de cellules et les réactifs est grande et les cellules se développent dans un statique (sans circulation) l' environnement. Récemment, des dispositifs micro-fabriqué avec des composants fluidiques intégrés ont fourni une plate-forme alternative pour les études sur les cellules d'une manière plus contrôlable. De tels dispositifs sont capables de créer un micro-environnement précis des stimuli physiques et chimiques, tout en minimisant la consommation des cellules et des réactifs. Ces puces microfluidiques peuvent être constitués de substrats de verre, des plaquettes de silicium, des polydiméthylsiloxanes (PDMS), les polymères de polyméthacrylate de méthyle (PMMA), des substrats ou polyethyleneterephtalate (PET) substrats 1-3. dispositifs à base de PDMS sont transparents, biocompatible et perméable aux gaz, les rendant aptes à la culture et les études cellulaire à long terme. PMMA et PET substrats doivent être traitées par ablation laser et l'écriture pas cher et facile.
Les dispositifs microfluidiques devraient fournir des cellules avec un micro-environnement stable et contrôlable, où les cellules sont soumises à des stimuli chimiques et physiques différentes. Par exemple, les puces microfluidiques sont utilisées pour étudier la chimiotaxie des cellules. Au lieu des méthodes traditionnelles qui emploient chambre de Boyden et capillaire 4,5 ces dispositifs fluidiques miniaturisés peuvent générer des gradients chimiques précis pour étudier le comportement des cellules 1,6,7. Un autre exemple est d'étudier la migration directionnelle de cellules dans des champs électriques (SFE), un phénomène nommé électrotaxie. Comportements Electrotactic de cellules ont été signalés à être liés à la régénération nerveuse 8, le développement embryonnaire 9,et la cicatrisation des plaies 10,11. Et de nombreuses études ont été réalisées pour étudier la électrotaxie de divers types de cellules , y compris les cellules cancéreuses 12,13, 14,15 lymphocytes, des cellules de leucémie 11, et les cellules souches 16. Classiquement, des boîtes de Pétri et les verres de couverture sont utilisés pour construire des chambres electrotactic pour générer 17 FE. Ces configurations simples posent des problèmes d'évaporation moyen et FE imprécis, mais ils peuvent être surmontés par des dispositifs microfluidiques de canaux fluidiques clos, bien définies 12,18,19.
Pour étudier systématiquement les réponses cellulaires sous, des stimuli chimiques et électriques contrôlables précis, il serait d'une grande utilité pour développer des dispositifs microfluidiques capables de fournir des cellules avec de multiples stimuli en même temps. Par exemple, Li et al. fait état d' un dispositif microfluidique à base de PDMS pour la création simple ou coexistant gradients chimiques et FE 20. Kao et al. developed une puce microfluidique similaire à moduler le chimiotactisme des cellules de cancer du poumon par EF 6. Par ailleurs, pour augmenter le débit, Hou et al. conçu et fabriqué une puce multicanal à double champ électrique à base de PMMA pour fournir des cellules avec 8 stimuli combinés différents, (concentrations 2 points forts EF x 4 chimiques) étant 21. Pour augmenter encore la partout et ajouter la contrainte de cisaillement stimulus, nous avons développé deux dispositifs microfluidiques à base de PMMA-pour étudier les réponses cellulaires sous chimiques unique ou coexistant / électriques / cisaillement stimuli de stress.
Rapporté par Lo et al. 22,23, ces appareils contiennent cinq canaux de culture cellulaire indépendants , soumis à continu fluidiques fluide, imitant le système circulatoire in vivo. Dans la première puce (la puce chimique contrainte de cisaillement ou de la puce CSS), cinq concentrations relatives de 0, 1/8, 1/2, 7/8 et 1 sont générés dans les régions de culture, et un gradient de contrainte de cisaillement est produced l'intérieur de chacune des cinq zones de culture. Dans la seconde puce (la puce chimique-champ électrique ou la puce CEF), à l'aide d'un seul ensemble d'électrodes et de 2 pompes à seringue, cinq forces de EF sont générés en plus de cinq concentrations chimiques différentes dans ces zones de culture. les calculs et les simulations numériques sont réalisées pour mieux concevoir et exploiter ces puces, et les cellules de cancer du poumon en culture à l'intérieur de ces appareils sont soumis à des stimuli simples ou coexistants pour observer leurs réactions par rapport à la production d'espèces réactives de l'oxygène (ROS), le taux de migration, et la direction de la migration. Ces puces sont mises en évidence pour être un gain de temps, à haut débit et des dispositifs fiables pour étudier comment les cellules répondent à divers stimuli micro-environnement.
Protocol
Representative Results
Discussion
puces à base de PMMA-sont fabriqués en utilisant l'ablation laser et l'écriture qui sont des méthodes moins coûteuses et plus faciles par rapport aux puces à base de PDMS qui nécessitent la lithographie douce plus compliquée. Après la conception d'une puce microfluidique, la fabrication et l'assemblage peut être fait en seulement 5 min. Il y a quelques étapes critiques que l'attention devrait être accordée à l'exécution de l'expérience. Le premier est la question "assembl…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was financially supported by the Ministry of Science and Technology of Taiwan under Contract No. MOST 104-2311-B-002-026 (K. Y. Lo), No. MOST 104-2112-M-030-002 (Y. S. Sun), and National Taiwan University Career Development Project (103R7888) (K. Y. Lo). The authors also thank the Center for Emerging Material and Advanced Devices, National Taiwan University, for the use of the cell culture room.
Materials
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | Gibco | 11965-092 | Cell culture medium |
| Trypsin | Gibco | 25300-054 | detach cell from the dish |
| Fetal bovine serum (FBS) | Gibco | 10082147 | Cell culture medium |
| 10-cm cell culture Petri dish | Nunc | 150350 | Cell culture |
| Bright-Line Hemacytometer | Sigma | Z359629 | Cell Counting Equipment |
| PMMA | Customized | Customized | Microfluidic chip |
| Adaptor | Customized | Customized | Microfluidic chip |
| 0.07/0.22 mm double-sided tape | 3M | 8018/9088 | Microfluidic chip |
| Low melting point agarose | Sigma | A9414 | Salt bridge |
| 2'-7'-dichlorodihydrofluoresce diacetate | Sigma | D6883 | Intracellular ROS measurement |
| Indium tin oxide (ITO) glass | Merck | 300739 | Heater |
| Proportional-integral-derivative controller | JETEC Electronics Co. | TTM-J4-R-AB | Temperature controller |
| Thermal coupler | TECPEL | TPK-02A | Temperature controller |
| CO2 laser scriber | Laser Tools & Technics Corp. | ILS2 | Microfluidic chip fabrication |
| Syringe pumps | New Era | NE-300 | Pumping medium and chemicals into the chip |
| Power supply | Major Science | MP-300V | Supplying direct currents |
| Inverted microscope | Olympus | CKX41 | Monitoring cell migration |
| Inverted fluorescent microscope | Nikon | TS-100 | Monitoring cell migartion and fluorescencent signals |
| DSLR camera | Canon | 60D | Recording bright-field images |
| CCD camera | Nikon | DS-Qi1 | Recording fluorescent images |
| super glue | 3M Scotch | 7004 | Attaching adaptors to PMMA substrates |
| AutoCAD | Autodesk Inc. | Designing microfluidic chips | |
| DMSO | Sigma | D8418 | Dissolving DCFDA |
| ImgeJ | National Institutes of Health | Quantifying fluorescent intensities and cell migration |
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